本发明属于药物合成领域，具体涉及一种聚乙二醇化生物素衍生物的制备方法。
背景技术：
聚乙二醇(polyethyleneglycol，peg)是由环氧乙烷与水或乙二醇逐步发生加成聚合而得到的一类分子量较低的水溶性聚醚。小分子量的低聚聚乙二醇为无色、无臭有吸湿性的粘稠液体，分子中既有醚链，又有羟基,故具有独特的溶解性能,能与水、醇混溶，微溶于醚。单分散长链聚乙二醇聚合度一定，分子量一定，结构一定，在医药、材料和工程等领域具有很重要的应用前景。例如，在药物制剂领域，聚乙二醇化的药物、多肽以及蛋白质等可以对药物的稳定性，免疫原性及药代动力学性质产生显著的影响。
生物素又称维生素h、辅酶r，是水溶性维生素，也属于维生素b族，b7。它是合成维生素c的必要物质，是脂肪和蛋白质正常代谢不可或缺的物质，是一种维持人体自然生长、发育和正常人体机能健康必要的营养素。生物素是20世纪30年代在研究酵母生长因子和根瘤菌的生长与呼吸促进因子时，从肝中发现的一种可以防治由于喂食生鸡蛋蛋白诱导的大鼠脱毛和皮肤损伤的因子。其在肝、肾、酵母、牛乳中含量较多，是生物体固定二氧化碳的重要因素。生物素容易同鸡蛋白中一种蛋白质结合，大量食用生蛋白可阻碍生物素的吸收导致生物素缺乏，如脱毛、体重减轻、皮炎等。生物素在脂肪合成、糖质新生等生化反应途径中扮演重要角色。
维生素h对于糖原的异生，脂肪酸的综合作用以及某些氨基酸的新陈代谢，都是一个关键的调控元件，并且能够通过帮助能量的产生对某些蛋白质的合成起到促进作用；同时可协助细胞生长、制造脂肪酸、代谢糖类、脂肪及蛋白质，且有助于维他命b群的利用；促进汗腺、神经组织，骨髓、男性性腺的健康；维护皮肤及毛发的正常运作和生长，减轻湿疹、皮炎症状；预防白发及脱发，有助于治疗秃顶；缓和肌肉疼痛；对忧郁、失眠确有一定助益；还参与维生素b12、叶酸、泛酸的代谢；促进尿素合成与排泄；提高人体的免疫功能。
一方面，将peg与生物素相连接，使得生物素更有益于人体吸收，延长有效期；另一方面，基于生物素为羧化酶的辅酶，参与体内脂肪代谢和其他羧化反应，肿瘤细胞的快速增长需要大量生物素，因而在细胞表面会过量表达生物素受体，生物素与生物素受体结合力强，而生物素受体在某些肿瘤细胞表面高度表达，远高于正常细胞中的水平，因而具有良好的肿瘤组织特异性。
基于上述，将靶向分子生物素与短链peg相结合，以扩大在生命健康领域及治疗肿瘤领域的应用，而现有技术中很少有文献报道聚乙二醇化生物素衍生物的制备方法及条件。
技术实现要素：
本发明将提供一种聚乙二醇化生物素衍生物及其制备方法，该制备方法peg-生物素的合成路线简单，并得了具有较高的收率和纯度聚乙二醇化生物素衍生物。
一种聚乙二醇化生物素衍生物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：1)双羟基聚乙二醇和金属碱溶于第一有机溶剂中，滴入丙烯酸叔丁酯，制得羟基聚乙二醇丙酸叔丁酯；2)将得到的羟基聚乙二醇丙酸叔丁酯和碱溶于第一有机溶剂中，滴加对甲苯磺酰氯进行磺酰化反应得到对甲苯磺酸酯聚乙二醇丙酸叔丁酯；3)将对甲苯磺酸酯聚乙二醇丙酸叔丁酯溶于第二有机溶剂中，加入氢氧化铵反应得到氨基聚乙二醇丙酸叔丁酯；4)将生物素溶于第三有机溶剂中，加入n-羟基琥珀酰亚胺，二环己基碳二亚胺，反应得到活化的生物素，生物素-n-琥珀酰亚胺基酯；5)将氨基聚乙二醇丙酸叔丁酯和生物素-n-琥珀酰亚胺基酯溶于第三有机溶剂，加入碱，反应得到生物素-聚乙二醇丙酸叔丁酯；6)将生物素-聚乙二醇丙酸叔丁酯溶于第三有机溶剂中，加入三氟乙酸，反应得到生物素聚乙二醇丙酸，所述生物素聚乙二醇丙酸的结构式为：
进一步地，所述第一有机溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷、二氧六环中的一种。
进一步地，所述第二有机溶剂为二氯甲烷、甲醇、乙醇中的一种。
进一步地，所述第三有机溶剂为二甲基甲酰胺、二氧六环、二氯甲烷中的一种。
进一步地，所述碱为三乙胺、氢氧化钠、吡啶中的一种。
进一步地，所述步骤1)中聚乙二醇、丙烯酸叔丁酯和金属碱的摩尔比为1：0.55～0.82：0.02～0.04。
进一步地，所述步骤1)中金属碱为钠、钾、锂中的一种。
进一步地，所述步骤2)中的磺酰化反应是于温度为20℃～40℃，反应时间为10～15h的条件下进行的。
进一步地，所述步骤3)中由对甲苯磺酸酯聚乙二醇丙酸叔丁酯制得氨基聚乙二醇丙酸叔丁酯的反应过程是于温度为20～50℃，时间为24～48h的条件下进行的。
本发明中，以聚乙二醇和生物素为原料，经过6步反应，将靶向分子生物素与短链peg相结合，得到最终纯品，具有制备方法简单，原料简单易得，纯化简单等有益效果。
具体实施步骤
一种聚乙二醇化生物素衍生物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：1)peg和金属碱溶于第一有机溶剂中，滴入丙烯酸叔丁酯，制得羟基聚乙二醇丙酸叔丁酯(oh-peg-tbu)；其中聚乙二醇、丙烯酸叔丁酯和金属碱的摩尔比为1：0.55～0.82：0.02～0.04；所述金属碱为钠、钾、锂中的一种。2)将得到的羟基聚乙二醇丙酸叔丁酯和碱溶于第一有机溶剂中，滴加对甲苯磺酰氯于温度为20℃～40℃，反应时间为10～15h的条件下进行磺酰化反应得到对甲苯磺酸酯聚乙二醇丙酸叔丁酯(toso-peg-tbu)；3)将对甲苯磺酸酯聚乙二醇丙酸叔丁酯(toso-peg-tbu)溶于第二有机溶剂中，加入氢氧化铵于温度为20～50℃，时间为24～48h的条件下反应得到氨基聚乙二醇丙酸叔丁酯(nh2-peg-tbu)；4)将生物素溶于第三有机溶剂中，加入n-羟基琥珀酰亚胺，二环己基碳二亚胺，反应得到活化的生物素，生物素-n-琥珀酰亚胺基酯(biotin-nhs)；5)将氨基聚乙二醇丙酸叔丁酯(nh2-peg-tbu)和生物素-n-琥珀酰亚胺基酯(biotin-nhs)溶于第三有机溶剂，加入碱，反应得到生物素-聚乙二醇丙酸叔丁酯(biotin-peg-tbu)；6)将biotin-peg-tbu溶于第三有机溶剂中，加入三氟乙酸，反应得到生物素聚乙二醇丙酸(biotin-peg-cooh)，所述生物素聚乙二醇丙酸的结构式为：
具体的制备路线如下：
,其中n为1-20的整数。
实施例1
(1)将100g三甘醇加入至400ml四氢呋喃中，称取0.36g碎的金属钠加入上述溶液中，并室温搅拌1h。称取50g丙烯酸叔丁酯滴加到上述反应液中，室温搅拌12h。tlc显示反应结束，加20ml水淬灭反应，旋除溶剂四氢呋喃，再加入300ml水，然后用400ml二氯甲烷萃取3次。无水硫酸钠干燥二氯甲烷相，旋干，得到约100g粗产物(ho-peg3-tbu)；
(2)将步骤(1)得到的100g粗产物，38g三乙胺加入到400ml二氯甲烷中，搅拌，称取55g对甲苯磺酰氯溶于150ml二氯甲烷，在冰水浴条件下滴加至反应体系中，滴毕，30℃反应12h。tlc显示反应结束，加300ml水洗，分液，无水硫酸钠干燥有机相，旋干，得到约150g磺酰化的粗产物(toso-peg3-tbu)；
(3)将步骤(2)得到的150g磺酰化的粗产物加入到200ml二氯甲烷中，再加入100ml氢氧化铵，20g四丁基溴化铵，升温到50℃，搅拌24h。反应结束，旋干，分别用3m盐酸和氢氧化钠溶液处理，再用二氯甲烷300ml萃取3次，无水硫酸钠干燥，旋干，得到22g氨基端的产物(nh2-peg3-tbu)。核磁数据如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：3.702(t，j＝6.4hz，2h)；3.652～3.615(m，10h)；3.330(t，j＝4.8hz，2h)；2.853(t，j＝6.8hz，2h)；1.974(s，2h)；1.442(s，9h)；
(4)将50g生物素和24gnhs溶于400ml二甲基甲酰胺中，在冰浴下，分批缓慢加入46g二环己基碳二亚胺。升温至50℃，搅拌10h。反应结束，冷却至室温，反应液缓慢倒入3l饱和食盐水中，析出白色固体，抽滤，滤饼用甲醇洗2次，干燥后得到40g产品(biotin-nhs)。核磁数据如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.499(s，1h)；6.429(s，1h)；4.350(t，j＝6.4hz，1h)；4.189(t，j＝4.8hz，1h)；3.156～3.109(m，1h)；2.880(t，j＝4.8hz，1h)；2.720(t，j＝7.2hz，2h)；2.621(d，j＝12.8hz，1h)；2.531(s，1h)；1.707～1.434(m，6h)；
(5)将23gbiotin-nhs和22gnh2-peg3-tbu溶于250ml二甲基甲酰胺中，加入8.8g三乙胺，并室温搅拌12h。反应结束，反应液缓慢倒入1l饱和食盐水中，500ml二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，旋干，粗产品用硅胶柱层析分离，得到27g产品，白色固体(biotin-peg3-tbu)。核磁数据如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.953(s，1h)；6.668(s，1h)；4.546(t，j＝6.4hz，1h)；4.354(t，j＝4.8hz，1h)；3.761(t，j＝6.0hz，2h)；3.629～3.435(m，12h)；3.189(t，j＝4.8hz，1h)；2.946(t，j＝4.8hz，2h)；2.780(d，j＝12.8hz，1h)；2.547(t，j＝5.2hz，2h)；2.282(t，j＝7.2hz，2h)；1.805～1.661(m，4h)；1.440(s，11h)；
(6)将27gbiotin-peg3-tbu溶于300ml二氯甲烷中，加入60ml三氟乙酸，并室温搅拌5h。反应结束，用饱和碳酸钠调ph为中性，再用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，旋干，粗产品用硅胶柱层析分离，得到16g产品，白色固体(biotin-peg3-cooh)。核磁数据如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：7.870(s，1h)；6.465(s，1h)；6.402(s，1h)；4.346(t，j＝6.4hz，1h)；4.187(t，j＝4.8hz，1h)；3.651(t，j＝6.0hz，2h)；3.607～3.396(m，12h)；3.358(t，j＝4.8hz，1h)；3.180(t，j＝4.8hz，2h)；2.868(d，j＝12.8hz，1h)；2.616(t，j＝5.2hz，2h)；2.108(t，j＝7.2hz，2h)；1.661～1.271(m，6h)。
实施例2
(1)将100g六甘醇加入至400ml二氧六环中，称取0.16g碎的金属钾加入上述溶液中，并室温搅拌1h。称取25g丙烯酸叔丁酯滴加到上述反应液中，室温搅拌12h。tlc显示反应结束，加20ml水淬灭反应，旋除溶剂二氧六环，再加入300ml水，然后用400ml二氯甲烷萃取3次。无水硫酸钠干燥二氯甲烷相，旋干，得到约90g粗产物(ho-peg6-tbu)；
(2)将步骤(1)得到的90g粗产物，19g吡啶加入到400ml二氧六环中，搅拌，称取25g对甲苯磺酰氯溶于100ml二氧六环，在冰水浴条件下滴加至反应体系中，滴毕，20℃反应15h。tlc显示反应结束，加300ml水洗，dcm萃取，分液，无水硫酸钠干燥有机相，旋干，得到约120g磺酰化的粗产物(toso-peg6-tbu)；
(3)将步骤(2)得到的120g磺酰化的粗产物加入到200ml甲醇中，再加入100ml氢氧化铵，20g四丁基溴化铵，升温到35℃，搅拌36h。反应结束，旋干，分别用3m盐酸和氢氧化钠溶液处理，再用二氯甲烷300ml萃取3次，无水硫酸钠干燥，旋干，得到40g氨基端的产物(nh2-peg6-tbu)。核磁数据如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：3.712(t，j＝6.4hz，2h)；3.662～3.610(m，22h)；3.320(t，j＝4.8hz，2h)；2.833(t，j＝6.8hz，2h)；1.955(s，2h)；1.440(s，9h)；
(4)将50g生物素和24gnhs溶于400ml二甲基甲酰胺中，在冰浴下，分批缓慢加入46g二环己基碳二亚胺。升温至50℃，搅拌10h。反应结束，冷却至室温，反应液缓慢倒入3l饱和食盐水中，析出白色固体，抽滤，滤饼用甲醇洗2次，干燥后得到40g产品，biotin-nhs。核磁数据如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.499(s，1h)；6.429(s，1h)；4.350(t，j＝6.4hz，1h)；4.189(t，j＝4.8hz，1h)；3.156～3.109(m，1h)；2.880(t，j＝4.8hz，1h)；2.720(t，j＝7.2hz，2h)；2.621(d，j＝12.8hz，1h)；2.531(s，1h)；1.707～1.434(m，6h)；
(5)将12gbiotin-nhs和20gnh2-peg6-tbu溶于250ml二甲基甲酰胺中，加入4.5g三乙胺，并室温搅拌12h。反应结束，反应液缓慢倒入1l饱和食盐水中，500ml二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，旋干，粗产品用硅胶柱层析分离，得到21g产品，白色固体(biotin-peg6-tbu)。核磁数据如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.951(s，1h)；6.663(s，1h)；4.536(t，j＝6.4hz，1h)；4.332(t，j＝4.8hz，1h)；3.721(t，j＝6.0hz，2h)；3.609～3.431(m，24h)；3.180(t，j＝4.8hz，1h)；2.926(t，j＝4.8hz，2h)；2.763(d，j＝12.8hz，1h)；2.527(t，j＝5.2hz，2h)；2.262(t，j＝7.2hz，2h)；1.790～1.641(m，4h)；1.441(s，11h)；
(6)将21gbiotin-peg6-tbu溶于300ml二氯甲烷中，加入60ml三氟乙酸，并室温搅拌5h。反应结束，用饱和碳酸钠调ph为中性，再用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，旋干，粗产品用硅胶柱层析分离，得到17g产品，白色固体(biotin-peg6-cooh)。核磁数据如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：7.880(s，1h)；6.455(s，1h)；6.395(s，1h)；4.336(t，j＝6.4hz，1h)；4.180(t，j＝4.8hz，1h)；3.641(t，j＝6.0hz，2h)；3.600～3.390(m，24h)；3.348(t，j＝4.8hz，1h)；3.178(t，j＝4.8hz，2h)；2.860(d，j＝12.8hz，1h)；2.607(t，j＝5.2hz，2h)；2.101(t，j＝7.2hz，2h)；1.651～1.269(m，6h)。
实施例3
(1)将10g十二甘醇加入至100ml二氯甲烷中，称取13mg碎的金属钠加入上述溶液中，并室温搅拌1h。称取1.9g丙烯酸叔丁酯滴加到上述反应液中，室温搅拌12h。tlc显示反应结束，加20ml水淬灭反应，旋除溶剂二氯甲烷，再加入100ml水，然后用200ml二氯甲烷萃取3次。无水硫酸钠干燥二氯甲烷相，旋干，得到约9g粗产物(ho-peg12-tbu)；
(2)将步骤(1)得到的9g粗产物，2g氢氧化钠加入到100ml四氢呋喃中，搅拌，称取3.7g对甲苯磺酰氯溶于20ml四氢呋喃，在冰水浴条件下滴加至反应体系中，滴毕，40℃反应10h。tlc显示反应结束，加100ml水洗，分液，无水硫酸钠干燥有机相，旋干，得到约12g磺酰化的粗产物(toso-peg12-tbu)；
(3)将步骤(2)得到的12g磺酰化的粗产物加入到50ml乙醇中，再加入100ml氢氧化铵，2g四丁基溴化铵，升温到20℃，搅拌48h。反应结束，旋干，分别用3m盐酸和氢氧化钠溶液处理，再用二氯甲烷200ml萃取3次，无水硫酸钠干燥，旋干，得到5g氨基端的产物(nh2-peg12-tbu)。核磁数据如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：3.652(t，j＝6.4hz，2h)；3.612～3.555(m，46h)；3.301(t，j＝4.8hz，2h)；2.783(t，j＝6.8hz，2h)；1.915(s，2h)；1.422(s，9h)；
(4)将50g生物素和24gnhs溶于400ml二甲基甲酰胺中，在冰浴下，分批缓慢加入46g二环己基碳二亚胺。升温至50℃，搅拌10h。反应结束，冷却至室温，反应液缓慢倒入3l饱和食盐水中，析出白色固体，抽滤，滤饼用甲醇洗2次，干燥后得到40g产品，biotin-nhs。核磁数据如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.499(s，1h)；6.429(s，1h)；4.350(t，j＝6.4hz，1h)；4.189(t，j＝4.8hz，1h)；3.156～3.109(m，1h)；2.880(t，j＝4.8hz，1h)；2.720(t，j＝7.2hz，2h)；2.621(d，j＝12.8hz，1h)；2.531(s，1h)；1.707～1.434(m，6h)；
(5)将1.5gbiotin-nhs和3gnh2-peg12-tbu溶于30ml二甲基甲酰胺中，加入0.7g三乙胺，并室温搅拌12h。反应结束，反应液缓慢倒入200ml饱和食盐水中，100ml二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，旋干，粗产品用硅胶柱层析分离，得到2.5g产品，白色固体(biotin-peg12-tbu)。核磁数据如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.961(s，1h)；6.653(s，1h)；4.516(t，j＝6.4hz，1h)；4.325(t，j＝4.8hz，1h)；3.710(t，j＝6.0hz，2h)；3.619～3.423(m，48h)；3.170(t，j＝4.8hz，1h)；2.915(t，j＝4.8hz，2h)；2.749(d，j＝12.8hz，1h)；2.518(t，j＝5.2hz，2h)；2.260(t，j＝7.2hz，2h)；1.788～1.638(m，4h)；1.445(s，11h)；
(6)将2.5gbiotin-peg12-tbu溶于50ml二氯甲烷中，加入10ml三氟乙酸，并室温搅拌5h。反应结束，用饱和碳酸钠调ph为中性，再二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，旋干，粗产品用硅胶柱层析分离，得到1.5g产品，白色固体(biotin-peg12-cooh)。核磁数据如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：7.860(s，1h)；6.450(s，1h)；6.390(s，1h)；4.322(t，j＝6.4hz，1h)；4.169(t，j＝4.8hz，1h)；3.634(t，j＝6.0hz，2h)；3.589～3.376(m，48h)；3.338(t，j＝4.8hz，1h)；3.170(t，j＝4.8hz，2h)；2.851(d，j＝12.8hz，1h)；2.601(t，j＝5.2hz，2h)；2.105(t，j＝7.2hz，2h)；1.641～1.260(m，6h)。
实施例4
(1)将10g十八甘醇加入至100ml四氢呋喃中，称取11.4mg碎的金属钠加入上述溶液中，并室温搅拌1h。称取1.3g丙烯酸叔丁酯滴加到上述反应液中，室温搅拌12h。tlc显示反应结束，加20ml水淬灭反应，旋除溶剂四氢呋喃，再加入300ml水，然后用400ml二氯甲烷萃取3次。无水硫酸钠干燥二氯甲烷相，旋干，得到约10g粗产物(ho-peg18-tbu)；
(2)将步骤(1)得到的10g粗产物，1.5g三乙胺加入到100ml二氯甲烷中，搅拌，称取2.5g对甲苯磺酰氯溶于10ml二氯甲烷，在冰水浴条件下滴加至反应体系中，滴毕，30℃反应12h。tlc显示反应结束，加100ml水洗，分液，无水硫酸钠干燥有机相，旋干，得到约11g磺酰化的粗产物(toso-peg18-tbu)；
(3)将步骤(2)得到的11g磺酰化的粗产物加入到150ml二氯甲烷中，再加入50ml氢氧化铵，2g四丁基溴化铵，升温到50℃，搅拌24h。反应结束，旋干，分别用3m盐酸和氢氧化钠溶液处理，再用二氯甲烷200ml萃取3次，无水硫酸钠干燥，旋干，得到7g氨基端的产物(nh2-peg18-tbu)。核磁数据如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：3.702(t，j＝6.4hz，2h)；3.652～3.615(m，70h)；3.330(t，j＝4.8hz，2h)；2.853(t，j＝6.8hz，2h)；1.974(s，2h)；1.442(s，9h)；
(4)将50g生物素和24gnhs溶于400ml二甲基甲酰胺中，在冰浴下，分批缓慢加入46gdcc。升温至50℃，搅拌10h。反应结束，冷却至室温，反应液缓慢倒入3l饱和食盐水中，析出白色固体，抽滤，滤饼用甲醇洗2次，干燥后得到40g产品(biotin-nhs)。核磁数据如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.499(s，1h)；6.429(s，1h)；4.350(t，j＝6.4hz，1h)；4.189(t，j＝4.8hz，1h)；3.156～3.109(m，1h)；2.880(t，j＝4.8hz，1h)；2.720(t，j＝7.2hz，2h)；2.621(d，j＝12.8hz，1h)；2.531(s，1h)；1.707～1.434(m，6h)；
(5)将23gbiotin-nhs和7gnh2-peg18-tbu溶于250ml二甲基甲酰胺中，加入8.8g三乙胺，并室温搅拌12h。反应结束，反应液缓慢倒入1l饱和食盐水中，500ml二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，旋干，粗产品用硅胶柱层析分离，得到20g产品，白色固体(biotin-peg3-tbu)。核磁数据如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.953(s，1h)；6.668(s，1h)；4.546(t，j＝6.4hz，1h)；4.354(t，j＝4.8hz，1h)；3.761(t，j＝6.0hz，2h)；3.629～3.435(m，72h)；3.189(t，j＝4.8hz，1h)；2.946(t，j＝4.8hz，2h)；2.780(d，j＝12.8hz，1h)；2.547(t，j＝5.2hz，2h)；2.282(t，j＝7.2hz，2h)；1.805～1.661(m，4h)；1.440(s，11h)；
(6)将20gbiotin-peg18-tbu溶于300ml二氯甲烷中，加入60ml三氟乙酸，并室温搅拌5h。反应结束，用饱和碳酸钠调ph为中性，再用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，旋干，粗产品用硅胶柱层析分离，得到16g产品，白色固体(biotin-peg18-cooh)。核磁数据如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：7.870(s，1h)；6.465(s，1h)；6.402(s，1h)；4.346(t，j＝6.4hz，1h)；4.187(t，j＝4.8hz，1h)；3.651(t，j＝6.0hz，2h)；3.607～3.396(m，72h)；3.358(t，j＝4.8hz，1h)；3.180(t，j＝4.8hz，2h)；2.868(d，j＝12.8hz，1h)；2.616(t，j＝5.2hz，2h)；2.108(t，j＝7.2hz，2h)；1.661～1.271(m，6h)。
实施例5
(1)将10g二十四甘醇加入至100ml四氢呋喃中，称取2mg碎的金属锂加入上述溶液中，并室温搅拌1h。称取0.8g丙烯酸叔丁酯滴加到上述反应液中，室温搅拌12h。tlc显示反应结束，加20ml水淬灭反应，旋除溶剂二氯甲烷，再加入100ml水，然后用200ml二氯甲烷萃取3次。无水硫酸钠干燥二氯甲烷相，旋干，得到约9g粗产物(ho-peg24-tbu)；
(2)将步骤(1)得到的9g粗产物，2g三乙胺加入到100ml二氯甲烷中，搅拌，称取1.9g对甲苯磺酰氯溶于20ml二氯甲烷，在冰水浴条件下滴加至反应体系中，滴毕，40℃反应10h。tlc显示反应结束，加100ml水洗，分液，无水硫酸钠干燥有机相，旋干，得到约10g磺酰化的粗产物(toso-peg24-tbu)；
(3)将步骤(2)得到的10g磺酰化的粗产物加入到50ml甲醇中，再加入50ml氢氧化铵，2g四丁基溴化铵，升温到20℃，搅拌48h。反应结束，旋干，分别用3m盐酸和氢氧化钠溶液处理，再用二氯甲烷200ml萃取3次，无水硫酸钠干燥，旋干，得到5g氨基端的产物(nh2-peg24-tbu)。核磁数据如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：3.652(t，j＝6.4hz，2h)；3.612～3.555(m，94h)；3.301(t，j＝4.8hz，2h)；2.783(t，j＝6.8hz，2h)；1.915(s，2h)；1.422(s，9h)；
(4)将50g生物素和24gnhs溶于400ml二甲基甲酰胺中，在冰浴下，分批缓慢加入46g二环己基碳二亚胺。升温至50℃，搅拌10h。反应结束，冷却至室温，反应液缓慢倒入3l饱和食盐水中，析出白色固体，抽滤，滤饼用甲醇洗2次，干燥后得到40g产品，biotin-nhs。核磁数据如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.499(s，1h)；6.429(s，1h)；4.350(t，j＝6.4hz，1h)；4.189(t，j＝4.8hz，1h)；3.156～3.109(m，1h)；2.880(t，j＝4.8hz，1h)；2.720(t，j＝7.2hz，2h)；2.621(d，j＝12.8hz，1h)；2.531(s，1h)；1.707～1.434(m，6h)；
(5)将1.5gbiotin-nhs和5gnh2-peg24-tbu溶于30ml二甲基甲酰胺中，加入0.7g三乙胺，并室温搅拌12h。反应结束，反应液缓慢倒入200ml饱和食盐水中，100ml二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，旋干，粗产品用硅胶柱层析分离，得到5g产品，白色固体(biotin-peg24-tbu)。核磁数据如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：6.961(s，1h)；6.653(s，1h)；4.516(t，j＝6.4hz，1h)；4.325(t，j＝4.8hz，1h)；3.710(t，j＝6.0hz，2h)；3.619～3.423(m，96h)；3.170(t，j＝4.8hz，1h)；2.915(t，j＝4.8hz，2h)；2.749(d，j＝12.8hz，1h)；2.518(t，j＝5.2hz，2h)；2.260(t，j＝7.2hz，2h)；1.788～1.638(m，4h)；1.445(s，11h)；
(6)将5gbiotin-peg24-tbu溶于50ml二氧六环中，加入10ml三氟乙酸，并室温搅拌5h。反应结束，用饱和碳酸钠调ph为中性，再二氧六环萃取，无水硫酸钠干燥，旋干，粗产品用硅胶柱层析分离，得到4g产品，白色固体(biotin-peg24-cooh)。核磁数据如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)：δ：7.860(s，1h)；6.450(s，1h)；6.390(s，1h)；4.322(t，j＝6.4hz，1h)；4.169(t，j＝4.8hz，1h)；3.634(t，j＝6.0hz，2h)；3.589～3.376(m，96h)；3.338(t，j＝4.8hz，1h)；3.170(t，j＝4.8hz，2h)；2.851(d，j＝12.8hz，1h)；2.601(t，j＝5.2hz，2h)；2.105(t，j＝7.2hz，2h)；1.641～1.260(m，6h)。