重金属离子吸附系统及其宿主菌、重金属离子回收方法与流程

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重金属离子吸附系统及其宿主菌、重金属离子回收方法。

背景技术：

近年来，随着我国经济建设的迅猛发展，对重金属的开采、冶炼、加工及商业制造活动日益增多，造成不少重金属(如铅、汞、镉等)进入大气、水、土壤中，引发了一系列严重的污染事件，对生态环境造成了极大的危害。重金属造成的急性中毒和各类人体慢性疾病如老年痴呆症，也正在时刻威胁着人类的健康。而另一方面，随着科技水平的日新月异，那些化学性质稳定、物理属性优良的重金属如金、银、铜、铂、钯等，被广泛应用在了电子、通讯、航空航天、化工、医疗等领域，以及与人们日常生活相关的各类生活日用品中。如何合理地将自然界中的重金属应用到人类的生产生活中，使之与生态环境保护可持续性和谐发展是目前科技工作者面临的重大挑战。一方面，一些重金属离子在很低浓度时就会对生物体具有极强的毒性，且与有机化合物不同，重金属具有富集性，在自然环境中很难被降解。由于生产工艺的限制，在一系列生产活动所产生的废弃物，例如工业废水中含有大量的重金属离子，这既会对生态环境造成破坏，也使得生产成本居高不下。目前对于工业废水中重金属离子的检测和富集主要采用的都是物理吸附和化学试剂法，这些方法一般检测灵敏度较低，尤其是对各种性质相近的重金属离子的区分度较差，无法实现对某种特定重金属离子的特异识别与去除。而采用大型分析设备如icp-ms(电感耦合等离子体质谱)，虽然其对重金属离子的检测灵敏度更高，但是操作手段繁琐，耗时较长，必须要将样品送到指定部门由专业人员进行检测，难以实现现场的快速检验和实时监测，且在检测的基础之上再利用这些大型仪器实现重金属的特异吸附就更加困难。

综上，现有的重金属离子回收的化学方法有三个缺点：第一是化学方法有可能由于加入的化学试剂的量不合适而造成二次污染；第二是化学方法选择性不够高，尤其是处理性质极相近的各种重金属离子效果不好，即使回收得到了一定的目的金属，纯度也不高，还需要进一步处理；第三是化学方法回收工业废水中的重金属离子时所产生的污水对于环境不友好，沉淀剂等化学试剂可能对于自然环境造成更大的破坏。铅、金与铀酰是重金属中少有的化学、物理、电子性能优异的重金属，应用领域非常广，但是现有的方法很难实现对工业废水中重金属离子的高效选择性富集和回收。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种重金属离子吸附系统及其宿主菌、重金属离子回收方法，旨在解决现有重金属离子回收选择性不强、纯度低、效果不理想，以及污染环境的技术问题。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种重金属离子吸附系统，包括相互连接的枯草芽孢杆菌生物膜蛋白tasadna序列和重金属离子结合蛋白dna序列，且所述枯草芽孢杆菌芽生物膜蛋白tasadna序列与启动子连接。。

另一方面，本发明提供一种重金属离子吸附蛋白表面展示系统，包括由上述重金属离子吸附系统表达的枯草芽孢杆菌生物膜蛋白tasa和重金属离子结合蛋白。

另一方面，本发明提供一种表达载体，包括上述重金属离子吸附系统。

又一方面，本发明提供一种宿主菌，所述宿主菌包括上述表达载体；或所述宿主菌表达上述重金属离子吸附蛋白表面展示系统。

再一方面，本发明提供一种上述重金属离子吸附系统的制备方法，包括如下步骤：

从枯草芽孢杆菌基因组中扩增出枯草芽孢杆菌生物膜蛋白tasadna序列；

从表达重金属离子结合蛋白的菌种基因组中扩增出所述重金属离子结合蛋白dna序列；

将启动子、所述枯草芽孢杆菌生物膜蛋白tasadna序列和所述重金属离子结合蛋白dna序列依次连接。

最后，本发明提供一种重金属离子回收方法，包括如下步骤：

提供含有重金属离子的液体；

将本发明的宿主菌培养后加入所述液体中，静置处理；

待所述溶液中出现沉淀后，进行过滤处理得到吸附有重金属离子的所述宿主菌；

用酸处理吸附有重金属离子的所述宿主菌，分离后得到重金属离子。

本发明的重金属离子吸附系统高选择性吸附重金属离子，其根据鼠伤寒沙门氏菌中重金属离子的调控机制设计，其中包含了该菌调控机制中关键部分。本发明的重金属离子吸附系统包括枯草芽孢杆菌生物膜蛋白tasa和重金属离子结合蛋白的dna序列以及调控其表达的启动子，而且其容易制备、成本较低、操作方便。将该系统连接到质粒中后导入非致病性的枯草芽孢杆菌细胞体内，在启动子调控下使得吸附部分的枯草芽孢杆菌生物膜蛋白tasa和重金属离子结合蛋白大量表达，可高效选择性吸附重金属离子。可以表达重金属离子吸附蛋白表面展示系统的工程菌，对重金属离子的吸附及回收具有很好的效果。

本发明提供的重金属回收方法，利用可表达重金属离子吸附蛋白表面展示系统的工程菌高效吸附回收重金属离子，将工程菌液加入到含重金属离子的废水中，菌体能够在细胞膜外大量表达重金属离子结合蛋白，将废水中的重金属离子结合，其选择性强、获得的纯度高；在完成重金属离子结合吸附后，对菌体进行聚集和沉淀，菌体回收方便，可二次使用。本发明最终能够通过生物手段实现对工业废水中重金属离子的可循环富集和回收；因此，其够克服现有技术的缺点，不会造成二次污染，对环境友好。

附图说明

图1是本发明实施例1重金属离子检测系统质粒构建图谱；

图2是本发明实施例1重金属离子检测系统质粒的电泳鉴定图；其中，m是dna分子量标准，1是重金属离子检测系统质粒泳道；

图3是本发明实施例2重金属离子吸附系统质粒构建图谱；

图4是本发明实施例2重金属离子吸附系统质粒的电泳鉴定图；其中，m是dna分子量标准，1是融合蛋白表达tasa-golb/pbrr/sup质粒泳道；

图5是本发明实施例3重金属离子吸附系统表达时使用的pdg1730质粒载体图谱；

图6是本发明实施例6重金属离子吸附系统对金离子吸附效果对比图；

图7是本发明实施例6重金属离子吸附系统对铀酰离子吸附效果对比图；

图8是本发明实施例6重金属离子吸附系统对铅离子吸附效果对比图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一方面，本发明实施例提供了一种重金属离子吸附系统，包括相互连接的枯草芽孢杆菌生物膜蛋白tasadna序列和重金属离子结合蛋白dna序列，且该枯草芽孢杆菌生物膜蛋白tasadna序列与启动子连接。

在一实施例中，该启动子为pcot，其序列如seqidno:18所示；或者该启动子也可以为pveg，其序列如seqidno:21所示。而枯草芽孢杆菌生物膜蛋白tasadna序列如seqidno:3所示。

进一步地，重金属离子结合蛋白dna序列的下游连接有绿色荧光蛋白egfpdna序列，如seqidno:15所示。如此，可以进一步检测到重金属离子吸附系统的表达。

又一实施例中，该重金属离子结合蛋白dna序列为铅离子结合蛋白pbrrdna序列，其如seqidno:6所示；或重金属离子结合蛋白dna序列为金离子结合蛋白golbdna序列，其如seqidno:9所示；或重金属离子结合蛋白dna序列为铀酰离子结合蛋白supdna序列，其如seqidno:12所示。凡是可以与重金属离子结合的功能蛋白dna序列，都是本发明实施例中金属离子结合蛋白dna序列，这里不一一列举。

另一方面，本发明实施例提供一种重金属离子吸附蛋白表面展示系统，其包括由本发明实施例的重金属离子吸附系统表达的枯草芽孢杆菌生物膜蛋白tasa和金离子结合蛋白golb。

另一方面，本发明实施例提供了一种表达载体，该表达载体包括本实施例的重金属离子吸附系统。同时，本发明实施例提供了一种宿主菌，该宿主菌包括本实施例的表达载体；或表达本实施例的重金属离子吸附蛋白表面展示系统。

又一方面，本发明实施例提供一种上述重金属离子吸附系统的制备方法，包括如下步骤：

s011：从枯草芽孢杆菌基因组中扩增出枯草芽孢杆菌生物膜蛋白tasadna序列；

s012：从表达重金属离子结合蛋白的菌种基因组中扩增出该重金属离子结合蛋白dna序列；

s013：将启动子、枯草芽孢杆菌生物膜蛋白tasadna序列和重金属离子结合蛋白dna序列依次连接。

在一实施例中，扩增所述枯草芽孢杆菌生物膜蛋白tasadna序列的引物如seqidno:1、seqidno:2所示；又一实施例中，该启动子可以为pcot或pveg，且扩增pcot的引物如seqidno:16、seqidno:17所示，扩增pveg的引物如seqidno:19、seqidno:20所示，该两启动子都可从本实验室枯草芽孢杆菌基因组中扩增出；又一实施例中，重金属离子结合蛋白dna序列为铅离子结合蛋白pbrrdna序列或金离子结合蛋白golbdna序列或铀酰离子结合蛋白supdna序列，且扩增该铅离子结合蛋白pbrrdna序列的引物如dnaseqidno:4、seqidno:5所示，扩增该金离子结合蛋白golbdna序列的引物如dnaseqidno:7、seqidno:8所示，扩增该铀酰离子结合蛋白supdna序列的引物拉如seqidno:10、seqidno:11所示。本实施例中，可从鼠伤寒沙门氏菌基因组(ncbi中的引用位置：nc_003197)与嗜铜杆菌基因组(ncbi中的引用位置：nc_007973)中分别扩增出金离子结合蛋白golbdna序列和铅离子结合蛋白pbrrdna序列；而铀酰离子结合蛋白supdna序列可人工合成，效果更好。

最后，本发明实施例还提供了一种重金属离子回收方法，其包括如下步骤：

s021：提供含有重金属离子的液体；

s022：将本发明实施例的宿主菌培养后加入上述液体中，静置处理；

s023：待溶液中出现沉淀后，进行过滤处理得到吸附有重金属离子的宿主菌；

s024：用酸处理吸附有重金属离子的宿主菌，分离后得到重金属离子。

在一选实施例中，上述步骤s021中，含有重金属离子的液体可以是各种工业废水、矿业废水等中含有重金属离子的回收液，在该液体中重金属离子的浓度范围优选为0.1μm～20μm；上述步骤s022中，静置处理的时间范围为40h～48h，该范围内宿主菌对液体中重金属离子起到很好的吸附效果。

本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。

实施例1重金属离子检测系统表达质粒的构建及鉴定

1.检测系统中重金属离子结合蛋白基因片段的扩增

使用特异引物(seqidno:4)(seqidno:5)(seqidno:7)(seqidno:8)从嗜铜杆菌基因组dna(ncbi中的引用位置：nc_007973)与鼠伤寒沙门氏菌基因组dna(ncbi中的引用位置：nc_003197)中扩增出编码重金属离子结合蛋白基因的dna序列(seqidno:6)(seqidno:9)，人工合成的sup基因的dna序列(seqidno:12)，并设计对应的扩增引物(seqidno:10)(seqidno:11)，反应条件如下。

pcr反应体系(50μl)：

pcr条件：

第一步：95℃，3分钟

第二步：95℃，1分钟

第三步：60℃，2分钟

第四步：72℃，4分钟

第五步：重复第二步至第四步，29个循环

第六步：72℃，10分钟

第七步：4℃保温。

回收pcr产物，备用。

2.枯草芽孢杆菌生物膜蛋白(tasa)片段的基因扩增

根据所需扩增目的dna序列和碱基互配原理，设计特异引物tasa1(seqidno:1)和tasa2(seqidno:2)，从枯草芽孢杆菌基因组dna(ncbi中的引用位置：nc_000964)中扩增出编码枯草芽孢杆菌生物膜蛋白tasa第1位至第314位dna的碱基序列(seqidno:3)，反应条件如下。

pcr反应体系(50μl)：

pcr条件：

第一步：95℃，2分钟

第二步：95℃，0.5分钟

第三步：63℃，0.5分钟

第四步：72℃，0.5分钟

第五步：重复第二步至第四步，29个循环

第六步：72℃，10分钟

第七步：4℃保温。

回收pcr产物，备用。

3.检测系统中报告基因egfp-terminator片段的扩增

1)绿色荧光蛋白egfp片段基因的扩增

使用特异引物(seqidno:13)(seqidno:14)从本实验室所有的大肠杆菌表达载体基因组dna中扩增出编码绿色荧光蛋白egfp的dna序列(seqidno:15)，反应条件如下。

pcr反应体系(50μl)：

pcr条件：

第一步：94℃，2分钟

第二步：94℃，0.5分钟

第三步：60℃，0.5分钟

第四步：72℃，1分钟

第五步：重复第二步至第四步，29个循环

第六步：72℃，10分钟

第七步：10℃保温。

回收pcr产物，备用。

2)终止子terminator片段的基因扩增

根据所需扩增目的dna序列和碱基互配原理，设计特异引物term1(seqidno:22)和term2(seqidno:23)，从本实验室所有的大肠杆菌表达载体基因组dna中扩增出终止子terminator的dna序列(seqidno:24)，反应条件如下。

pcr反应体系(50μl)：

pcr反应条件：

第一步：94℃，2分钟

第二步：94℃，0.5分钟

第三步：60℃，0.5分钟

第四步：72℃，0.5分钟

第五步：重复第二步至第四步，29个循环

第六步：72℃，10分钟

第七步：10℃保温。

回收pcr产物，备用。

3)egfp-terminator片段的基因扩增

根据所需扩增目的dna序列和碱基互配原理，使用特异引物(seqidno:13)(seqidno:23),以上述第1和2点回收的扩增产物为模版，扩增出egfp-terminator片段的dna序列，反应条件如下。

pcr反应体系(50μl)：

pcr反应条件：

第一步：94℃，2分钟

第二步：94℃，0.5分钟

第三步：65℃，0.5分钟

第四步：72℃，1分钟

第五步：重复第二步至第四步，29个循环

第六步：72℃，10分钟

第七步：10℃保温。

回收pcr产物，备用。

4.检测系统中重金属离子表面展示和报告基因融合蛋白表达质粒的构建与鉴定

1)使用dna限制性内切酶ecori和psti酶切上述tasa基因的dna片段，然后使用t4dna连接酶插入到本实验室所有的大肠杆菌生物砖表达载体pzh2中。

酶切反应体系(20μl)：

反应条件：37℃水浴10小时。

dna连接反应体系(10μl，100ngdna)：

反应条件：16℃水浴16小时。

2)使用dna限制性内切酶xbai和psti酶切上述得到的三个重金属离子吸附蛋白的dna片段(pbrr,golb与sup)然后使用t4dna连接酶插入1)步骤构建完成的大肠杆菌生物砖表达载体pzh2中。

酶切反应体系(20μl)：

反应条件：37℃水浴10小时。

dna连接反应体系(10μl，100ngdna)

反应条件：16℃水浴16小时。

3)最后使用dna限制性内切酶xbai和psti酶切上述egfp-terminator片段，然后使用t4dna连接酶插入2)步骤构建完成的大肠杆菌生物砖表达载体pzh2中，得到重金属离子检测系统表达质粒见图1，电泳鉴定结果请见图2。

实施例2重金属离子吸附系统表达质粒的构建及鉴定

1.吸附系统中专用启动子片段ptas与pveg的扩增

根据所需扩增目的dna序列和碱基互配原理，设计特异引物(seqidno:16)(seqidno:17)或(seqidno:19)(seqidno:20)，从本实验室枯草芽孢杆菌基因组中扩增出重金属离子调控基因的启动子的ptas序列(seqidno:18)或pveg序列(seqidno:21)，反应条件如下。

pcr反应体系(50μl)：

pcr条件：

第一步：95℃，2分钟

第二步：95℃，0.5分钟

第三步：63℃，0.5分钟

第四步：72℃，0.5分钟

第五步：重复第二步至第四步，29个循环

第六步：72℃10分钟

第七步：4℃保温。

回收pcr产物，备用。

2.吸附系统中重金属离子吸附基因片段的扩增

1)枯草芽孢杆菌生物膜蛋白(tasa)片段的基因扩增

根据所需扩增目的dna序列和碱基互配原理，设计特异引物tasa1(seqidno:1)和tasa2(seqidno:2)，从枯草芽孢杆菌基因组dna(ncbi中的引用位置：nc_000964)中扩增出编码枯草芽孢杆菌生物膜蛋白tasa第1位至第314位dna的碱基序列(seqidno:3)，反应条件如下。

pcr反应体系(50μl)：

pcr条件：

第一步：95℃，2分钟

第二步：95℃，0.5分钟

第三步：63℃，0.5分钟

第四步：72℃，0.5分钟

第五步：重复第二步至第四步，29个循环

第六步：72℃，10分钟

第七步：4℃保温。

回收pcr产物，备用。

2)重金属离子结合蛋白片段的基因扩增

见实施例1。

3)终止子terminator片段的基因扩增

根据所需扩增目的dna序列和碱基互配原理，设计特异引物term1(seqidno:22)和term2(seqidno:23)，从本实验室所有的大肠杆菌表达载体基因组dna中扩增出终止子terminator的dna序列(seqidno:24)，反应条件如下。

pcr反应体系(50μl)：

pcr条件：

第一步：94℃，2分钟

第二步：94℃，0.5分钟

第三步：60℃，0.5分钟

第四步：72℃，0.5分钟

第五步：重复第二步至第四步，29个循环

第六步：72℃，10分钟

第七步：10℃保温。

回收pcr产物，备用。

3.tasa-golb融合蛋白表达质粒的构建及鉴定

1)使用dna限制性内切酶xbai和psti酶解上述tasa和三种重金属离子结合蛋白的dna片段，然后使用t4dna连接酶插入大肠杆菌生物砖表达载体pzh2中，tasa-pbrr/golb/sup融合蛋白表达质粒构建图谱请详见图3，鉴定结果见图4。

酶切反应体系(20μl)

反应条件：37℃水浴10小时。

dna连接反应体系(10μl(100ngdna)：

反应条件：16℃水浴16小时。

实施例3重金属离子吸附系统同源重组表达质粒的构建及鉴定

1.使用dna限制性内切酶psti和spei酶解上述得到的启动子pcot/pveg片段，使用dna限制性内切酶psti和xbai酶解上述tasa-pbrr/golb/sup的dna片段，然后使用t4dna连接酶插入到大肠杆菌生物砖质粒骨架pzh2中，将大肠杆菌生物砖表达载体pzh2中的目的片段使用dna限制性内切酶psti和ecori酶切下来整合到pdg1730枯草芽孢杆菌表达载体(见图5)，同源重组到枯草芽孢杆菌的基因组上进行表达，即获得所述的重金属离子吸附系统。

酶切反应体系(20μl)：

反应条件：37℃水浴10小时。

dna连接反应体系(10μl，100ngdna)：

反应条件：16℃水浴16小时。

实施例4重金属离子吸附系统质粒转入宿主菌

1)将上述同源重组所得的表达型质粒载体用cacl2转化法转化大肠杆菌dh5α，酶切鉴定重组整合载体。

2)枯草芽胞杆菌的转化，活化枯草芽胞杆菌转接到spi培养基中培养一段时间，然后转到spⅱ培养基中培养形成感受态，将重组pdg1730质粒切成线状转化枯草芽胞杆菌，具体方法参照zeigler(2002)。

3)重组菌的筛选和鉴定

采用常规菌落pcr法和抽提阳性克隆的质粒后酶切鉴定法，具体可参见《takara限制性内切酶采购目录和技术指南》。测序由上海生物工程技术服务公司完成。重金属离子吸附及回收系统质粒的提取与鉴定。

实施例5重金属离子吸附系统对重金属离子选择性能力的检测

1.将用于检测重金属离子的枯草芽孢杆菌菌种接入适量含有壮观霉素(50μgml^-1)的lb液体培养基中于37℃中培养过夜；将过夜培养菌液1:100稀释入适量含有壮观霉素(50μgml^-1)dsm液体培养基中于37℃中培养至培养液od600＝0.6，向培养液中分别加入终浓度为20μm的银、镍、锌、铜、镉、铬、铅离子，培养液在37℃中继续培养48h；

2.培养48h的细菌培养液通过离心(8000转/分钟，2min)收集后，用去离子水清洗1次；

3.清洗后的菌体使用1×pbs缓冲液重悬；

4.使用酶标仪检测重悬后的菌液。

检测结果显示：经改造的工程菌对相对应的重金属离子有较好的选择性。

实施例6tasa-pbrr/golb/sup、wt168重金属离子吸附能力的检测

对工程菌tasa-pbrr/golb/sup(对应连接两种不同的启动子：pcot或pveg)以及wt168(枯草芽孢杆菌常用品系，此处为对照组)进行吸附实验，检测重金属离子吸附能力。实验前两种菌均划线培养于lb固体培养基中(壮观霉素抗性)。

①从两个个培养皿中分别挑取单菌落接种于5mllb(含5ul壮观霉素)培养基中，37℃、220rpm培养过夜。

②将细菌培养液以1：100重新接种于100mllb(含100ul氨苄青霉素)培养基中，37℃、220rpm培养至od600＝0.6，加入重金属离子浓度终浓度分别为1μmol，5μmol，20μmol。37℃、220rpm继续培养48h。每个实验组设置3个重复。

③收集细菌，弃上清液。ddh2o清洗3次。-80℃冻存6h后用冻干机冻干细菌沉淀。

④称重后用1ml浓硝酸消解至完全，用双蒸水定容至10ml，最后使用电感耦合等离子发射光谱(icp-aes)检测。

在重金属离子浓度为20μmol时，其吸附检测结果如图6、图7和图8所示：图6为两种工程菌(pcot/pveg-tasa-golb)相对对照组对金离子吸附效果图，图7为两种工程菌(pcot/pveg-tasa-sup)相对对照组对铀酰离子吸附效果图，图8为两种工程菌(pcot/pveg-tasa-pbrr)相对对照组对铅离子的吸附效果图。检测结果显示：经改造的工程菌对相对应的重金属离子有更好的吸附性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>深圳劲宇生物科技有限公司

<120>重金属离子吸附系统及其宿主菌、重金属离子回收方法

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<213>扩增编码枯草芽孢杆菌生物膜蛋白tasa的基因的引物

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<213>扩增编码枯草芽孢杆菌生物膜蛋白tasa的基因的引物

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<213>枯草芽孢杆菌生物膜蛋白tasa的dna序列

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<213>铅离子结合蛋白pbrr的dna序列

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<213>扩增编码金离子结合蛋白golb的基因的引物

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<213>金离子结合蛋白golb的dna序列

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<213>铀酰离子结合蛋白sup的dna序列

<400>12

ggcggaggttctggaggagggagcaatgccctggattgccgtgaacgcattgaaaaagac60

ctggaaaacctggaaaaagaactgatggaaatgaaaagcatcaaactgtctgatgacgaa120

gaagcggtggttgaacgtgccctgaattatcgcgatgacagtgtctattacctggaaaaa180

ggcgatcatattacctcctttggttgtatcacgtacgcggagggcctgacggatagcctg240

cgtatgctgcaccgcattatcgaaggt267

<210>13

<211>50

<212>dna

<213>扩增编码绿色荧光蛋白egfp的基因的引物

<400>13

ctttcttcgaattcgcggccatatacatatgagtaaaggagaagaacttt50

<210>14

<211>42

<212>dna

<213>扩增编码绿色荧光蛋白egfp的基因的引物

<400>14

ttagtggccgtatgttggccgtactagtaattaagcaccggt42

<210>15

<211>797

<212>dna

<213>绿色荧光蛋白egfp的dna序列

<400>15

atatacatatgagtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaat60

tagatggtgatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaa120

catacggaaaacttacccttaaatttatttgcactactggaaaactacctgttccatggc180

caacacttgtcactactttgacttatggtgttcaatgcttttcccgttatccggatcata240

tgaaacggcatgactttttcaagagtgccatgcccgaaggttatgtacaggaacgcacta300

tatttttcaaagatgacgggaactacaagacgcgtgctgaagtcaagtttgaaggtgata360

cccttgttaatcgtatcgagttaaaaggtattgattttaaagaagatggaaacattctcg420

gacacaaactcgagtacaactataactcacacaatgtatacatcatggcagacaaacaaa480

agaatggaatcaaagttaacttcaaaattcgccacaacattgaagatggatccgttcaac540

tagcagaccattatcaacaaaatactccaaaccattacctgtcgacacaatctgcccttt600

cgaaagatcccaacgaaaagcgtgaccacatggcatggatgagctctacaaatatcgata660

tgaattccaactgagcgccgctagcaagcttgcggccgcactcgagcaccaccaccacca720

accattacctgtcgacacaatctgccctttcgaaagatcccaacgaaaagcgtgaccaca780

caacatacggccactaa797

<210>16

<211>43

<212>dna

<213>扩增启动子ptas的引物

<400>16

ctttcttcgaattcgcggccgcttctagagcggcttcagttgt43

<210>17

<211>37

<212>dna

<213>扩增启动子ptas的引物

<400>17

gtttcttcctgcagcggccgtactagtaaaggtaagc37

<210>18

<211>63

<212>dna

<213>启动子ptas的序列

<400>18

cttcagttgtaaacctggcaacaggtttcgatataaaatcattcaataaaaggggagctt60

acc63

<210>19

<211>43

<212>dna

<213>扩增启动子pveg的引物

<400>19

ctttcttcgaattcgcggccgcttctagagaattttgtcaaaa43

<210>20

<211>36

<212>dna

<213>扩增启动子pveg的引物

<400>20

gtttcttcctgcagcggccacatttattgtacaaca36

<210>21

<211>97

<212>dna

<213>启动子pveg的序列

<400>21

aattttgtcaaaataattttattgacaacgtcttattaacgttgatataatttaaatttt60

atttgacaaaaatgggctcgtgttgtacaataaatgt97

<210>22

<211>43

<212>dna

<213>扩增终止子terminator的引物

<400>22

ctttcttcgaattcgcggccgcttctagagcggcggcatggac43

<210>23

<211>37

<212>dna

<213>扩增终止子terminator的引物

<400>23

gtttcttcctgcagcggccgtactagtaaaaggccca37

<210>24

<211>171

<212>dna

<213>终止子terminator的序列

<400>24

accggcggcatggacgagctgtacaagtaataatactagagccaggcatcaaataaaacg60

aaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctct120

ctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatat171