一种全细胞催化制备曲克芦丁酯的方法与流程

本发明属于生物催化和药物化学领域，具体涉及一种全细胞催化制备曲克芦丁酯的方法。

技术背景

黄酮类化合物是一类重要的天然多羟基化合物，具有抗氧化性、抗癌、抗菌等多种生理功能。曲克芦丁属于黄酮类化合物的一种，广泛存在于茶叶、咖啡豆、谷物以及各种果蔬当中，除此之外，曲克芦丁还可以通过芦丁衍生化制得。曲克芦丁具有镇痛、抑制红细胞与血小板的凝集、防止脑血栓的形成、抗菌消炎、清除自由基以及治疗糖尿病等多种药理和生理活性。在治疗心血管治病、糖尿病以及脑血病等方面得到广泛的应用。但由于曲克芦丁的结构限制导致其脂溶性较差，进而降低其生物利用度，极大地影响到它们的开发和应用。

目前，关于增强曲克芦丁脂溶性的研究进展主要有：利用化学法和酶法合成曲克芦丁酯以及对曲克芦丁进行剂型改造制成一种w/o型的微乳液。但是化学法合成曲克芦丁酯主要是通过强酸或强碱进行催化，酸、碱催化剂的大量使用导致严重的环境污染问题，而且存在化学合成的区域选择性差，副产物多，产率较低等缺点。对曲克芦丁进行剂型改造虽然一定程度上能提高其生物利用度，但微乳液的制备需要大量的表面活性剂，这些表面活性剂（如卵磷脂）价格昂贵，造成生产成本高，而且有报道表明表面活性剂的用量越大其毒性也随着增大。酶法虽然专一性强，但游离酶的分离纯化过程繁琐、复杂，且容易受到极端反应环境的影响，商品化酶的价格昂贵，不利于工业化的应用。

生物催化技术除了酶催化，还有一种为全细胞催化，它是指利用完整的微生物全细胞作为催化剂进行化学转化的过程，其中起催化作用的是微生物全细胞内的酶系。相较于酶催化技术，全细胞催化剂的制备简单易得，可以省略繁琐的酶分离纯化和固定化工艺，降低生产成本，而且全细胞具有完整的细胞结构和细胞膜，酶以天然固定化的方式被保护于细胞中，有利于在有机溶剂、极端ph、高温等反应环境中最大程度地保持酶的构象和催化活性。此外，全细胞可以给多步生物转化反应提供不同的酶系和辅助因子，而且可以有效地实现辅酶再生。全细胞催化技术也越来越多地应用到催化制备黄酮酯的研究中，然而，关于全细胞催化制备曲克芦丁酯的研究还没有报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种绿色、简单且高效的全细胞催化制备曲克芦丁酯的方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现。

一种全细胞催化制备曲克芦丁酯的方法，包括如下步骤：

（1）将含吡啶的混合有机溶剂和曲克芦丁混合均匀，再加入酰基供体，然后加入微生物细胞作为催化剂振荡反应；

（2）反应结束后，将反应液分离纯化得到曲克芦丁酯。

优选的，步骤（1）所述含吡啶的混合有机溶剂为二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺、乙腈、四氢呋喃、叔丁醇、叔戊醇、环己烷、正己烷、石油醚、正庚烷和异辛烷中的一种与吡啶组成的二元混合溶剂。

进一步优选的，所述混合有机溶剂中吡啶的体积含量为25%-90%。

优选的，步骤（1）所述酰基供体为碳的个数为1-18的脂肪酸、碳的个数为1-18的脂肪酸酯或脂肪酸烯醇酯。

优选的，步骤（1）所述曲克芦丁与酰基供体的摩尔比为1:5-1:40，进一步优选为1:10-1:40。

优选的，步骤（1）所述微生物细胞为施氏假单胞菌（pseudomonasstutzeri）、荧光假单胞菌（pseudomonasfluorescens）、铜绿假单胞菌（pseudomonasaeruginosa）、少孢根霉（rhizopusoligosporus）、黑曲霉（aspergillusniger）、橘青霉（penicilliumcitrinum）、华根霉（rhizopuschinensis）、米黑根毛霉（rhizomucormiehei）、米根霉（rhizopusoryzae）、米曲霉（aspergillusoryzae）或白地霉（geotrichumcandidum）。

优选的，步骤（1）所述微生物细胞与曲克芦丁的质量比为2:3-8:3。

优选的，步骤（1）所述微生物细胞用量为20-80mg/ml。

优选的，步骤（1）所述反应的温度为20-55℃。

优选的，步骤（1）所述反应的时间为24-156小时。

优选的，步骤（2）所述分离纯化是将反应后的反应液经离心除菌体，减压蒸馏除去溶剂，再经柱层析或薄层层析分离得到曲克芦丁酯；所用层析液为乙酸乙酯/甲醇/水，体积比为15：3.6：0.5。

与现有技术相比，本发明具有如下的优点：

（1）本发明采用高效的生物催化剂—微生物细胞来催化制备曲克芦丁酯。由于全细胞催化剂有完整的细胞结构，其中的细胞链接酶以天然固定化的方式被保护于细胞中，克服了现有技术中游离酶在极端反应环境中容易失活，反应产率低的缺点。

（2）本发明无需基团保护和去保护操作，反应过程简单易控。

（3）反应所需的全细胞催化剂制备简单易得、便宜，避免了游离酶繁琐、复杂的分离纯化工艺和商品化酶的高生产成本。

（4）本发明在反应结束后可以通过简单的过滤回收菌体，既实现全细胞催化剂的重复利用，又易于产物的分离纯化。

（5）本发明具有反应条件温和、环境友好、工艺简单、副反应少且选择性高等优点。

附图说明

图1为曲克芦丁酯合成过程的高效液相色谱图。

图2为曲克芦丁单酯的核磁共振碳谱图。

图3为曲克芦丁双酯的核磁共振碳谱图。

具体实施方式

为了更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。

实施例1

将30mmol曲克芦丁溶解于1ml吡啶-异辛烷混合有机溶剂（吡啶体积含量为25%）中，加入丙酸乙烯酯（曲克芦丁与丙酸乙烯酯的摩尔比为1:20）混合均匀，再加入铜绿假单胞菌gim1.46（广东省微生物研究所）（铜绿假单胞菌与曲克芦丁的质量比为2:1），在20℃、振荡速度180r/min下反应24小时。反应结束后，反应混合物经离心除菌体，减压蒸馏除去溶剂，再经薄层层析分离得到曲克芦丁酯，合成过程的高效液相色谱图如图1所示。所用层析液为乙酸乙酯/甲醇/水，体积比为15：3.6：0.5。该实施条件下，底物转化率为12%，曲克芦丁单酯产率为10.1%。曲克芦丁单酯的核磁共振碳谱图如图2所示。

实施例2

将30mmol曲克芦丁溶解于1ml吡啶-异辛烷混合有机溶剂（吡啶体积含量为25%）中，加入丙酸乙烯酯（曲克芦丁与丙酸乙烯酯的摩尔比为1:20）混合均匀，再加入施氏假单胞菌gim1.273（广东省微生物研究所）（施氏假单胞菌与曲克芦丁的质量比为2:1），在37.5℃、振荡速度180r/min下反应90小时。反应结束后，反应混合物经离心除菌体，减压蒸馏除去溶剂，再经薄层层析分离得到曲克芦丁酯。所用层析液为乙酸乙酯/甲醇/水，体积比为15：3.6：0.5。该实施条件下，底物转化率为78.2%，曲克芦丁双酯产率为60.2%。曲克芦丁双酯的核磁共振碳谱图如图3所示。

实施例3

将30mmol曲克芦丁溶解于1ml吡啶-正庚烷混合有机溶剂（吡啶体积含量为25%）中，加入丙酸乙烯酯（曲克芦丁与丙酸乙烯酯的摩尔比为1:20）混合均匀，再加入铜绿假单胞菌gim1.46（铜绿假单胞菌与曲克芦丁的质量比为2:1），在55℃、振荡速度180r/min下反应156小时。反应结束后，反应混合物经离心除菌体，减压蒸馏除去溶剂，再经薄层层析分离得到曲克芦丁酯。所用层析液为乙酸乙酯/甲醇/水，体积比为15：3.6：0.5。该实施条件下，底物转化率为80.1%，曲克芦丁单酯产率为72%。

实施例4

将30mmol曲克芦丁溶解于1ml吡啶-正庚烷混合有机溶剂（吡啶体积含量为90%）中，加入丙酸乙烯酯（曲克芦丁与丙酸乙烯酯的摩尔比1:20）混合均匀，再加入铜绿假单胞菌gim1.46（铜绿假单胞菌与曲克芦丁的质量比为2:1），在40℃、振荡速度180r/min下反应48小时。反应结束后，反应混合物经离心除菌体，减压蒸馏除去溶剂，再经薄层层析分离得到曲克芦丁酯。所用层析液为乙酸乙酯/甲醇/水，体积比为15：3.6：0.5。该实施条件下，底物转化率为34.4%，曲克芦丁单酯产率为27.7%。

实施例5

将30mmol曲克芦丁溶解于1ml吡啶-正庚烷混合有机溶剂（吡啶体积含量为65%）中，加入丙酸乙烯酯（曲克芦丁与丙酸乙烯酯的摩尔比为1:10）混合均匀，再加入铜绿假单胞菌gim1.46（铜绿假单胞菌与曲克芦丁的质量比为2:1），在40℃、振荡速度180r/min下反应120小时。反应结束后，反应混合物经离心除菌体，减压蒸馏除去溶剂，再经薄层层析分离得到曲克芦丁酯。所用层析液为乙酸乙酯/甲醇/水，体积比为15：3.6：0.5。该实施条件下，底物转化率为60.1%，曲克芦丁单酯产率为44.7%。

实施例6

将30mmol曲克芦丁溶解于1ml吡啶-正庚烷混合有机溶剂（吡啶体积含量为65%）中，加入丙酸乙烯酯（曲克芦丁与丙酸乙烯酯的摩尔比为1:40）混合均匀，再加入铜绿假单胞菌gim1.46（铜绿假单胞菌与曲克芦丁的质量比为2:1），在40℃、振荡速度180r/min下反应120小时。反应结束后，反应混合物经离心除菌体，减压蒸馏除去溶剂，再经薄层层析分离得到曲克芦丁酯。所用层析液为乙酸乙酯/甲醇/水，体积比为15：3.6：0.5。该实施条件下，底物转化率为89.4%，曲克芦丁单酯产率为78.5%。

实施例7

将30mmol曲克芦丁溶解于1ml吡啶-正庚烷混合有机溶剂（吡啶体积含量为65%）中，加入丙酸乙烯酯（曲克芦丁与丙酸乙烯酯的摩尔比为1:30）混合均匀，再加入铜绿假单胞菌gim1.46（铜绿假单胞菌与曲克芦丁的质量比为1:1），在40℃、振荡速度180r/min下反应120小时。反应结束后，反应混合物经离心除菌体，减压蒸馏除去溶剂，再经薄层层析分离得到曲克芦丁酯。所用层析液为乙酸乙酯/甲醇/水，体积比为15：3.6：0.5。该实施条件下，底物转化率为65.7%，曲克芦丁单酯产率为50%。

实施例8

将30mmol曲克芦丁溶解于1ml吡啶-正庚烷混合有机溶剂（吡啶体积含量为65%）中，加入丙酸乙烯酯（曲克芦丁与丙酸乙烯酯的摩尔比为1:30）混合均匀，再加入铜绿假单胞菌gim1.46（铜绿假单胞菌与曲克芦丁的质量比为4:1），在40℃、振荡速度180r/min下反应120小时。反应结束后，反应混合物经离心除菌体，减压蒸馏除去溶剂，再经薄层层析分离得到曲克芦丁酯。所用层析液为乙酸乙酯/甲醇/水，体积比为15：3.6：0.5。该实施条件下，底物转化率为96.2%，曲克芦丁单酯产率为81.2%。

实施例9

将30mmol曲克芦丁溶解于1ml吡啶-正庚烷混合有机溶剂（吡啶体积含量为65%）中，加入丙酸乙烯酯（曲克芦丁与丙酸乙烯酯的摩尔比为1:30）混合均匀，再加入铜绿假单胞菌gim1.46（铜绿假单胞菌与曲克芦丁的质量比为5:2），在25℃、振荡速度180r/min下反应120小时。反应结束后，反应混合物经离心除菌体，减压蒸馏除去溶剂，再经薄层层析分离得到曲克芦丁酯。所用层析液为乙酸乙酯/甲醇/水，体积比为15：3.6：0.5。该实施条件下，底物转化率为40.4%，曲克芦丁单酯产率为34.6%。

实施例10

将30mmol曲克芦丁溶解于1ml吡啶-正庚烷混合有机溶剂（吡啶体积含量为65%）中，加入丙酸乙烯酯（曲克芦丁与丙酸乙烯酯的摩尔比为1:30）混合均匀，再加入铜绿假单胞菌gim1.46（铜绿假单胞菌与曲克芦丁的质量比为5:2），在55℃、振荡速度180r/min下反应120小时。反应结束后，反应混合物经离心除菌体，减压蒸馏除去溶剂，再经薄层层析分离得到曲克芦丁酯。所用层析液为乙酸乙酯/甲醇/水，体积比为15：3.6：0.5。该实施条件下，底物转化率为63.4%，曲克芦丁单酯产率为53.5%。

本发明的上述实施例仅仅是为了清楚地说明本发明而作的举例，并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。