本发明涉及一种低聚肽的制备方法，具体涉及一种多酶联合制备乌参胶原蛋白低聚肽的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
乌参具有极高的营养价值与药用价值，富含蛋白质、海参皂苷、海参多糖、胶原蛋白、维生素、必需脂肪酸以及常量和微量元素等成分，且不含胆固醇，长期食用能增强体质、预防疾病、抑制肿瘤、延缓衰老。
然而，长期以来，由于缺乏产业化关键技术，乌参资源一直没有得到良好的开发和利用，其收购价格甚至一度低至1元/kg。大多数情况下，乌参捕捞后被作为废弃物丢弃，造成资源浪费的同时也污染环境。因此，开发乌参资源势在必行。
研究发现，乌参体壁中含有丰富的胶原蛋白，具有良好的生物活性及生物功能，能参与细胞的迁移、分化、增值，并且由于其较弱的抗原性和良好的生物相容性，经特殊处理后，在医学、美容、食品方面有较多的应用。然而，由于其分子量很大，不利于肠胃和皮肤的吸收，限制其生物活性的发挥。
因此，人们把目光投向了小分子的胶原蛋白多肽，胶原蛋白多肽分子量多为0.5kda-20kda左右。与胶原蛋白相比，胶原蛋白多肽不仅有胶原蛋白的营养特性，而且具有易于消化吸收、低过敏性、食用安全等优点。此外，胶原蛋白多肽还具有抗氧化、降血压、提高免疫力、改善记忆力和抗肿瘤等生物活性。对乌参胶原蛋白肽的研究和开发，必将推动乌参资源的开发利用，调动区域渔业结构调整，使乌参从附加值较低的海产品加工逐步向高附加值的食品营养剂、药品开发转移，从而促进区域经济发展。
但是，乌参胶原蛋白的肌纤维丝较粗壮、排列凌乱、纤维丝排列紧密。现有的酶解技术存在着水解度低、水解速度慢、水解时间长、水解效率低、酶的利用率差、产物得率低、产品分子量分布宽等缺陷。因此，利用传统的单酶水解法制备胶原蛋白多肽难以获得高收率的低聚肽。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提出了一种高收率的多酶联合制备乌参胶原蛋白低聚肽的方法。
本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种多酶联合制备乌参胶原蛋白低聚肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a.从乌参中提取胶原蛋白；
b.将上述提取的胶原蛋白用i型胶原蛋白酶水解，得到水溶性胶原蛋白；
c.将上述水溶性胶原蛋白用蛋白水解酶水解，得到乌参胶原蛋白低聚肽。
在上述的一种多酶联合制备乌参胶原蛋白低聚肽的方法中，步骤a的具体过程为：
a1.将乌参搅碎制备成浆液；
a2.将上述浆液离心后得到沉淀物ⅰ并与碱性溶液混合，经离心得到沉淀物ⅱ；
a3.将上述沉淀物ⅱ与缓冲液混合，生成胶原蛋白。
在上述的一种多酶联合制备乌参胶原蛋白低聚肽的方法中，所述沉淀物ⅰ与碱性溶液的质量比为1:(30-100)，碱性溶液为0.05-0.2m的氢氧化钠溶液。
在上述的一种多酶联合制备乌参胶原蛋白低聚肽的方法中，所述沉淀物ⅱ与缓冲液的质量比为1:(30-100)。
在上述的一种多酶联合制备乌参胶原蛋白低聚肽的方法中，所述缓冲液为tris-hcl、磷酸盐、硼砂-硼酸、硼砂-氢氧化钠中的一种，ph为6-10。
在上述的一种多酶联合制备乌参胶原蛋白低聚肽的方法中，步骤b中所述的i型胶原蛋白酶与胶原蛋白的质量比为(0.1-2)：100。
在上述的一种多酶联合制备乌参胶原蛋白低聚肽的方法中，步骤b中所述水解的温度为30-50℃，时间为1h以上。
在上述的一种多酶联合制备乌参胶原蛋白低聚肽的方法中，步骤c中所述蛋白水解酶与水溶性胶原蛋白的质量比为(0.1-0.5)：100。
在上述的一种多酶联合制备乌参胶原蛋白低聚肽的方法中，步骤c中所述水解的温度为30-60℃，时间为1-4h。
在上述的一种多酶联合制备乌参胶原蛋白低聚肽的方法中，步骤c中所述的蛋白水解酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶中的一种或多种。
在上述的一种多酶联合制备乌参胶原蛋白低聚肽的方法中，步骤c中所述的蛋白水解酶为胃蛋白酶、碱性蛋白酶中的一种或两种。
在上述的一种多酶联合制备乌参胶原蛋白低聚肽的方法中，步骤c中所述的蛋白水解酶为ph为2-3的胃蛋白酶，水解的温度为37-38℃。
在上述的一种多酶联合制备乌参胶原蛋白低聚肽的方法中，步骤c中所述的蛋白水解酶为ph为7.8-8.5的胰蛋白酶，水解的温度为37-38℃。
在上述的一种多酶联合制备乌参胶原蛋白低聚肽的方法中，步骤c中所述的蛋白水解酶为ph为5-7的木瓜蛋白酶，水解的温度为50-60℃。
在上述的一种多酶联合制备乌参胶原蛋白低聚肽的方法中，步骤c中所述的蛋白水解酶为ph为8-11的碱性蛋白酶，水解的温度为30-60℃。
乌参胶原蛋白主要为i型胶原蛋白，其结构稳定，一般蛋白酶对其水解效果较差，低聚肽(mw＜1kda)含量很低。本发明采用多酶联合水解方式，先用i型胶原蛋白酶专一性水解，使其螺旋结构破坏；再使用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或碱性蛋白酶等常规水解酶水解，制备得到的乌参胶原蛋白低聚肽(mw＜1kda)分子量比较集中，可达到50％左右。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1：
选取富含胶原蛋白的东海乌参为原料，清水浸泡脱除盐分，洗净后用ph＝8的edta溶液浸泡5天去除体壁重金属，水洗后用匀浆机搅碎制备成匀浆液。匀浆液经离心后得到沉淀物ⅰ，按质量比为1:50在沉淀物ⅰ中加入0.1m的naoh浸泡3天，除去非胶原物质，离心弃去上清液得到沉淀物ⅱ。沉淀物ⅱ水洗至中性，再按质量比为1:50在沉淀物ⅱ中加ph＝8的缓冲液tris-hcl浸泡3天，让蛋白质生成，离心弃去上清液，水洗至中性冻干，即为东海乌参胶原蛋白。
按质量比为100:0.5称取上述胶原蛋白和i型胶原蛋白酶溶液，在40℃混合提取3天，12000g离心30min，沉淀物再次提取24h，12000g离心30min，合并两次上清液，冻干即为水溶性胶原蛋白。
按质量比为100:0.5称取上述水溶性胶原蛋白和胃蛋白酶，在ph＝2.5、38℃下水解水溶性胶原蛋白4h，得到乌参胶原蛋白低聚肽。
实施例2：
选取富含胶原蛋白的东海乌参为原料，清水浸泡脱除盐分，洗净后用ph＝8的edta溶液浸泡5天去除体壁重金属，水洗后用匀浆机搅碎制备成匀浆液。匀浆液经离心后得到沉淀物ⅰ，按质量比为1:50在沉淀物ⅰ中加入0.1m的naoh浸泡3天，除去非胶原物质，离心弃去上清液得到沉淀物ⅱ。沉淀物ⅱ水洗至中性，再按质量比为1:50在沉淀物ⅱ中加ph＝8的缓冲液tris-hcl浸泡3天，让蛋白质生成，离心弃去上清液，水洗至中性冻干，即为东海乌参胶原蛋白。
按质量比为100:0.5称取上述胶原蛋白和i型胶原蛋白酶溶液，在40℃混合提取3天，12000g离心30min，沉淀物再次提取24h，12000g离心30min，合并两次上清液，冻干即为水溶性胶原蛋白。
按质量比为100:0.5称取上述水溶性胶原蛋白和胰蛋白酶，在ph＝8.0、38℃下水解水溶性胶原蛋白4h，得到乌参胶原蛋白低聚肽。
实施例3：
选取富含胶原蛋白的东海乌参为原料，清水浸泡脱除盐分，洗净后用ph＝8的edta溶液浸泡5天去除体壁重金属，水洗后用匀浆机搅碎制备成匀浆液。匀浆液经离心后得到沉淀物ⅰ，按质量比为1:50在沉淀物ⅰ中加入0.1m的naoh浸泡3天，除去非胶原物质，离心弃去上清液得到沉淀物ⅱ。沉淀物ⅱ水洗至中性，再按质量比为1:50在沉淀物ⅱ中加ph＝8的缓冲液tris-hcl浸泡3天，让蛋白质生成，离心弃去上清液，水洗至中性冻干，即为东海乌参胶原蛋白。
按质量比为100:0.5称取上述胶原蛋白和i型胶原蛋白酶溶液，在40℃混合提取3天，12000g离心30min，沉淀物再次提取24h，12000g离心30min，合并两次上清液，冻干即为水溶性胶原蛋白。
按质量比为100:0.5称取上述水溶性胶原蛋白和木瓜蛋白酶，在ph＝6.0、55℃下水解水溶性胶原蛋白4h，得到乌参胶原蛋白低聚肽。
实施例4：
选取富含胶原蛋白的东海乌参为原料，清水浸泡脱除盐分，洗净后用ph＝8的edta溶液浸泡5天去除体壁重金属，水洗后用匀浆机搅碎制备成匀浆液。匀浆液经离心后得到沉淀物ⅰ，按质量比为1:50在沉淀物ⅰ中加入0.1m的naoh浸泡3天，除去非胶原物质，离心弃去上清液得到沉淀物ⅱ。沉淀物ⅱ水洗至中性，再按质量比为1:50在沉淀物ⅱ中加ph＝8的缓冲液tris-hcl浸泡3天，让蛋白质生成，离心弃去上清液，水洗至中性冻干，即为东海乌参胶原蛋白。
按质量比为100:0.5称取上述胶原蛋白和i型胶原蛋白酶溶液，在40℃混合提取3天，12000g离心30min，沉淀物再次提取24h，12000g离心30min，合并两次上清液，冻干即为水溶性胶原蛋白。
按质量比为100:0.5称取上述水溶性胶原蛋白和碱性蛋白酶，在ph＝10、40℃下水解水溶性胶原蛋白4h，得到乌参胶原蛋白低聚肽。
对比例1-4：
对比例1-4与实施例1-4的区别仅在于，对比例1-4的胶原蛋白不经过i型胶原蛋白酶水解，直接进行胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶的水解。
将本发明实施例1-4与对比例1-4的效果进行比较，结果如表1所示。
表1：
从表1可知，本发明的水解度高，制备得到的乌参胶原蛋白低聚肽(mw＜1kda)分子量比较集中，低聚肽含量显著提高。
在上述实施例及其替换方案中，沉淀物ⅰ与naoh溶液的质量比还可以为1:30、1:35、1:40、1:45、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100。
在上述实施例及其替换方案中，naoh溶液的浓度还可以为0.05m、0.15m、0.2m。
在上述实施例及其替换方案中，沉淀物ⅱ与缓冲液的质量比还可以为1:30、1:35、1:40、1:45、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100。
在上述实施例及其替换方案中，缓冲液还可以为磷酸盐、硼砂-硼酸、硼砂-氢氧化钠。
在上述实施例及其替换方案中，缓冲液的ph还可以为6、7、7.5、8.5、9、10。
在上述实施例及其替换方案中，i型胶原蛋白酶与胶原蛋白的质量比还可以为0.1：100、0.2：100、0.3：100、0.4：100、0.6：100、0.7：100、0.8：100、0.9：100、1：100、1.1：100、1.2：100、1.3：100、1.4：100、1.5:100、1.6：100、1.7：100、1.8：100、1.9：100、2：100、。
在上述实施例及其替换方案中，i型胶原蛋白酶水解胶原蛋白的温度还可以为30℃、35℃、45℃、50℃，时间还可以为1h、5h、10h、20h、30h、50h、80h。
在上述实施例及其替换方案中，蛋白水解酶与水溶性胶原蛋白的质量比还可以为0.1：100、0.2：100、0.3：100、0.4：100。
在上述实施例及其替换方案中，蛋白水解酶与水溶性胶原蛋白的水解时间还可以为1h、2h、3h。
在上述实施例及其替换方案中，胃蛋白酶的ph还可以为2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.6、2.7、2.8、2.9、3，水解的温度还可以为37℃、37.5℃。
在上述实施例及其替换方案中，胰蛋白酶的ph还可以为7.8、7.9、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5，水解的温度还可以为37℃、37.5℃。
在上述实施例及其替换方案中，木瓜蛋白酶的ph还可以为5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7，水解的温度还可以为50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃。
在上述实施例及其替换方案中，碱性蛋白酶的ph还可以为8、8.5、9、9.5、10.5、11，水解的温度还可以为30℃、35℃、45℃、50℃、55℃、60℃。
鉴于本发明方案实施例众多，各实施例实验数据庞大众多，不适合于此处逐一列举说明，但是各实施例所需要验证的内容和得到的最终结论均接近。故而此处不对各个实施例的验证内容进行逐一说明，仅以实施例1-4作为代表说明本发明申请优异之处。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。