一种用于园林废弃物降解的复合微生物菌剂、制备方法和应用与流程

本发明属于环境保护
技术领域：
，具体涉及复合微生物菌剂，以及其制备方法和应用。
背景技术：
：随着城市化进程的加快以及城市园林绿地面积的持续增加，在改善环境的同时也产生大量如枯枝落叶等废弃物，产生安全隐患，给生态环境造成一定影响。利用微生物菌剂作为腐熟发酵剂接种园林废弃物进行堆肥化处理，可以实现园林废弃物大量快速腐熟，增强肥效，改善土壤微生物区系，消减病原菌及重金属污染等，是一种有效的废弃物处理和资源利用方式。然而现有技术中存在的多为针对农业废弃物堆肥的处理，且处理中常需添加粪便、污泥、沼渣、餐厨垃圾等增强腐熟效果，调节养分平衡。但这些物质的添加也常常带来病原菌及重金属污染难以去除等问题。目前，缺乏针对无添加的纯园林废弃物安全高效降解且能在产业上成功应用的微生物菌剂。技术实现要素：为解决现有技术的不足，本发明提供了一种复合微生物菌剂，用于园林废弃物降解。所述复合微生物菌剂中各菌种协同作用，能有效降解转化园林废弃物。本发明的复合微生物菌剂可直接用于园林废弃物降解，无需添加其他养料或微生物菌种或菌剂，能安全高效地降解园林废弃物。本发明还涉及所述复合微生物菌剂的制备方法。本发明还涉及使用所述复合微生物菌剂降解园林废弃物的方法。本发明还涉及一种肥料，其使用所述复合微生物菌剂降解园林废弃物后得到的产物制备而成。本发明的复合微生物菌剂中使用的暹罗芽孢杆菌(bacillussiamensis)、特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)为本领域中首次使用于降解园林废弃物，其能单独地降解园林废弃物或与其他菌种协同作用显著地降解园林废弃物，其也能用于降解具有与园林废弃物相似组成的废弃物，例如农业植物纤维性废弃物。附图说明图1a为本发明复合微生物菌剂中各单独菌株和复合微生物菌剂分别在不同纤维素刚果红培养基平板上产生的降解圈大小照片；图1b为本发明复合微生物菌剂中各单独菌株和复合微生物菌剂在同一纤维素刚果红培养基平板上产生的降解圈大小照片；图2为堆肥中添加本发明复合微生物菌剂实验组x组和空白对照ck组温度随时间变化图；图3a为堆肥中添加本发明复合微生物菌剂实验组x组和空白对照ck组中有机质含量随时间变化图；图3b为实验组x组和ck组中n元素含量随时间变化图；图3c为实验组x组和ck组中总p含量随时间变化图；图3d为实验组x组和ck组中总k含量随时间变化图；图4a为堆肥中添加本发明复合微生物菌剂实验组x组和空白对照ck组中碳氮比(c/n)随时间变化图；图4b为堆肥中添加本发明复合微生物菌剂实验组x组和空白对照ck组中e4/e6值随时间变化图；图5为发芽实验结束后1号菌肥组、2号菌肥组以及空白对照组三组发芽种子照片；图6为番茄盆栽实验a～g组不同时期：(a)1周、(b)第56天、(c)第70天、(d)第105天生长情况；图7为番茄盆栽实验a～g组番茄植株第42天生长情况；图8为番茄盆栽实验a～g组番茄植株不同时期，第1天至第112天茎高和茎粗变化情况。具体实施方式以下，对本发明的实施方式进行说明。术语“园林废弃物”指城市绿化中收集来的树枝、落叶、草坪修剪物，经粉碎处理。术语“农业植物纤维性废弃物”指农田和果园残留物，如秸秆、残株、杂草、落叶、果实外壳、藤蔓、树枝和其他废物；以及植物类农产品加工废弃物，可经粉碎性处理。本发明涉及一种制备复合微生物菌剂的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌(bacillussiamensis)和特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)四种菌种挑取单菌落分别接种于液体培养基中，30-37℃，130-150r/min培养24小时，将黄孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium，现在其中文学名叫作异原黄孢原毛平革菌拉丁名变为phanerodontiachrysosporium，但商品菌种及文献资料中仍然广泛应用原名称，本文亦采用原名称黄孢原毛平革菌)接种于液体培养基中，28-30℃，130-150r/min培养48小时；步骤(2)将所述步骤(1)中收获的所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌和特基拉芽孢杆菌分别以1％的接种量接种同一液体培养基中，在45℃，130-150r/min条件下再发酵24小时，将步骤(1)中收获的所述黄孢原毛平革菌以2％的接种量接种液体培养基中，在45℃，130-150r/min条件下再发酵24小时；步骤(3)将所述步骤(2)中收获的所述四种细菌的混合培养物和收获的所述黄孢原毛平革菌培养物按照体积比1:1的比例混合得到所述复合菌液；步骤(4)将载体灭菌；以及步骤(5)将所述步骤(3)中混合好的所述复合菌液稀释，与所述灭菌的载体混合均匀，经固体发酵烘干后得到所述复合微生物菌剂。本发明制备复合微生物菌剂的方法，操作步骤简单，其制备的复合微生物菌剂中各菌株能协同作用，不需添加其他菌种或营养物质，安全高效降解园林废弃物等以植物纤维成分为主的废弃物。作为本发明的一种实施方式，本发明的制备复合微生物菌剂的方法中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌cicc10088；所述地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌cicc10095；所述暹罗芽孢杆菌为暹罗芽孢杆菌bncc210681和所述特基拉芽孢杆菌为特基拉芽孢杆菌cicc10832；所述黄孢原毛平革菌为黄孢原毛平革菌cicc40719。作为本发明的一种实施方式，本发明的制备复合微生物菌剂的方法中，所述步骤(1)、所述步骤(2)中的液体培养基成分包括马铃薯20％，蔗糖1％，葡萄糖1％，胰蛋白胨0.3％，酵母浸粉0.3％，ph为6.8。本发明所用液体培养基成分和配比如下：马铃薯20％，蔗糖1％，葡萄糖1％，胰蛋白胨0.3％，酵母浸粉0.3％以及余量的水组成，将马铃薯清洗后，切块，按200g/1l比例加入清水，煮沸，过滤，滤液中添加其他组分并补足相应水量，调节ph值为6.8，于121℃，灭菌20分钟。作为本发明的一种实施方式，本发明制备复合微生物菌剂的方法中，所述步骤(1)中将所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌和特基拉芽孢杆菌四种菌种分别接种于液体培养基中，37℃，130r/min培养24小时，将所述黄孢原毛平革菌接种于液体培养基中，30℃，130r/min培养48小时；所述步骤(2)中将所述步骤(1)中收获的所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌和特基拉芽孢杆菌分别以1％的接种量接种同一液体培养基中，在45℃，130r/min条件下再发酵24小时，将所述步骤(1)中收获的所述黄孢原毛平革菌以2％的接种量接种液体培养基中，在45℃，130r/min条件下再发酵24小时。作为本发明的一种实施方式，本发明的制备复合微生物菌剂的方法中，所述步骤(4)中所述载体经粉碎后灭菌，所述灭菌条件为121℃灭菌20min，灭菌后的载体ph7.5，置于无菌环境冷却至40-50℃；所述步骤(5)中所述复合菌液稀释倍数为10倍，稀释后的复合菌液置于45℃，130r/min条件下震荡30min后再与所述载体混合，所述固体发酵条件为45℃、发酵48小时。作为本发明的一种实施方式，本发明制备复合微生物菌剂的方法中，所述步骤(3)混合得到所述复合菌液之后，在进行所述固体发酵之前还包括复合菌液的发酵优化步骤：优化发酵条件为45℃，130r/min持续震荡，发酵培养60h。本发明制备复合微生物菌剂的方法中，经过优化发酵后，提高了各菌株的生物活性，更好的激发后续的降解过程，且该优化发酵无需添加其他营养物质和助剂，操作简便。作为本发明的一种实施方式，本发明制备复合微生物菌剂的方法中，所述载体为木屑、麸皮或粉碎的园林废弃物，所述园林废弃物为收集来的树枝、落叶、草坪修剪物。本发明还涉及使用本发明所述制备方法制备的复合微生物菌剂，所述复合微生物菌剂由复合菌液和载体组成，所述复合菌液由枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液、暹罗芽孢杆菌菌液、特基拉芽孢杆菌菌液和黄孢原毛平革菌菌液组成。枯草芽孢杆菌菌液、地衣芽孢杆菌菌液、暹罗芽孢杆菌菌液、特基拉芽孢杆菌菌液与黄孢原毛平革菌菌液的体积比例为1:1:1:1:4。本发明的复合微生物菌剂中使用的暹罗芽孢杆菌(bacillussiamensis)、特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)为本领域中首次使用于降解园林废弃物，复合微生物菌剂各菌种协同作用发挥显著降解作用。其也能用于降解其他纤维性废弃物。作为本发明的一种实施方式，本发明的复合微生物菌剂的方法中，将所述复合菌液与灭菌的所述载体按照体积/重量比3:2混合均匀，然后经固体发酵烘干而成。本发明还涉及一种使用所述的复合微生物菌剂处理园林废弃物或农业植物纤维性废弃物的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)粉碎园林废弃物或农业植物纤维性废弃物；以及步骤(2)将所述复合微生物菌剂与所述粉碎的园林废弃物或农业植物纤维性废弃物按照1：12的比例混合，调节终含水率至53-55％，进行发酵，每3天进行一次翻堆，每7天按照上述比例添加一次复合微生物菌剂，在整个实验期间将堆肥体系含水率始终保持在53-55％；以及步骤(3)当所述体系温度高于50℃且维持7天以上被认为所述堆肥体系发酵腐熟完全。作为本发明的一种实施方式，本发明所述的复合微生物菌剂处理园林废弃物或农业植物纤维性废弃物的方法中，所述步骤(2)中调节终含水率至54％，在整个实验期间将堆肥体系含水率始终保持在54％。本发明还涉及一种肥料，其中，所述肥料包含所述处理方法处理园林废弃物或农业植物纤维性废弃物后的产物。本发明使用处理园林废弃物或农业植物纤维性处理后产物制备的肥料，其有机物的大分子成分发酵完全，有害成分含量低，能有效促进植物的生长和发育。本发明还涉及所述肥料的应用，所述的肥料用于植物种苗的培育，所述肥料与土壤比例为1:2～2:1；肥料与土壤比例优选为1:1。使用本发明的肥料进行植株的培育，能有效促进植株的生长和发育，提高生长指标和结实率。下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。本发明实施例中使用枯草芽孢杆菌cicc10088、地衣芽孢杆菌cicc10095、特基拉芽孢杆菌bacillustequilensiscicc10832和黄孢原毛平革菌cicc40719、暹罗芽孢杆菌bacillussiamensisbncc210681各菌株为例说明本发明，上述菌株并非用于限定本发明。枯草芽孢杆菌cicc10088、地衣芽孢杆菌cicc10095、特基拉芽孢杆菌bacillustequilensiscicc10832和黄孢原毛平革菌cicc40719于2015年10月购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)，暹罗芽孢杆菌bacillussiamensisbncc210681于2015年9月购自苏州北纳创联生物技术有限公司。实施例1本发明复合微生物菌剂的制备1.1液体培养基的制备本发明所用液体培养基成分和配比如下：马铃薯20％，蔗糖1％，葡萄糖1％，胰蛋白胨0.3％，酵母浸粉0.3％以及余量的水组成，将马铃薯清洗后，切块，按比例加入清水(200g/1l)，煮沸，过滤，滤液中添加其他组分并补足相应水量，调节ph值为6.8，于121℃，灭菌20分钟。1.2复合菌液的制备将枯草芽孢杆菌cicc10088、地衣芽孢杆菌cicc10095、暹罗芽孢杆菌(bacillussiamensis)bncc210681和特基拉芽孢杆菌(bacillustequilensis)cicc10832四种细菌分别挑取单菌落接种于1.1制备的液体培养基中，37℃，130r/min培养24小时；将黄孢原毛平革菌(真菌)cicc40719接种于液体培养基中，30℃，130r/min培养48小时，将发酵后各细菌菌种接种于同一液体培养基中进行共培养，各菌种接种量分别为1％(v/v)，黄孢原毛平革菌菌液单独接种于液体培养基中接种量为2％(v/v)。接种后的两种液体培养基在45℃，130r/min条件下再发酵24小时。1.3复合菌液的优化发酵将两种发酵后的液态培养基按1:1(v/v)进行混合，制成复合菌液。选择影响微生物混合菌液发酵条件最大的三个因素：培养温度、培养时间和震荡条件，设置三因素三水平的正交实验，根据响应面法得到的等高线图以及3d模型选择复合菌液的优化发酵条件，以使得菌株纤维素酶活力最大，最有利于降解木质纤维素。最终确定优化发酵条件为45℃，130r/min持续震荡60h。将步骤1.3中的复合菌液在45℃，130r/min条件下持续震荡60h。1.4复合微生物菌剂的制备将粉碎后木屑，经过10目筛网，放于121℃灭菌20min，调节ph为7.5，置于无菌环境冷却至40-50℃。将复合菌液用无菌水稀释10倍，置于45℃，130r/min条件下震荡30min。将震荡后的稀释菌液按照比例3:2(v/m)与灭菌冷却后木屑混合均匀，然后置于45℃、固体发酵烘干48小时，使菌株更好的附着于木屑上，之后得到干燥的复合微生物菌剂。实施例2本发明复合微生物菌剂降解实验室实验2.1纤维素刚果红培养基降解圈实验将枯草芽孢杆菌cicc10088、地衣芽孢杆菌cicc10095、暹罗芽孢杆菌bncc210681和特基拉芽孢杆菌cicc10832四种菌种分别接种于实施例1中1.1制备的液体培养基中，37℃，130r/min条件下培养24小时；将黄孢原毛平革菌bncc210681接种于实施例1中1.1制备的另一液态培养基中，在30℃，130r/min条件下培养48小时。将发酵后各细菌菌种接种于同一液体培养基中进行共培养，各菌种接种量分别为1％(v/v)，黄孢原毛平革菌菌液单独接种于液体培养基中接种量为2％(v/v)。接种后的两种液体培养基在45℃，130r/min条件下再发酵24小时。将上述细菌菌液和真菌按体积比1:1复合后制备复合菌液，将5种培养后的菌株与复合菌液分别按照实施例1.3复合菌液的优化发酵条件进行培养后，按照相同的80μl接种量分别接种于纤维素刚果红培养基平板，测量各菌株降解圈大小，结果见表1，降解圈照片见图1a、图1b。图1a为各菌株和制备的复合微生物菌剂分别在纤维素刚果红培养基平板上产生的降解圈大小照片，图1b为图1a中对应的各菌株和复合微生物菌剂在同一纤维素刚果红培养基平板上产生的降解圈大小照片。各菌株及其对应的编号见表1、表2。表1五种菌株菌液及其复合菌液产生的降解圈大小测定由图1a、图1b可知，复合微生物菌剂降解圈直径明显大于单株菌株降解圈直径，且复合微生物菌剂产生的降解圈透明度更高，说明复合微生物菌剂中各菌株协同作用，促进了对纤维素的降解过程，降解程度更加彻底，效果更加显著。2.2酶活测定实验表2五种菌株菌液及其复合菌液纤维素酶活测定对五株菌株的菌液及复合微生物菌剂运用dns法测定其纤维素酶活，详细结果见表2。由表2可知，复合微生物菌剂的纤维素酶活高于单株菌株纤维素酶活。说明多种菌株协同作用，促进自身生长和代谢，进一步提高了菌剂的纤维素酶活力和整体降解纤维素的能力。实施例3本发明复合微生物菌剂堆肥降解实验3.1实验材料和程序本实施例采用的堆肥材料为复合多种植物枯叶，来源于北京市西城区万寿公园。将枯叶集中收集后进行粉碎处理，叶片平均大小0.5cm×0.5cm。设置空白组ck和实验组x，每组分别设定三组平行试验。各组枯叶堆体质量统一为200kg，体积约为0.8m3，初始含水率为8.32％，初始ph值约为7.7。实验组按照接种量1:12将实施例1制备的复合微生物菌剂接种于x组的枯叶堆体中，空白对照组加等量木屑，分别混合搅拌均匀，调节两组堆肥终含水率，使两组含水率统一至54％，进行堆肥实验。在堆肥发酵过程中，每3天进行一次翻堆，每7天按照上述比例添加一次微生物菌剂。将堆肥体系含水率始终保持在54％左右。当堆肥体系温度高于50℃且维持7天以上被认为堆肥发酵腐熟完全。3.2理化因子测量方法3.2.1温度温度是体现堆肥发酵程度最直观最重要的指标。在ck组和x组的每堆堆肥中，上、中、下三个部位分别放置三支温度计。每隔24h测量一次温度情况并取各温度的平均值作为当日堆肥温度。同时在堆肥外界环境放置三支温度计，每日同一时间测定外界环境温度情况。3.2.2元素含量根据堆肥发酵过程中温度变化情况，在特定温度下从堆肥中取样并保存于-80℃冰箱中。对保存于-80℃的样品进行检测。样品中常量元素(有机质(总碳)、总氮、总磷、总钾)，重金属元素(铬、镉、砷、铅、汞)和营养元素(镍、铜、锌)含量测定由中国农业科学院农业资源与农业区划研究所实验室进行检测。3.2.3腐熟度腐熟度由c/n和e4/e6两个指标进行表示。根据有机质和总氮的测定，c/n可通过计算得出(具体方法参照鲍世旦主编《土壤农化分析》，中国农业出版社)。e4/e6的测定样品处理方法如下：每隔三天从堆肥体系中取5g新鲜样品进行测定。将5g样品放入150ml锥形瓶中，加入50ml无菌水，封口后放入30℃，130r/min摇床中震荡2h。结束后取出锥形瓶静置30min，取上清液测定其在465nm和665nm下的吸光度，并计算其比值。两组最终结果分别取其平行实验的平均值。3.2.4有效活菌数按照国家农用微生物菌剂标准(gb20287-2006)测定本复合微生物菌剂的有效活菌数；按照生物有机肥相关标准(ny884-2012)测定堆肥后微生物菌肥的有效活菌数。3.3测量结果和分析3.3.1温度温度变化见图2。其间堆肥温度变化范围在28-65℃之间，变化趋势明显。整个堆肥过程经历了5个阶段：升温期、高温期(>55℃)、稳定期(50-55℃)、中温期(40-50℃)和冷却期(<40℃)，当堆肥体系温度高于50℃且维持7天以上被认为堆肥发酵腐熟完全。实验结果显示，复合微生物菌剂的添加对于堆肥的稳定期和中温期有明显作用，由于菌剂中优良菌种的施加，在这两个阶段，x组温度明显高于ck组。菌剂的添加进一步提高了堆肥腐熟度。3.3.2元素含量堆肥常量元素(c、n、p、k)含量测定是检测堆肥发酵腐熟基础指标。如图3a，堆肥体系有机质含量(总碳含量)呈明显下降趋势。堆肥体系中，微生物通过协同作用，对木质纤维素等进行降解，从而使c元素大多以co2形式排放到体系外，整个体系总碳含量呈明显下降趋势。图3b显示n元素相对含量呈明显上升趋势。微生物利用有机物进行分解代谢，减少了堆体质量，从而使整个体系中总p和总k所占比例明显上升，提高了菌肥营养元素相对含量，具体变化见图3c、3d。3.3.3腐熟度(c/n和e4/e6)从图4a中可以看出，在整个堆肥反应过程中，c/n呈明显下降趋势。目前大多通过t＝(终点c/n比)/(初始c/n比)来评价堆肥腐熟度。针对堆肥的不同材料，当t值小于0.7时，可认为堆肥腐熟。如图4a中可见，ck和x初始比值分别为22.78和23.89，终点比值分别为15.80和14.63，因此tck＝0.694，tx＝0.612。虽然两组t值都低于0.7，但x组t值明显低于ck组，证明菌剂的添加使堆肥腐熟更加完全。图4b中显示，两组e4/e6值整体呈明显下降趋势，但曲线起伏明显，特别是x组曲线变化浮动十分显著。堆肥发酵初期，微生物生理代谢活跃，大量有机质被分解利用，同时形成大量酸性物质如乙酸等以及腐殖酸等大分子复合物，因此在前3天曲线呈明显下降趋势，ck组从4.40降到2.81，x组从4.41降到3.19。在此阶段堆体温度迅速上升达60℃以上，因此形成的酸性物质被大量挥发。在发酵的稳定期和中温期x组变化幅度明显大于ck组，可能由于菌种的强化作用使得堆肥体系有机物被更加彻底的分解，腐熟度不断提高。在堆肥发酵后期，ck和x两组的e4/e6值达到较低水平，分别为2.48和2.23，比初始值分别降低了1.93和2.18，因此在堆肥腐熟度方面x组优于ck组。3.3.4有效活菌数对复合微生物菌剂有效活菌数进行测定，测定结果约为2.15亿/g。根据农用微生物菌剂(gb20287-2006)的相关规定，粉状菌剂有效活菌数应不低于2亿/g，因此本发明复合微生物菌剂符合国家标准。对ck组和x组的园林废弃物进行堆腐，检测堆腐前后所得微生物菌肥有效活菌数，检测结果见表3。通过对ck组和x组两组堆肥反应前后样品中有效活菌数测定可知，空白组ck组和实验组x组在堆肥反应前，有效活菌总数基本相同。其中x组细菌略高于ck组，但ck组真菌略高于x组。经过高温发酵堆肥过程后，两组样品中有效活菌数差异明显。实验组x组中活菌数由0.328亿/g上升到0.789亿/g；空白对照ck组细菌上升幅度较小。实验组x中经过高温发酵过程，许多细菌如芽孢杆菌、放线菌如链霉菌等耐热或嗜热菌种大量繁殖，新陈代谢旺盛，促进了堆肥的腐熟，当堆肥温度降低后，许多中温菌或低温菌利用堆肥营养物质进一步进行生长代谢。随着堆肥不断发酵，温度逐渐下降，添加的强化菌株大量生长繁殖。最终有效活菌总数实验组x组(0.789亿/g)明显高于空白组ck组(0.413亿/g)，国家标准(ny884-2012)规定生物有机肥有效活菌数应大于等于0.2亿/g(实验组x组)。因此利用本发明微生物菌剂堆肥处理后，实验组x组菌株更多，有效活菌数明显提高，菌肥效果更加显著。表3堆肥有效活菌数对比结果因此，本发明复合微生物菌剂的添加强化了堆体优势降解菌，使病原菌和其他杂菌在竞争中逐渐退化，从而使整个发酵体系更加完整，提高堆肥基质的腐熟度。实施例4本发明复合微生物菌剂降解园林废弃物实验将收集的园林废弃物叶片和细枝粉碎至0.5cm×0.5cm大小。将实施例1制备的复合微生物菌剂按照接种量1:12接种于上述的粉碎的园林废弃物中，混合搅拌均匀，调节堆肥终含水率至53-55％，进行堆肥实验。在堆肥发酵过程中，每3天进行一次翻堆，每7天按照上述比例添加一次复合微生物菌剂，整个实验期间将堆肥体系含水率始终保持在53-55％左右。同时设定不加复合微生物菌剂的园林废弃物自然堆肥发酵降解为对照组。当堆肥体系温度高于50℃且维持7天以上被认为堆肥发酵腐熟完全。将使用本发明复合微生物菌剂的园林废弃物降解产物标记为1号菌肥，不加复合微生物菌剂的园林废弃物自然堆肥发酵降解产物标记为2号菌肥。本发明的复合微生物菌剂同样可以应用于农业植物纤维性废弃物降解处理，其处理条件可根据本领域常规知识经本领域技术人员进行调整。实施例5本发明复合微生物菌剂降解园林废弃物的菌肥发芽实验1.发芽率实验和发芽指数的测定发芽率和发芽指数是检测堆肥性质的最基本的指标。根据gb/t23486-2009的相关规定，分别对实施例4堆肥发酵的菌肥1和菌肥2测定发芽率和发芽指数，计算公式如下：发芽率(％)＝发芽数×100％/25发芽指数gi(％)＝(实验组发芽数×实验组平均根长)×100％/(对照组发芽数×对照组平均根长)相关研究表明，gi>50％时，可以判定堆肥产品基本无毒性；当gi在80-85％之间时，可以认为堆肥产品对植物没有毒性(zucconietal.,1985)。2.实验步骤按照固液比1:5(g/ml)，将1号和2号菌肥样品分别与无菌去离子水混合均匀，在30℃，130r/min条件下振荡24h后，用中速定性滤纸进行过滤，移除悬浮颗粒，吸取5ml滤液放入带有两张滤纸的90mm直径培养皿中。将25粒小白菜种子均匀置入培养皿中，并在25℃下，进行黑暗培养。同时设置空白对照组，空白对照组所用培养液为等量无菌去离子水。在培养过程中，每3小时向培养皿中加入菌肥滤液或者无菌去离子水(1.5ml/次)，以保证培养皿内种子发芽所需的湿度要求。每个实验组菌肥1号、菌肥2号和空白对照各设置3次重复。培养3天后，测定每个培养皿内的发芽数和根长。计算发芽率和发芽指数。3.实验结果3.1发芽率发芽实验结束后三组发芽种子照片见图5，1号菌肥三组实验(每个实验组共25粒种子)种子发芽数分别为25、24、25，发芽率为100％、96％、100％，也即1号菌肥平均种子发芽率为98.67％。2号菌肥三组实验种子发芽率分别为24、25、24，发芽率为96％、100％和96％，也即2号菌肥平均种子发芽率为97.33％。空白对照组平均种子发芽率为98.67％，与1号菌肥发芽率相同。三组的发芽率实验结果表明：1号菌肥发酵后，基质中的有机物被大量分解，更加有效地促进植物吸收利用。当菌肥滤液稀释后，小白菜种子不断吸收滤液中的营养物质以及水分，从而促进种子萌发和生长。2号菌肥是由粉碎的园林废弃物直接加入清水发酵而成，营养物质以及腐熟程度低于1号菌肥，因此发芽率低于1号菌肥。从图5中可看出，1号菌肥滤液比2号菌肥滤液颜色浅，说明1号菌肥中大分子复合物大多被分解，许多不利于微生物和植物代谢吸收的大分子物质被分解，从而使滤液中多为可溶性小分子物质，有利于促进种子萌发生长。2号菌肥发酵腐熟度低于1号菌肥，部分大分子物质仍然未被分解，从而使菌肥滤液颜色较深。与此同时，2号菌肥组的发芽率低于空白对照组，这可能是由于2号菌肥由于没有添加复合微生物菌剂，在发酵过程中存在的有害微生物分解发酵得到的产物对小白菜种子的发芽存在不利影响所致，而本发明的复合微生物菌剂在堆肥发酵体系中占有优势，摒弃了有害微生物发酵产物的不良影响，该组的发芽率与空白对照组相当。3.2发芽指数发芽指数(gi)是指未腐熟完全的堆肥产物中含有对植物有毒的代谢物质，会严重影响植物生长甚至导致植物死亡(张雪辰等，2015)。因此，将植物的生长试验作为评价堆肥腐熟度的评价指标可以最直观地体现堆肥产物效果(李季和彭生平，2011)。通过实验测量和运用公式进行计算，1号菌肥发芽指数gi为81.75％，2号菌肥发芽指数gi为83.02％。因此，两组菌肥对植物几乎没有毒性，可以在生产上应用于栽培种植。实施例6本发明复合微生物菌剂降解园林废弃物的菌肥番茄盆栽实验1.实验步骤按照表4，分别将菌肥1、2与自然土壤以不同比例进行配比。每组设置5组平行实验。选取饱满健康的番茄种子，浸泡清水中2h后均匀播入菌肥1、2与土壤充分混合的花盆上，播种深度1.5cm，每盆3粒种子,每个处理设置5次重复。将盆栽置于自然环境中，昼夜温度约为20℃/15℃，每日光照约15h，空气平均湿度约为63％，菌肥土湿度保持70％左右。每盆选择长势最好的番茄幼苗作为实验苗，去除其他幼苗。从第7天开始测定每盆幼苗的茎高和茎粗情况，并绘制成曲线图。坐果率是指植株结果数占开花总数的百分率。植株开花结果后，统计每株开花数以及结果数并计算每组坐果率。表4菌肥与土壤不同比例混合盆栽实验处理组别土壤质量(g)1号菌肥(g)2号菌肥(g)a60000b4000200c4002000d2000400e2004000f3000300g30030002.实验结果2.1植株生长发育情况番茄盆栽实验共进行105天(15周)，番茄植株生长经历了发育期、幼苗期、开花坐果期和结果期四个阶段。在各时期各组植株生长差异十分明显。图6是番茄苗生长情况。图6(a)是番茄种子种入不同配比土壤中的情况。经过约1周时间，番茄种子逐渐萌发。番茄植株生长发育过程中，第5周至第6周生长代谢最为旺盛。在此阶段，植株从幼苗期过渡至开花坐果期，生长迅速，植株逐渐趋于成熟。为详细研究该阶段不同组别的生长发育差异，图7记录了第42天(第6周)时a组-g组番茄植株生长状况。a组番茄苗生长状态明显较差，植株低矮纤细，叶片稀疏且有发黄现象。a组植株生长过程中土壤营养成分较少，缺乏植物生长发育所需的各种营养元素。土质较粘，不利于根吸收营养物质以及土壤微生物的有氧呼吸。在此阶段，b组、c组和d组植株已略高于f组和g组植株，但g组叶片数明显多于b组和c组且茎粗值最大。各组植株生长情况已出现差异，土壤与菌肥的不同配比对植株影响较大。图6(b)所示是番茄苗生长第8周(第56天)生长情况。在此阶段，b、c处理组已较明显高于其他组，但植株茎较细，开花数相对较少。图6(c)是番茄苗生长第10周(第70天)生长情况。在此阶段，a组生长情况明显低于其他组，各组茎粗和植株生长情况已有较明显差别。b组和c组植株最高但开花数和坐果率低于g组和f组，略优于d组和e组。g组茎干较粗，已有番茄幼果出现。图6(d)是番茄生长第15周(第105天)生长情况。从图中可看出，在此阶段a组植株生长情况最差，明显低于其他6组。从第10周至第15周期间，b组和c组坐果数提高较小，证明在此阶段，b组和c组的土壤肥力无法满足植株和果实发育所需营养。e组和f组生长较好，g组在此阶段结果数最多，生长情况最优，果实逐渐长大。e组和g组都添加了1号菌肥(添加菌剂处理)，因此，该菌肥养分丰富，微生物活跃，能有效促进植株生长发育。图8是每7天记录一次番茄幼苗生长情况包括茎高、茎粗等指标，按照统计结果进行作图。图8(a)是每组植株随时间变化茎高变化情况。由图中可知，各组番茄茎不断增高。a组植株明显低于其他各个实验组，每盆平均高度为42cm。由于a组是纯土壤且未添加菌肥，营养含量较低，此外，湿润土壤土质较粘紧，不利于植株种子萌发。因此，a组植株生长较慢，明显矮于其他实验组。c组番茄植株最高，达73cm，b组高度略低于c组，为71cm，d、e、f、g组茎高较接近。b、c组土壤与菌肥比为2:1，证明在此比例下，植物生长发育较快，植株高度增加明显。b组添加的为2号菌肥，该菌肥未添加外源复合微生物，自然堆腐菌肥也含有较丰富的营养物质，能够刺激植株初期营养(伸长)生长，但缺乏菌剂添加的优势微生物持续降解转化肥效，所以植株的茎粗增加不明显。图8(b)是每组植株随时间变化茎粗的变化情况。从图中可以看出，a组茎粗值为0.6cm，显著低于其他植株，与上述实验结果一致。由此证明纯土壤组a组中营养物质匮乏，使a组番茄植株低矮且茎杆较细不利于植株正常生长。g组植株茎最粗，达1.4cm，f组、d组茎粗为1.3cm。g组中土壤和1号菌肥比例为1:1，在此配比下，植株长势最好。1号菌肥(经添加菌剂发酵的菌肥)中含有丰富的营养物质可明显促进植株发育，保证植株生长和坐果。1号菌肥中添加了复合微生物菌剂，强化了优势菌株，从而使堆肥营养更加丰富，产生的菌肥所含营养更有利于植株的吸收利用。b组、c组植株虽然最高，但植株茎较细，分别只有0.75cm和0.85cm。在果实生长期间，营养输送较少。第28-56天，除了a组，其他实验组茎粗值几乎不变，但茎高值明显提高，在此阶段，植株为了更好地吸收阳光，快速吸收土壤中的营养物质，生长发育较快，叶片数量明显增多且叶片面积不断增大。第56天之后，植株逐渐成熟，茎不断增粗，积累养分，有利于开花和结果。2.2植株开花坐果情况在番茄植株生长发育过程中，统计各组植株开花，坐果情况，并计算各组坐果率，详细信息见表5。表5各组番茄植株开花、结果和坐果率组别abcdefg开花数7799105113116119126结果数49910121216坐果率5.19％9.09％8.57％8.85％10.34％10.08％12.70％从表5中可以看出，a组开花数、结果数和坐果率都明显低于其他组。由于纯土壤中营养成分和功能性菌株相对较少，a组植株无法从土壤中获得植株可吸收的生长所需的营养元素或有机物，因此生长发育比较迟缓。a组其后6组植株生长发育情况之间的对比，在不同的菌肥和土壤的配比中，c组开花数高于b组、e组高于d组，g组高于f组。c组、e组和g组中都添加了不同比例的1号菌肥，因此，1号菌肥中的营养成分可明显促进植株的开花和发育。1号菌肥中添加了复合微生物菌剂，使园林废弃物腐熟更加完全，氮、磷、钾等营养元素含量丰富，有利于植物根部吸收促进植物生长发育。g组的结果数和坐果率最高，共结果16颗，坐果率达12.70％，高于f组2.62％。g组植株的植物茎最粗，在生长发育过程中，g组植株叶片发育最好，与本实验结果相吻合。通过对比b组-g组，当土壤与菌肥配比为1:1时，植株生长最好(g组、f组)且1号菌肥效果最明显。当土壤和菌肥配比为1:2时，植株生长效果相对较好。在此配比下，植株结果数和结果率与f组和g组相比明显下降，这是由于土壤含量较少，植株缺少来自土壤中特殊的营养物质，菌肥含量过高使根部土壤较疏松，不利于植株后续发育(毕静静等，2012)。b组和c组土壤和菌肥配比为2:1，两组结果数相同，由于c组开花较多，因此c组坐果率相对较低。由于菌肥含量较低，植株发育营养相对较少，使果实生长受到影响，坐果率下降。由上述内容可见，本发明的复合微生物菌剂能有效分解园林废弃物中的物质，将其转变为植物能够吸收利用的成分，使用该菌肥时有利于植物的生长和结实，当使用本发明的菌肥，其与土壤之间的比例以1:2～2:1为佳，最优配比为1:1。以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。当前第1页12