一种副干酪乳杆菌、制剂及其在猪饲料中的应用的利记博彩app

本发明涉及生物饲料
技术领域：
，具体涉及一种副干酪乳杆菌、制剂及其在猪饲料中的应用。
背景技术：
：在养猪生产中，母猪承担着繁殖仔猪和哺乳仔猪的重要任务，利用年限长，发挥作用大。但规模化猪场的母猪，常常出现便秘、食欲下降、产仔性能差、泌乳量少、仔猪成活率低等问题，严重影响养殖场的生产成绩和经济效益。乳酸菌具有调控动物肠道微生态平衡、促进营养物质消化吸收和促进机体健康的作用，合理饲用，可望提高母猪的综合生产能力。副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)是乳酸杆菌属(lactobacillus)中的种群之一，常应用于乳制品、保健食品、饮料、冰淇淋等生产。近几年，农业部《饲料添加剂品种目录(2013)》允许副干酪乳杆菌应用于动物养殖，推动了在饲料养殖方面的应用。然而，有关副干酪乳杆菌制剂、及其制备方法及在饲料养殖中的先进技术比较少，公开号为cn103070287a的专利申请“副干酪乳杆菌发酵饲料及其制备方法、发酵设备和用途”，公开了副干酪乳杆菌液体发酵和副干酪乳杆菌固体发酵步骤，发酵饲料可减少断奶仔猪腹泻率、提高猪生长速度、改善饲料转化利用效率；公开号为cn103039699b的专利申请“一种混合菌发酵饲料及其制备和应用方法”，公开了采用副干酪乳杆菌cicc20296、枯草芽孢杆菌accc10619和酿酒酵母cicc32236，分别进行液体发酵培养，发酵液按体积比1:1:1混合后，再进行固体发酵培养，按一定比例添加到断奶仔猪饲料中，提高了断奶仔猪生产性能。以上专利中涉及的副干酪乳杆菌主要用于发酵饲料的制备，其制备过程需要有发酵设备，发酵过程耗费的时间较长，生产操作较为繁琐，目前尚未有涉及副干酪乳杆菌的冻干制剂制备方法，也没有涉及到质量稳定的冻干制剂直接按比例添加于饲料中且能提高母猪繁殖性能的方法。技术实现要素：本发明的一个目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，开发研制出一种新型的副干酪乳杆菌，该副干酪乳杆菌具有较强的耐酸、耐胆盐和抑制有害细菌等特性。本发明的另一个目的在于提供由该副干酪乳杆菌制备得到的副干酪乳杆菌制剂及其制备方法。本发明的又一个目的在于提供所述副干酪乳杆菌按比例直接添加到猪饲料中的应用。为实现本发明第一个目的提供一种副干酪乳杆菌菌株，从健康仔猪中筛选出一株性能优良的副干酪乳杆菌菌株，将该副干酪乳杆菌菌株于2015年10月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)进行保藏，菌株名称为副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)zlp019，保藏编号为：cgmccno.11532。所述副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)zlp019(cgmccno.11532)为革兰氏阳性杆菌，单个或成对排列，无芽孢。在mrs平板培养基上菌落为乳白色不透明，圆形，隆起，边缘整齐。本发明提供的副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)zlp019(cgmccno.11532)除具有上述生长特征之外，还具有耐酸、耐胆盐和抑菌特性，具体如下:1)所述副干酪乳杆菌在ph＝2的环境中作用2小时的存活率为97.58％，4小时的存活率为76.22％，在ph为3和4的酸性环境中作用2小时的存活率达99％以上，4小时的存活率达85％以上。2)所述副干酪乳杆菌在0.1％和0.2％的胆盐环境中，37℃孵育3h，存活率分别为82.25％和56.08％。3)所述副干酪乳杆菌对3种猪常见致病菌，如大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等有较强的抑制作用，抑菌圈直径在17～27mm。本发明的第二个目的提供一种猪源副干酪乳杆菌制剂，所述制剂含有副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)zlp019，保藏号为：cgmccno.11532。其中，优选地，所述副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)zlp019的活菌数可为1×1011cfu/g及以上。如上所述的猪源副干酪乳杆菌制剂，可作为一种饲料添加剂使用。本发明还提供所述副干酪乳杆菌制剂的制备方法，其为在液体发酵培养基中发酵副干酪乳杆菌zlp019，将所述发酵液进行离心、乳化冻干，制备成的冻干粉为副干酪乳杆菌制剂。优选地，所述的制备方法可具体包括如下步骤：(1)发酵培养：以1％的接种量将所述副干酪乳杆菌zlp019接种于mrs液体培养基中，37℃培养16～24小时，如此活化2代后得到种子培养物；将种子培养物以1％的接种量接种于装有液体培养基的发酵罐中，设定温度37℃、转速100rpm，维持恒定ph5.5，当发酵至14小时时开始补料，加入补料液，之后每隔2小时进行一次，共补料5次；当发酵液ph不再降低时，终止发酵，得到发酵液；(2)发酵液离心：将上述得到的发酵液离心，得到菌泥；(3)乳化冻干：将步骤(2)得到的菌泥与1/3所述发酵液体积的冻干保护剂混合，高剪切分散乳化机乳化后，分装于冷冻盘中，厚度1.5～2.5cm，预冻3小时，设置真空冷冻干燥机冷凝温度-50℃、真空度10pa，冻干24小时后，即得含副干酪乳杆菌的冻干制剂。优选地，所述液体培养基由如下浓度的物质组成：葡萄糖30g/l，蛋白胨10g/l，牛肉膏10g/l，乙酸钠5g/l，酵母浸粉10g/l，k2hpo4·3h2o2g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，mnso40.2g/l，吐温-801ml/l，ph6.5，121℃灭菌15min备用。所述补料液为葡萄糖溶液，浓度为300g/l。优选地，所述冻干保护剂为含有质量百分比浓度分别为14％的脱脂乳、8％的海藻糖、5％的糊精、1.5％的l-半胱氨酸、1％的谷氨酸钠、0.5％的羧甲基纤维素钠，其余为水。本发明还提供了上述制备的猪源副干酪乳杆菌制剂作为添加剂在饲料中的应用。优选地，应用于猪饲料中，更优选地，用于妊娠后期和哺乳阶段母猪的饲料中。进一步，所述应用为在基础日粮中添加副干酪乳杆菌zlp019制剂，所述副干酪乳杆菌zlp019在每千克母猪全价料中的活菌数为2×109cfu。本发明还提供了一种冻干保护剂，其含有质量百分比浓度分别为14％的脱脂乳、8％的海藻糖、5％的糊精、1.5％的l-半胱氨酸、1％的谷氨酸钠、0.5％的羧甲基纤维素钠、70％的水。本发明的有益效果为：本发明的副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)zlp019，cgmccno.11532，具有良好的耐酸、耐胆盐和抑菌特性。由该菌制成的冻干制剂，可以直接作为添加剂添加到妊娠后期和哺乳阶段的母猪饲料中，副干酪乳杆菌zlp019在哺乳母猪全价饲料中的活菌数为2×109cfu/kg，哺乳母猪平均日采食量提高4.48％，便秘率降低8.51个百分点；哺乳仔猪平均日增重提高8.90％，断奶成活率提高8.65个百分点，腹泻率降低31.92个百分点；母猪粪便中有害细菌，如大肠杆菌数、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的活菌数显著减少。由此可见，副干酪乳杆菌zlp019饲喂妊娠后期和哺乳阶段的母猪，能够提高母猪的繁殖性能，提高哺乳仔猪的日增重和断奶成活率，还可减少粪便中有害细菌排放，有利于养殖环境友好。附图说明图1为副干酪乳杆菌zlp019的菌落形态。图2为副干酪乳杆菌zlp019的16srrna基因进化树图谱。图3为副干酪乳杆菌zlp019的phes基因进化树图谱。图4为副干酪乳杆菌zlp019的生长曲线。具体实施方式下面结合实施例详细介绍本发明，应理解，本发明要求保护的范围不受所述具体实施方案的限制，本发明提供的具体实施例仅作为进一步说明本发明的例子，本领域技术人员参照本案说明书的描述对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换，这些无需创造性劳动的改进和替换也应落入本发明所附权利要求书的保护范围之内。若未特别说明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规技术手段。实施例1副干酪乳杆菌的分离筛选与鉴定选择健康保育猪宰杀，无菌操作取出肠道、刮取肠粘膜，与无菌生理盐水混匀，十倍稀释至10-5、10-6、10-7，各取0.1ml涂布于mrs平板培养基上，厌氧罐法37℃培养24～48小时。从中挑取乳白色菌落进行初步筛选，凡是革兰氏染色阳性、h2o2酶试验阴性、接触酶阴性的菌株可初步确定为乳酸菌，将初筛得到的菌株进行耐酸耐胆盐、抑菌等特性分析试验，最终筛选出一株性能优良的乳酸菌菌株zlp019，送至中国普通微生物菌种保藏中心(cgmcc)进行鉴定，经细胞形态学特征、生理生化特性、16srrna序列和phes基因序列等试验数据综合分析表明，该菌鉴定为lactobacillusparacasei。zlp019为革兰氏阳性杆菌，单个或成对排列，无芽孢。其在mrs平板培养基上的菌落特征如附图1所示，为乳白色不透明，圆形，隆起，边缘整齐。该菌生理生化特性的鉴定结果见表1，16srrna基因序列如seqidno.1所示，phes基因序列如seqidno.2所示。通过对该菌的16srrna基因进行进化树分析，其进化树图谱如图2所示；对该菌的phes基因进行进化树分析，其进化树图谱如图3所示。上述结果表明，本发明提供的副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)zlp019不同于现有副干酪乳杆菌，为新菌株。表1副干酪乳杆菌zlp019的生理生化特征实验项目结果实验项目结果实验项目结果甘油-肌醇-菊糖+赤藓醇-甘露醇+松三糖+d-阿拉伯糖-山梨醇+棉子糖-l-阿拉伯糖-α-甲基-d-甘露糖甙-2-酮基-葡萄糖酸盐-d-核糖+α-甲基-d-葡萄糖甙-β-甲基-木糖甙-d-木糖-n-甲酰-葡糖胺+木糖醇-l-木糖-苦杏仁甙+阿东醇-糖原-熊果甙+d-松二糖+d-半乳糖+七叶灵+d-来苏糖-d-葡萄糖+纤维二糖+d-塔格糖+d-果糖+麦芽糖+d-岩藻糖-d-甘露糖+乳糖-l-岩藻糖-l-山梨糖-蜜二糖-d-阿拉伯糖醇-l-鼠李糖-蔗糖+l-阿拉伯糖醇-卫矛醇+海藻糖+淀粉-注：:“+”，呈阳性；“-”，呈阴性。将该副干酪乳杆菌菌株于2015年10月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)进行保藏，菌株名称为副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)zlp019，保藏编号为cgmccno.11532。其中，mrs固体培养基配方：蛋白胨1g，牛肉膏1g，酵母膏0.5g，柠檬酸氢二胺0.2g，葡萄糖2g，k2hp040.2g，乙酸钠0.2g，吐温-800.1ml，硫酸镁0.058g，硫酸锰0.02g，琼脂2g，水100m1，ph6-6.5，121℃高压灭菌15min。实施例2副干酪乳杆菌的特性研究1、副干酪乳杆菌的生长曲线将活化的实施例1获得的副干酪乳杆菌以1％的接种量接入mrs液体培养基，采用全自动微生物生长曲线分析仪检测od600值，绘制生长曲线，其结果如图2所示，其中横坐标为培养时间，单位为小时，纵坐标为吸光度od600值。实验结果表明，副干酪乳杆菌在mrs培养基中生长迅速，在4h左右进入对数期，11h左右进入稳定期。2、耐酸性能测定将活化的副干酪乳杆菌按1％接种量分别接入到ph为2、3和4的mrs液体培养基中，分别37℃保温2、4和6h，以0h为对照，测定活菌数，计算存活率，结果见表2。表2副干酪乳杆菌耐酸性能(％)结果说明，此副干酪乳杆菌在ph＝2的酸性环境中作用2h的存活率为97.58％，4小时的存活率为76.22％；在ph为3和4的酸性环境中作用2小时的存活率均达到99％以上，作用4小时的存活率均达到85％以上。说明该副干酪乳杆菌具有很强的耐酸性，能够很好的耐受动物的胃酸环境。2、耐胆盐性能测定将活化的副干酪乳杆菌按1％接种量分别接入到含有0.1％、0.2％和0.3％猪胆盐的mrs液体培养基中，37℃保温3、6h，以0h的活菌数为对照，计算存活率，结果见表3。表3副干酪乳杆菌耐胆盐性能测定(％)结果说明，此菌在0.1％胆盐环境中作用3h，其存活率为82.25％；在0.2％胆盐的环境中作用3h，其存活率为56.08％；在0.3％的胆盐浓度下作用3h，其存活率仅为10.47％。说明该副干酪乳杆菌对于0.1％的胆盐具有较高的耐受性。3、抑菌试验采用牛津杯法，检测副干酪乳杆菌发酵液对3种常见的猪致病菌的抑菌效果，结果见表4。表4副干酪乳杆菌抑菌试验由结果可以看出，该乳酸菌对这3种有害细菌：大肠杆菌(c838901，可购自中国兽医药品监察所)、霍乱沙门氏菌(c78-4，可购自中国兽医药品监察所)、金黄色葡萄球菌(c56023，可购自中国兽医药品监察所)具有较强的抑制作用，抑菌圈直径达到17～27mm。4、药敏试验对副干酪乳杆菌进行了26种抗生素(oxoid药敏纸片)的药敏试验，结果见表5。表5副干酪乳杆菌药敏试验注：s为敏感；i为中度敏感；r为耐药。由表5可以看出，该菌对氨苄西林、四环素、阿莫西林、阿奇霉素、多粘菌素e、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢曲松、恩诺沙星、阿米卡星、庆大霉素、克林霉素、利福平、氟苯尼考、氯霉素等敏感，对氧氟沙星中度敏感，对新诺明、红霉素、杆菌肽、头孢氨苄、头孢唑肟、环丙沙星、诺氟沙星、卡那霉素、链霉素、制霉菌素等抗生素有耐药性。实施例3副干酪乳杆菌制剂的制备1、副干酪乳杆菌的发酵培养将实施例1得到的副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)zlp019(保藏号：cgmccno.11532)以1％的接种量接种于mrs液体培养基中，37℃培养16～24小时，如此活化2代后得到种子培养物；将种子培养物以1％的接种量接种于装有30l液体培养基的50l发酵罐中，设定温度37℃、转速100rpm，维持恒定ph5.5，当发酵至14小时时开始补料，向发酵罐中一次加入200ml补料液，之后每隔2小时进行一次补料，共补料5次；当发酵液ph不再降低时，终止发酵。其中，液体培养基组成为：葡萄糖30g/l，蛋白胨10g/l，牛肉膏10g/l，乙酸钠5g/l，酵母浸粉10g/l，k2hpo4·3h2o2g/l，柠檬酸氢二铵2g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，mnso40.2g/l，吐温-801ml/l，ph6.5，121℃灭菌15min备用。所述补料液为葡萄糖溶液，浓度为300g/l，115℃灭菌15min备用。2、发酵液离心将所述步骤1得到的发酵液在19000rpm条件下以管式离心机分离菌体，得到菌泥；3、冻干制剂的制备将菌泥与1/3发酵液体积的冻干保护剂混合，采用高剪切分散乳化机3000r/min乳化30min后进行冻干，即得副干酪乳杆菌冻干制剂。其中，冻干条件为将乳化后的菌悬液分装于冷冻盘中，厚度1.5～2.5cm，预冻3小时，设置冷凝温度-50℃、真空度10pa，冻干时间24小时。其中，冻干保护剂由如下质量百分比浓度的物质组成：脱脂乳14％、海藻糖8％、糊精5％、l-半胱氨酸1.5％、谷氨酸钠1％、羧甲基纤维素钠0.5％，其余为水。用此配方，副干酪乳杆菌的冻干保护率可达88.20％。其中，冻干保护率计算公式为：冻干保护率(％)＝(冻干后菌粉活菌数×冻干后菌粉重量)/(冻干前菌悬液活菌数×冻干前菌悬液体积)×100。取制备好的副干酪乳杆菌冻干制剂，用无菌生理盐水进行梯度稀释后，采用mrs平板培养基培养测活菌数，测得冻干粉中副干酪乳杆菌的活菌数为1.20×1011cfu/g。4、副干酪乳杆菌冻干制剂贮存稳定性测定将上述制备的副干酪乳杆菌冻干制剂用铝箔袋真空包装，-18℃保存1个月、6个月、12个月后，取菌粉用无菌生理盐水进行梯度稀释后，采用mrs平板培养基测活菌数。由表6可知，副干酪乳杆菌冻干制剂低温保存12个月后，活菌存活率仍可达到83.66％，制剂质量稳定。表6副干酪乳杆菌冻干制剂贮存性能测定实施例4副干酪乳杆菌制剂在母猪生产中的应用1、试验动物与分组选用健康、胎次相近、妊娠85天的长大二元母猪100头，随机分成对照组和试验组2个组，每组50个重复，每个重复1头母猪。对照组正常饲喂，试验组在饲喂基础日粮基础上添加猪源副干酪乳杆菌冻干制剂(全价料的活菌终浓度为2×109cfu/kg)。其中，母猪的基础日粮参照《猪饲养标准》(2004)配制，具体营养成分实测值见表7。母猪饲养于同一栋圈舍，饲养管理和免疫程序等按猪场统一制度执行。试验时间为母猪妊娠第85天开始，至哺乳仔猪28日龄断奶为止。表7基础日粮营养成分实测值(％)3、试验管理试验期间，每日观察猪群生长情况，记录饲料消耗和母猪产仔、窝重、腹泻等；试验结束后，每组采取10份母猪新鲜粪样，测定粪中乳酸菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等的活菌数。数据统计采用spss18.0统计软件进行单因素方差分析，结果以平均值±标准差表示。4、结果与分析4.1猪源副干酪乳杆菌制剂对母猪繁殖性能的试验结果见表8。表8猪源副干酪乳杆菌制剂对母猪繁殖性能的影响注：同肩标注不同代表差异显著，小写字母不同表示差异显著(p<0.05)。与对照组相比，试验组仔猪出生个体重提高了7.01％(p<0.05)，断奶个体重提高了8.33％(p<0.05)，断奶成活率提高了8.65个百分点(p<0.05)，哺乳仔猪日增重提高了8.90％(p<0.05)，哺乳母猪日采食量提高了4.48％(p<0.05)，哺乳仔猪腹泻率降低了31.92个百分点，哺乳母猪便秘率降低了8.51个百分点。由此可见，猪源副干酪乳杆菌制剂饲喂妊娠后期和哺乳阶段的母猪，能够提高母猪繁殖性能，促进仔猪健康和成活率提高。4.2猪源副干酪乳杆菌制剂对哺乳母猪粪便微生物的影响结果9。表9猪源副干酪乳杆菌制剂对哺乳母猪粪便微生物的影响注：同肩标注不同代表差异显著，小写字母不同表示差异显著(p<0.05)。由表9可知，与对照组相比，试验组母猪粪便中乳酸菌数显著提高(p<0.05)，大肠杆菌数和沙门氏菌数显著减少(p<0.05)。由此可见，猪源副干酪乳杆菌制剂饲喂母猪，能够降低粪便中的有害细菌，对肠道健康和养殖环境改善有积极作用。综上，本副干酪乳杆菌制剂饲喂妊娠后期和哺乳阶段的母猪，能够提高母猪的繁殖性能，提高哺乳仔猪的日增重和断奶成活率，促进母猪肠道健康，减少粪便中的有害菌排放，有利于养殖环境友好。sequencelisting<110>北京市农林科学院<120>一种副干酪乳杆菌、制剂及其在猪饲料中的应用<130><160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>1401<212>dna<213>副干酪乳杆菌（lactobacillusparacasei）zlp019的16srrna基因片段<400>1ttgatgatcggtgcttgcaccgagattcaacatggaacgagtggcggacgggtgagtaac60acgtgggtaacctgcccttaagtgggggataacatttggaaacagatgctaataccgcat120agatccaagaaccgcatggttcttggctgaaagatggcgtaagctatcgcttttggatgg180acccgcggcgtattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgatgatacgtagcc240gaactgagaggttgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggagg300cagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtga360agaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttggagaagaatggtcggcagagtaactgt420tgtcggcgtgacggtatccaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggt480aatacgtaggtggcaagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttt540tttaagtctgatgtgaaagccctcggcttaaccgaggaagcgcatcggaaactgggaaac600ttgagtgcagaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatgg660aagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagca720tgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgaatgctaggt780gttggagggtttccgcccttcagtgccgcagctaacgcattaagcattccgcctggggag840tacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcat900gtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatctttttgatcacc960tgagagatcaggtttccccttcgggggcaaaatgacaggtggtgcatggttgtcgtcagc1020tcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatgactagttgcc1080cagcatttagttgggcactctagtaagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggat1140gacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtac1200aacgagttgcgagaccgcgaggtcaagctaatctcttaaagccattctcagttcggactg1260taggctgcaactcgcctacacgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgc1320ggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacac1380ccgaagccggtggcgtaaccc1401<210>2<211>394<212>dna<213>phes基因序列<400>2caagtccaatgcaggcgcggacaatggaaaagcacgactttaccaaaggaccgctgaaaa60tgattagccctggggtggtttatcgacgtgatgacgacgatgctactcatagccatcagt120ttcaccagatggaaggactcgtcattgacaagcatataaccatggctgatctaaagggaa180ccttgttggccatgtgccaacacgtgtttggtaaagatcggacaattcgcttgcggccaa240gttattttccatttacggagccatccgttgaagttgatgtttcctgttttcgttgcggcg300gtaaaggttgcccggtttgcaaatataccggttggattgaagtgttaggtgccggcatgg360tgcatcccaatgtgctacgggcagcgaacattga394当前第1页12