一种强化表达Streptomycessp.FA1来源木聚糖酶的毕氏酵母重组菌的利记博彩app

本发明涉及一种强化表达streptomycessp.fa1来源木聚糖酶的毕氏酵母重组菌，属于基因工程领域。

背景技术：

木聚糖酶属于糖苷水解酶[ec3.2.1.x]，根据作用位点的不同，这类酶可分为两种：一类是作用于木聚糖的主链骨架，主要有内切β-1,4-d-木聚糖酶和β-木糖苷酶，前者作用于木聚糖中间β-1,4-d-糖苷键，后者则是作用于低聚木糖的末端分解成木糖单糖，在这两种酶的共同参与下，实现木聚糖的降解。第二类是作用于作用于支链取代基的酶，包括α-l-呋喃阿拉伯糖苷酶[ec3.2.1.55]、α-d-葡萄糖醛酸酶[ec3.2.1.139]、乙酰木聚糖酯酶[ec3.2.1.72]、p-香豆酸酯酶[ec3.1.1]等。

木聚糖酶分布广泛，主要来自自然界中一些真菌、细菌、一些无脊椎的动物体内以及植物组织等，既可以通过动植物体内提取，也可以通过微生物发酵获木聚糖酶。人们研究比较多的是微生物产木聚糖酶，已经报道的产木聚糖酶菌株有各种霉菌和链霉菌以及芽孢杆菌等。木聚糖酶种类繁多组成各异，性质上也有所不同。

木聚糖酶能应用在多个领域中。在食品领域可以用于面制品烘焙，能够改善面制品的品质；另外木聚糖可用于制备低聚木糖。在饲料工业木聚糖酶和其他半纤维素酶一起添加在饲料中利于增加饲料营养分解。在制浆和造纸工业领域，木聚糖酶可作为预漂白剂处理纸浆，从而降低纸浆漂白过程中化学试剂使用量，减少对环境的污染。在纺织工业麻类植物的纤维素含量丰富，是纺织行业中纤维原材料，但是麻类植物中含有半纤维素、木质素、果胶等杂质不利于纺织，木聚糖酶可以进行脱胶以去除这些胶质，减少化学品对环境的污染。迄今为止，国内外已报道了400多种木聚糖酶基因，大多数木聚糖酶在野生菌中表达量仅在10-20iu·ml-1。为了进一步推动木聚糖酶在工业生产中的应用，利用分子生物学方法将木聚糖酶基因进行异源表达以提高木聚糖酶的表达水平，是目前普遍采用的木聚糖酶制备方式。

毕氏酵母表达系统是近年发展起来的应用广泛的真核表达系统。毕氏酵母菌属于单细胞微生物，具有生长力旺盛、营养条件简单、发酵技术成熟、ph适应范围较宽、不产有毒物质等优点，至今已有数百种的外源蛋白利用该表达系统表达成功。用于外源基因表达的启动子主要有乙醇氧化酶(aox)启动子和3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子(gap)。aox是一种强启动子，以甲醇为诱导剂能严格控制外源蛋白的诱导表达。gap启动子则属于组成型启动子，在菌体生长过程中都能启动表达。外源基因的表达方式有两种，分别是整合到基因组中表达和构建游离的重组质粒进行表达。整合型表达中通过将外源基因整合到微生物基因组中从而使菌株具有遗传稳定的特点。基于质粒高拷贝数通过构建游离表达质粒进行表达可获得多拷贝外源基因表达菌株，从而显著提高表达量。目前在毕氏酵母表达系统中均是构建整合型重组菌株进行外源基因重组表达，尚未见到采用游离型表达质粒来进行表达。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供了一种稳定的、可以大量分泌木聚糖酶的游离表达型毕氏酵母重组菌及其构建方法，工业应用前景广阔。

本发明的第一个目的是提供一种表达木聚糖酶的毕氏酵母重组菌，所述毕氏酵母重组菌是将木聚糖酶基因连接到含有自主复制序列的游离表达载体上，然后转化至已整合表达木聚糖酶基因的毕氏酵母中，得到毕氏酵母重组菌。

在本发明的一种实施方式中，所述木聚糖酶基因氨基酸序列如seqidno:1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述自主复制序列的核苷酸序列如seqidno:2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述游离表达载体为通过将核苷酸序列如seqidno:2的pars复制子连接到pgapzαa质粒上得到pgapzαa-pars游离表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述已整合表达木聚糖酶基因的毕氏酵母为毕氏酵母km71/ppic9k-xyna(axylanasefromstreptomycessp.fa1:heterologousexpression,characterization,anditsapplicationinchinesesteamedbread，yangxu，journalofindustrialmicrobiology&biotechnology，may2016，volume43，issue5，pp663–670)

本发明第二个目的是提供一种所述毕氏酵母重组菌的构建方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获得氨基酸序列如seqidno:1所示的木聚糖酶基因；

(2)获得序列如seqidno:2所示的自主复制序列pars基因；

(3)将步骤(2)所得pars基因与质粒pgapzαa相连，得到表达载体pgapzαa-pars；

(4)将步骤(1)中的木聚糖酶基因与步骤(3)中的表达载体pgapzαa-pars相连，得到重组载体pgapzαa-pars-xyna；

(5)将重组载体pgapzαa-pars-xyna转化到已整合表达木聚糖酶基因的毕氏酵母中，得到所述毕氏酵母重组菌。

本发明的第三个目的是提供所述的毕氏酵母重组菌生产木聚糖酶的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)以权利要求1所述毕氏酵母重组菌为生产菌株，活化后，30℃、200rpm条件下培养24h，得一级种子发酵液；

(2)以2.5％接种量接种一级种子发酵液至种子培养基中，30℃、200rpm条件下培养24h，得二级种子发酵液；

(3)以10％的接种量将二级种子发酵液接种至发酵培养基中30℃、200rpm进行发酵；

(4)待do值迅速上升时，进行补料，od600＝100时停止补料，饥饿至第二次出现do值迅速上升时继续补料。

在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基为ypd培养基；所述发酵培养基为bsm培养基；其中bsm培养基包括如下成分：85％磷酸26.7ml/l，caso40.93g/l，k2so418.2g/l，mgso4·7h2o14.9g/l，koh4.13g/l，甘油40.0g/l，ptm14.35ml/l，上述成分均溶于水中形成所述bsm培养基。

在本发明的一种实施方式中，所述方法中补料配方为100％甲醇、1.25％ptm1；甲醇和ptm1溶于水中形成所述补料。

本发明的第四个目的是提供所述毕氏酵母重组菌在饲料、食品、纺织或化工领域的应用。

本发明的有益效果

本发明在原有基因组已整合aox启动子启动表达xyna基因的菌株中进一步导入含有gap启动子启动表达xyna基因的游离表达质粒，从而强化xyna在毕氏酵母中的分泌表达。和单一整合性表达菌株相比，进一步导入游离型重组表达质粒后木聚糖酶产量显著提高了53％，重组酶的比活力提高了90％。本发明为利用毕氏酵母高效分泌表达外源蛋白提供了一种新方法。

附图说明

图1重组质粒pgapzαa-pars-xyna的构建过程图；

图2pgapzαa-pars-xyna重组质粒的双酶切验证图；

图3km71/ppic9k-xyna/pgapzαa-pars-xyna重组菌3.6l发酵sds-page电泳图；

图4km71/ppic9k-xyna/pgapzαa-pars-xyna重组菌3.6l发酵酶活对比图。

具体实施方式

将0.5g的木聚糖溶于100ml，50mmol/l，ph5.5的磷酸缓冲液充分混匀，取1ml底物，在55℃预热10min，加入1ml的酶液，反应10min后加入3mldns，煮沸10min迅速冷却，加蒸馏水定容至20ml，540nm下测吸光度(以灭活的酶液为催化剂同样操作作为空白对照)。

在上述条件下，将每分钟水解木聚糖糖生成1μmol的木糖所需酶量定义为木聚糖酶的一个单位的酶活力(u)。

实施例1：表达载体pgapzαa-pars的构建

利用全基因合成技术合成核苷酸序列如seqidno.2所示的自主复制序列pars；将回收得到的pars基因片段，用infusion酶与质粒pgapzαa相连，构建得到表达载体pgapzαa-pars。

实施例2：毕氏酵母km71/ppic9k-xyna感受态细胞制作：

1)挑取酵母km71/ppic9k-xyna单菌落，接种至含有10mlypd培养基的50ml三角瓶中，30℃，250rpm培养过夜；

2)接种培养细胞100μl于含有100mlypd培养基的500ml三角瓶中，30℃，250rpm培养过夜，至od600达到1.3～1.5；

3)3个50ml无菌离心管于4℃，5000rpm离心5min弃上清，每管加入4ml无菌水充分悬浮细胞，收集合并成一管；加入2ml10*te缓冲液(ph＝7.5)2ml10*liac和0.5ml1mdtt旋转混匀，在30℃50rpm水浴摇床45min。

4)将3)中菌悬液加无菌水稀释至30ml，于4℃，5000rpm离心5min弃上清收集菌体，并加入预冷的无菌水25ml，充分悬浮细胞；

5)于4℃，5000rpm离心5min收集菌体，加入20ml预冷的1mol/l山梨醇重悬菌体；

6)重复步骤5)

7)于4℃，5000rpm离心5min收集菌体，加入1ml预冷的1mol/l山梨醇轻轻吹打，充分悬浮细胞，分装，当天使用。

实施例3：强化表达重组菌km71/ppic9k-xyna/pgapzαa-pars-xyna的构建

重组质粒pgapzαa-pars-xyna的构建：

以质粒pmd18-t-xyna(axylanasefromstreptomycessp.fa1:heterologousexpression,characterization,anditsapplicationinchinesesteamedbread，yangxu，journalofindustrialmicrobiology&biotechnology，may2016，volume43，issue5，pp663–670)为模板，设计序列如seqidno.3所示的正向引物：ccggaattcatggccgagaacaccctt，序列如seqidno.4所示的反向引物：atttgcggccgctcaggtgcgggtccagcgtt。通过聚合酶链式反应获得具有noti和ecori酶切位点的xyna片段。

pcr反应体系(50μl)：

pcr程序：94℃，4min(预变性)；98℃，10s(变性)；60℃，5s(退火)；72℃，90s(延伸)；设置30个循环；72℃，10min(保温)后设置保藏温度为4℃。将pcr产物进行胶回收、酶切回收目的基因将其与表达载体pgapzαa-pars进行双酶切，并于16℃连接过夜，转化e.colijm109，涂布含zecoin抗性的lb平板，37℃培养8-10h，挑取转化子，提取重组质粒并双酶切验证，然后对验证正确的重组质粒测定dna序列，阳性克隆子即pgapzαa-pars-xyna。见图1和图2。

重组质粒pgapzαa-pars-xyna的转化：

(1)从乙醇中取出电转杯，置于超净台中吹干，并置于冰中预冷备用；

(2)在冰上进行以下操作：将重组游离质粒pgapzαa-pars-xyna预冷，吸取5μl快速与80μlkm71/ppic9k-xyna酵母感受态中混匀，转移到0.2cm经过紫外照射的的电转杯，冰浴5min，电击条件为：电压1500v，时间控制4-10ms；

(3)迅速向电击杯中加入1ml1mol·l^-1预冷的山梨醇，轻轻吹打均匀，然后将其转移至冰冷的1.5ml无菌ep管中，30℃、50r·min^-1培养1-2h；

(4)离心菌体，重新悬浮均匀后吸取200μl-300μl涂布上还有zecoin抗性的ypd平板上，于30℃恒温条件下培养，至长出单菌落，即为含有游离质粒的重组单菌落。

(5)使用无菌牙签挑取ypd平板上的菌落，接种于含有10ml液体ypd培养基的50ml三角瓶中，30℃，200r/min，培养24h；

(6)将2.5ml(5)中菌液转入装有50mlbmgy培养基的500ml三角瓶培养表达24h，培养物经离心后,将菌体重悬转入25mlbmmy培养基的250ml三角瓶培养并每天加入375μl甲醇，诱导表达4～5天；培养物经离心后得到含重木聚糖酶的上清，利用dns法对其进行酶活检测。

实施例4：km71/ppic9k-xyna/pgapzαa-pars-xyna重组菌3.6l发酵罐发酵

重组毕氏酵母工程菌发酵罐发酵生产木聚糖酶的方法在3.6linfors罐进行，过程分为三阶段进行：

第一阶段：接种实施例3中的阳性转化子单菌落至装有10mlypd培养基的50ml三角瓶中，200rpm，30℃振荡培养24h，作为一级种子发酵液；

第二阶段：取所述一级种子发酵液2.5ml接种于装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中，200rpm，30℃振荡培养24h，作为二级种子发酵液；

第三阶段：将100ml的种子发酵液接种到装有900mlbsm培养基中的3.6l发酵罐中，200rpm，30℃的条件下培养，全程用25％氨水进行ph值的调节，保持在5.0；所述bsm培养基包括如下成分：85％磷酸26.7ml/l，caso40.93g/l，k2so418.2g/l，mgso4·7h2o14.9g/l，koh4.13g/l，甘油40.0g/l，ptm14.35ml/l上述成分均溶于水中形成所述bsm培养基；

待碳源耗尽，即do值迅速上升时，进行补料，待od600＝100时，停止补料，饥饿至第二次出现do值迅速上升时，继续补料，补料配方为100％甲醇；1.25％ptm1；甲醇和ptm1互溶形成所述补料。

实施例5：木聚糖酶酶活测定

取实施例3中km71/ppic9k-xyna/pgapzαa-pars-xyna重组菌产的酶进行酶活测定，实验结果见图4。结果表明，强化表达重组菌km71/ppic9k-xyna/pgapzαa-pars-xyna获得的木聚糖酶的最大酶活力2100u/ml，蛋白含量4.8mg/ml。整合型km71/ppic9k-xyna重组菌获得的木聚糖酶的最大酶活力为1370u/ml，蛋白含量6.3mg/ml(axylanasefromstreptomycessp.fa1:heterologousexpression,characterization,anditsapplicationinchinesesteamedbread，yangxu，journalofindustrialmicrobiology&biotechnology，may2016，volume43，issue5，pp663–670)，同整合型km71/ppic9k-xyna重组菌相比，强化表达重组菌表达木聚糖酶酶活提高了53％，同时表达的酶的比活力提高了90％，从而显著降低了工业化生产木聚糖酶的生产成本。此外，km71/ppic9k-xyna/pgapzαa-pars-xyna重组菌所产酶的蛋白电泳结果显示在43kda处有一条与理论分子量一致的条带(结果如图3所示)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110>江南大学

<120>一种强化表达streptomycessp.fa1来源木聚糖酶的毕氏酵母重组菌

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>436

<212>prt

<213>streptomycessp.fa1

<400>1

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151015

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<211>164

<212>dna

<213>人工合成

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