本发明属于抗氧化肽制备技术领域，具体涉及一种利用鳕鱼加工副产物制备抗氧化肽的方法。
背景技术：
抗氧化剂近些年来在国内外发展很快，用途也越来越广。自从harman提出自由基理论以来，人们认识到人体内氧化产生的自由基与人的衰老和许多疾病有关，因此抗氧化剂不仅用于含脂肪食品的抗氧化，而且作为功能因子用于保健食品及化妆品等的开发。
抗氧化剂的种类很多，然而化学合成的抗氧化剂如bha、bht等，由于其本身具有毒、副作用，各国政府纷纷对其强制规定了adi值，控制其过量添加。抗氧化活性多肽由于低毒、高效等特点，作为食品和机体的抗氧化剂，是近年来国内外科学工作者们较热的研究课题，这些研究使人们对多肽的生物活性有了新的认识，也为保健食品的开发提供了一个有前途的基料。目前已有多种具有抗氧化作用的海洋生物活性肽从海洋生物中分离得到，如海绵多肽、海鞘多肽、海参多肽和扇贝肽等。
海洋蛋白质资源品质极高，且包含有多种生物活性序列，近年来研究发现，蛋白质酶解有助于改善其营养价值和功能特性。多肽具有比蛋白质易于消化吸收、能迅速给机体提供能量、无蛋白质变性、分子量小、易溶于水等特点。蛋白酶水解法是提取水解鱼蛋白的主要方法。蛋白酶水解法制得产物具有很高的营养价值和良好的理化性质。此外,蛋白质经消化道酶促水解后主要以小肽的形式吸收，比完全游离氨基酸具有更好的的吸收利用、抗氧化等多种功能。开发海洋蛋白水解物和分离活性肽物质引起了人们的广泛兴趣。向海洋索取食物、获得生物活性多肽已成为世界各沿海国家海洋开发的一项重要内容。
我国鳕鱼年加工量40～50万吨，在鳕鱼食品加工过程中产生的鱼皮、鱼骨、碎肉等副产物中含有大量的优质蛋白。目前鳕鱼加工产业主要围绕生产鱼片和鱼糜进行，产生的废弃物如皮、骨、鳍等尽管营养价值相当高，但仅有少量部分被用于生产饲料外，大部分被丢弃，造成环境污染。因此利用鳕鱼排制备活性肽，能变废为宝，增加附加值。另一方面新型海洋活性肽资源的开发。天然活性肽在生物体中含量较少，分离成本高，价格昂贵。化学方法合成的活性肽，副反应及副产物较多，限制了其应用和发展。采用有效地酶解手段来释放、富集或浓缩目标活性肽成为新型海洋活性肽资源开发的主力军。值得注意的是鳕鱼排来自深海资源，无论是从疯牛病的角度，还是从民族宗教的角度考虑，都显示其巨大优势。
国内关于利用蛋白酶水解鳕鱼排制取抗氧化肽的研究未见报道。来自鳕鱼排的抗氧化肽，安全性高，无毒副作用。利用鳕鱼排开发具有清除自由基、延缓衰老作用的抗氧化肽具有重要的理论依据和应用价值。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种利用鳕鱼排制备抗氧化肽的方法，本发明的制备方法工艺简单、反应温度低，以鳕鱼加工副产物鳕鱼排为原料，成本低廉，在避免对环境污染的同时，加强了对鳕鱼排中蛋白质资源的综合利用，制得的抗氧化肽安全性高，无毒副作用，清除自由基能力强，具有很好的保健功效。
本发明利用鳕鱼加工副产物制备抗氧化肽的方法，包括如下的步骤：
1)将鳕鱼加工副产物鳕鱼排清洗去除残余内脏和鱼皮，在100～130℃下高温高压蒸煮10～40分钟后进行匀浆，将获得的固形物和水按1:1～4加水配制成鳕鱼排匀浆液；
2)将鳕鱼排匀浆液的ph调节到6.0～10.0，然后加入蛋白酶1500～4000u/g，在20～70℃水浴中水解1～8小时得到鳕鱼排蛋白水解液；
3)将鳕鱼排蛋白水解液于85～100℃水浴灭活蛋白酶5～15分钟，冷却至室温后，在2000～6000r/min转速下离心5～15分钟，取上清液；用截留分子量≤10000da的超滤膜进行超滤，得到鳕鱼排蛋白多肽超滤液；
4)将鳕鱼排蛋白多肽超滤液液进行减压蒸发浓缩和真空冷冻干燥，得到鳕鱼排抗氧化肽产品。
其中步骤2)所述的蛋白肽为胰酶。
作为优选，所述的步骤1)中是在120℃下高温高压蒸煮30分钟，用匀浆机匀浆，固形物和水按1:4加水配制成鳕鱼排匀浆液；
步骤2)中是将鳕鱼排匀浆液的ph调节到8.18，然后加入蛋白酶2985u/g，在43.74℃水浴中水解5小时，水解在震荡状态下进行，并保持温度和ph恒定，得到鳕鱼排蛋白水解液；
步骤3)中是将鳕鱼排蛋白水解液于100℃水浴灭活蛋白酶10分钟，冷却至室温后，在4000r/min转速下离心10分钟，取上清液，用截留分子量为5000da的超滤膜进行超滤，得到鳕鱼排多肽超滤液；
步骤4)中是将鳕鱼排蛋白多肽超滤液液进行减压蒸发浓缩和真空冷冻干燥，得到鳕鱼排抗氧化肽产品。
本发明制备的具有清除自由基功能的抗氧化肽分子量较低，极易被人体吸收和利用，活性比较稳定，能够有效地提高免疫力，在保健品领域有着广阔的市场前景。同现有的抗氧化剂比较，本发明的原料丰富易得，所用鳕鱼排为鳕鱼加工的副产物，成本低廉，增加了鳕鱼产品的附加值，并且避免了对环境造成污染；制得的抗氧化肽分子量较低，可快速进入血液循环被人体吸收利用，活性稳定；产品抗氧化效果好，清除自由基能力较强，能有效增强免疫力；抗氧化肽是采用食品级酶在温和条件下获得的，安全性高，无毒副作用，为食品、化妆品、医药等行业提供优质的抗氧化肽。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：
a)将鳕鱼加工副产物鳕鱼排清洗去除残余内脏和鱼皮，120℃下高温高压蒸煮30分钟，用匀浆机匀浆，固形物和水按1:4加水配制成鳕鱼排匀浆液；
b)将鳕鱼排匀浆液的ph调节到8.00，然后加入蛋白酶3000u/g，在40℃水浴中水解5小时，水解在震荡状态下进行，并保持温度和ph恒定，得到鳕鱼排蛋白水解液；
c)将鳕鱼排蛋白水解液于100℃水浴灭活蛋白酶10分钟，冷却至室温后，在4000r/min转速下离心15分钟，取上清液，用截留分子量为5000da的超滤膜进行超滤，得到鳕鱼排多肽超滤液；
d)将鳕鱼排蛋白多肽超滤液液进行减压蒸发浓缩和真空冷冻干燥，得到鳕鱼排抗氧化肽产品。
通过验证实验，所制得的鳕鱼排蛋白多肽超滤液通过高效液相色谱法进行分子量测定其中多肽分子量为506d，含量可达131.65mg/ml。通过对dpph、氢自由基和超氧阴离子的清除率检测来评定其抗氧化活性。
1)对dpph·自由基清除率的测定
dpph·是一种稳定的以氮为中心的质子自由基，在517nm波长处有最大吸收，与抗氧化剂反应时，其孤对电子与抗氧化剂中的电子配对使其乙醇溶液由紫色褪色成黄色，褪色程度反映出抗氧化剂的活性强弱。向不同试管加入等体积dpph溶剂、不同浓度的鳕鱼排蛋白肽，混匀后25℃反应30min，在517nm下测定其od值，平行做3次取平均值。结果显示当鳕鱼排蛋白肽浓度达到20mg/ml时，其dpph的清除率可达90.3％，其对dpph·清除率的ic50(清除率达50％时的样品浓度)与天然抗氧化物质ve的6mg/ml无显著差异，显著高于文献报道的鳕鱼皮胶原蛋白肽在30mg/ml时，清除率为73.84％和牛骨胶原蛋白肽的80g/l时的27.03％，说明鳕鱼排蛋白肽有较强的清除dpph的能力。
2)对oh自由基清除率的测定
oh的检测在自由基损伤研究中有着重要的意义，常作为判断待测物是否具有抗氧化性的指标。检测试剂加入鳕鱼排蛋白肽后将溶液混合均匀，37℃水浴保温30min，在510nm下测定其od值，平行做3次取平均值。结果显示鳕鱼排蛋白肽的浓度达到20mg/ml时，其羟自由基清除率达到80.6％。较好于文献报道的鳕鱼皮胶原蛋白肽30mg/ml时85.76％和牛骨胶原蛋白肽80g/l的99.55％，由此可见，鳕鱼皮胶原蛋白肽具有抢的羟自由基的清除能力。
3)对o2-·自由基清除率的测定
邻苯三酚在弱碱条件下发生自氧化反应产生o2-·，o2-·清除剂能使邻苯三酚自氧化产物在325nm处吸收峰受到抑制。检测试剂加鳕鱼排蛋白肽后将溶液混合均匀，于325nm下测定其od值，平行做3次取平均值。结果显示，随着鳕鱼排蛋白肽浓度的增加，其超氧阴离子的清除率也随之增加，当鳕鱼排蛋白肽达到20mg/ml时，其超氧阴离子清除率为65.4％。较好于鳕鱼皮胶原蛋白肽30mg/ml时，清除率64.09％；而牛骨胶原蛋白肽在80g/l的浓度下，清除率为63.86％，说明鳕鱼排蛋白肽对o2-·的清除能力相对较强。
由此可见，鳕鱼排蛋白肽对于三种自由基的清除能力较强。利用鳕鱼排进行抗氧化肽的研发并将其应用于功能性食品、化妆品及生物制药等方面具有很好的潜力。
实施例2：
将鳕鱼加工副产物鳕鱼排清洗去除残余内脏和鱼皮，100℃下高温高压蒸煮20分钟，用匀浆机匀浆，固形物和水按1:4加水配制成鳕鱼排匀浆液；
将鳕鱼排匀浆液的ph调节到9.0，然后加入蛋白酶4000u/g，在50℃水浴中水解3小时，水解在震荡状态下进行，并保持温度和ph恒定，得到鳕鱼排蛋白水解液；
将鳕鱼排蛋白水解液于85℃水浴灭活蛋白酶15分钟，冷却至室温后，在6000r/min转速下离心10分钟，取上清液，用截留分子量为5000da的超滤膜进行超滤，得到鳕鱼排多肽超滤液；
将鳕鱼排蛋白多肽超滤液液进行减压蒸发浓缩和真空冷冻干燥，得到鳕鱼排抗氧化肽产品。
通过验证实验，所制得的鳕鱼排蛋白多肽超滤液中多肽分子量为521d，含量可达126.94mg/ml，d当鳕鱼排蛋白肽浓度为20mg/ml时，其dpph清除率为88.5％、羟自由基的抑制率为79.6％、超氧阴离子的抑制率为61.2％。