一株耐受纳米二氧化钛毒性的施氏假单胞菌及其应用的利记博彩app

本发明涉及一种施氏假单胞菌，特别是涉及一种在好氧条件下能够耐受纳米二氧化钛毒性且能够将废水中的硝酸盐氮同步脱除的施氏假单胞菌及其在污水处理中的应用。

背景技术：

纳米材料的粒径一般介于1-100nm之间，因其特殊的物理化学特性(如非迁移性、荧光性、压电性和散射紫外线能力等)以及其在光、电、磁等方面的奇妙性能，被广泛用于药物、化妆品、杀菌防腐、复合材料、食品抗菌包装膜、再生医学、医疗器械等领域。纳米tio2是目前使用最广泛的金属氧化物纳米颗粒，据统计tio2每年全球生产总量达10000吨，约50-80％的纳米tio2被用于化妆品和防晒产品。随着纳米tio2的工业化生产和广泛应用，其不可避免地排入污水收集系统，并最终随着生活污水和工业废水系统进入污水处理厂。

众所周知，国内外城市污水处理厂普遍采用活性污泥法来实现污水氮和磷的去除。在活性污泥处理系统中，以微生物为核心的活性污泥是污染物的重要分解者，其生长和代谢水平的高低将直接影响污水处理的效果。研究表明，纳米材料的存在会显著抑制活性污泥中微生物尤其是脱氮微生物的生长代谢，从而会影响污水的脱氮效果，对污水处理厂的稳定运行带来潜在危害。

目前缓解或消减纳米材料对生物脱氮系统的影响主要有两种方式。一种是通过通过改变纳米材料的结构特性来实现。然而，纳米材料的掺杂或改性会改变纳米材料自身的特性，这对纳米材料的应用范围会产生一定的影响。另一种方式是发现和培殖具有纳米材料耐受能力的功能微生物，这种方式不改变纳米材料的特性，且会使整个污水生物处理系统具有较好的处理效果和较强的抗冲击能力，是一种较为可行的方法，但是在实际应用过程中，符合条件的微生物较为稀少，难以满足日益增长的现实需要。

因此，发明人考虑，如果能够筛选出抵抗纳米材料生物毒性能力脱氮功能菌，其应用将会有效削减纳米材料对污水生物脱氮过程的潜在风险。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种耐受纳米二氧化钛的高效好氧脱氮菌株，通过该菌株强化污水处理系统的生物脱氮效果，以削减纳米二氧化钛的存在对污水处理生物脱氮过程的影响。

本发明所提供的菌株，为一株施氏假单胞菌(p.stutzeri)，是一株具有在单一好氧环境中实现硝酸盐氮高效去除能力的好氧反硝化细菌。

本发明通过下述技术方案予以实现：

本发明提供的具有纳米二氧化碳耐受能力的施氏假单胞菌(pseudomonasstutzeri)，于2017年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，，其保藏号为cgmccno.14062。

如上所述的施氏假单胞菌(p.stutzeri)，其特征在于废水中存在纳米二氧化钛的条件下，纳米颗粒会吸附在菌体表面，菌株p.stutzeri能够保持完整的细胞结构，细胞膜不被破坏。

如上所述的施氏假单胞菌(p.stutzeri)，其特征在于废水中存在低浓度水平的纳米二氧化钛的条件下(<4mg/l)，该菌株能够以硝酸盐氮为唯一氮源，在好氧环境下硝酸盐氮的去除率可达100％，总氮的去除率可达85％以上。

如上所述的施氏假单胞菌(p.stutzeri)，其特征在于废水中存在低浓度水平的纳米二氧化钛的条件下(4-128mg/l)，该菌株能够以硝酸盐氮为唯一氮源，在好氧环境下硝酸盐氮的去除率可达100％，总氮的去除率同样可达100％。

本发明的施氏假单胞菌及其应用与现有技术相比较有如下有益效果：

(1)根据发现的施氏假单胞独特的生理特征，实现了对纳米二氧化钛毒性的耐受，解决了纳米材料的存在对生物脱氮过程的潜在影响。

(2)采用本发明，通过将该菌株接种到传统活性污泥法的二级生化处理系统，在纳米氧化锌浓度为0～150mg/l存在条件下，优选的，在0～128mg/l存在条件下，硝酸盐氮的去除率可达100％，说明菌株具有较强的耐受纳米材料毒性和好氧反硝化能力。这种特性使得该菌株在城镇污水处理系统的实用性大大增强。

(3)本发明便捷灵活，应用前景广阔，具有很好的社会效益。

下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。本领域的普通技术人员可以理解，实施例仅仅是举例说明的目的，本发明的范围并不以具体实施方法为限，而是由权利要求的范围加以限定。

附图说明

图1：图1为施氏假单胞菌在纳米二氧化钛存在条件下的扫描电镜图像。

图2：图2为施氏假单胞菌在1mg/l纳米二氧化钛存在条件下的脱氮特性。

图3：图3为施氏假单胞菌在4mg/l纳米二氧化钛存在条件下的脱氮特性。

图4：图4为施氏假单胞菌在16mg/l纳米二氧化钛存在条件下的脱氮特性。

图5：图5为施氏假单胞菌在64mg/l纳米二氧化钛存在条件下的脱氮特性。

图6：图6为施氏假单胞菌在128mg/l纳米二氧化钛存在条件下的脱氮特性。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述：

实施例1

一、利用扫描电镜观察施氏假单胞菌在纳米二氧化钛存在时的表观形态

本实验所用高效好氧反硝化菌株为施氏假单胞菌p.stutzeri，其分离自垃圾填埋场渗滤液处理系统。

将施氏假单胞菌p.stutzeri接种于1l含0.5gkno3和0.35gnh4cl的lb培养基中(每升含nacl5g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g)，防止杂菌的侵入及保持菌体的生长活力，进行富集培养。将培养得到的菌液离心，用0.5％的nacl洗涤三次，制成光密度od600为1-2的菌悬液。然后再将菌悬液按10％的接种量接种于含有16mg/l纳米tio2的培养基中，8h后取样在8000rpm和4℃条件下离心5min去除上清液，并用pbs(磷酸盐缓冲液)清洗两次。用2.5％戊二醛固定1h，乙醇梯度洗脱后分散在无水乙醇中，取少量滴在硅片上晾干，在扫描电镜(sem)下观察细胞形态。

结果如图1所示，当纳米tio2浓度为16mg/l时，菌株p.stutzeri呈现完整和光滑的表面，说明菌株细胞形态对纳米tio2具有较强的耐受性。

实施例2

二、施氏假单胞菌在1mg/l纳米二氧化钛存在条件下的脱氮特性

将富集培养后的菌悬液按照10％的接种量接种于含有1mg/l纳米tio2的bm培养基中，每隔4h取样2ml，取样在8000rpm和4℃条件下离心5min，上清液用于各种含氮化合物浓度的测定。反硝化性能测试培养基(bm)配方为每升水中：8.45gch3coona,0.61gnano3,1.76gk2hpo4·3h2o,0.20gmgso4·7h2o,0.02gcacl2,0.005gfeso4·7h2o,0.1ml微量元素溶液。将培养基ph值调至7.5，在121℃灭菌30min。

如图2所示，当纳米纳米tio2的浓度为1mg/l时，硝酸盐氮可以在28h内全部去除。在硝酸盐氮的去除过程中，伴随了亚硝酸盐氮的积累，在16h亚硝酸盐氮的积累量达到最大，具体数值为65.7mg/l。随着反应的继续进行，亚硝酸盐氮逐渐被施氏假单胞菌所降解，48h后浓度降低至8.0mg/l。以硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的综合代表系统中的总氮，在这一条件下，总氮的去除率可达92.4％，说明菌株实施假单胞菌对纳米tio2有较好的耐受性。

实施例3

三、施氏假单胞菌在4mg/l纳米二氧化钛存在条件下的脱氮特性

将富集培养后的菌悬液按照10％的接种量接种于含有4mg/l纳米tio2的bm培养基中，每隔4h取样2ml，取样在8000rpm和4℃条件下离心5min，上清液用于各种含氮化合物浓度的测定。

如图3所示，当纳米tio2的浓度为4mg/l时，硝酸盐氮可以在28h内全部去除。在硝酸盐氮的去除过程中，伴随了亚硝酸盐氮的积累，在20h亚硝酸盐氮的积累量达到最大，具体数值为64.8mg/l。随着反应的继续进行，亚硝酸盐氮逐渐被施氏假单胞菌所降解，48h后浓度降低至16.2mg/l。以硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的综合代表系统中的总氮，在这一条件下，总氮的去除率可达84.6％。在此浓度水平下的总氮去除率稍低于纳米tio2的浓度水平为1mg/l时的状况，但菌株施氏假单胞菌还是能够实现对氮素的高效去除。

实施例4

四、施氏假单胞菌在16mg/l纳米二氧化钛存在条件下的脱氮特性

将富集培养后的菌悬液按照10％的接种量接种于含有16mg/l纳米tio2的bm培养基中，每隔4h取样2ml，取样在8000rpm和4℃条件下离心5min，上清液用于各种含氮化合物浓度的测定。

如图4所示，当纳米tio2的浓度为16mg/l时，硝酸盐氮可以在20h去除率达100％。在硝酸盐氮的去除过程中，伴随了亚硝酸盐氮的积累，在12h亚硝酸盐氮的积累量达到最大，具体数值为65.3mg/l。随着反应的继续进行，亚硝酸盐氮逐渐被施氏假单胞菌所降解，48h后亚硝酸盐被完全去除。以硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的综合代表系统中的总氮，在这一条件下，总氮的去除率可达100％。说明在高浓度水平的纳米tio2条件下，菌株施氏假单胞菌对纳米tio2具有更强的耐受能力。

实施例5

五、施氏假单胞菌在64mg/l纳米二氧化钛存在条件下的脱氮特性

将富集培养后的菌悬液按照10％的接种量接种于含有64mg/l纳米tio2的bm培养基中，每隔4h取样2ml，取样在8000rpm和4℃条件下离心5min，上清液用于各种含氮化合物浓度的测定。

如图5所示，当纳米tio2的浓度为64mg/l时，硝酸盐氮可以在16h去除率达100％。在硝酸盐氮的去除过程中，伴随了亚硝酸盐氮的积累，在12h亚硝酸盐氮的积累量达到最大，具体数值为65.8mg/l。随着反应的继续进行，亚硝酸盐氮逐渐被施氏假单胞菌所降解，24h后亚硝酸盐被完全去除。以硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的综合代表系统中的总氮，在这一条件下，总氮的去除率可达100％。说明菌株施氏假单胞菌对高浓度纳米tio2具有更强的耐受能力。

实施例6

六、施氏假单胞菌在128mg/l纳米二氧化钛存在条件下的脱氮特性

将富集培养后的菌悬液按照10％的接种量接种于含有128mg/l纳米tio2的bm培养基中，每隔4h取样2ml，取样在8000rpm和4℃条件下离心5min，上清液用于各种含氮化合物浓度的测定。

如图5所示，当纳米tio2的浓度为128mg/l时，硝酸盐氮可以在10h内被完全去除。在硝酸盐氮的去除过程中，伴随了亚硝酸盐氮的积累，在12h亚硝酸盐氮的积累量达到最大，具体数值为65.8mg/l。随着反应的继续进行，亚硝酸盐氮逐渐被施氏假单胞菌所降解，20h后亚硝酸盐被完全去除。以硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的综合代表系统中的总氮，在这一条件下，总氮的去除率可达100％。说明浓度越高，菌株施氏假单胞菌对高浓度纳米tio2的耐受能力越强(见表1)。

表1施氏假单胞菌在不同浓度纳米二氧化钛存在条件下的脱氮特性

实施例7

七、施氏假单胞菌在含纳米二氧化钛废水中的应用

将施氏假单胞菌投加入活性污泥系统处理含纳米二氧化钛废水，连续曝气保持体系溶解氧为6mg/l，废水水质如下：ph为7.5，硝酸盐氮含量100mg/l，纳米二氧化钛1mg/l。在普通活性污泥系统内，脱氮的效果在纳米二氧化钛存在的条件下受到了较大的影响。然而，经施氏假单胞菌强化后的系统，24h的硝酸盐氮去除率可达79.3％，总氮去除率可达61.7％；36h的硝酸盐氮去除率为96.4％，总氮去除率为90.1％(见表2)。

表2施氏假单胞菌pcn-1应用于活性污泥体系中的生物脱氮结果

应当说明的是，以上实施例只是为了对本发明作进一步详细的描述，不是用来对本发明进行限定的，在不脱离本发明的构思和精神的范围内，本领域普通技术人员，可以进行各种改进或变化，仍然属于本发明所附的权利要求的保护范围。