本发明属于药物化学领域，具体涉及一种1,3,5-三取代吡唑化合物及其制备方法和应用。
背景技术：
淋巴瘤（lymphoma）是淋巴结或结外淋巴组织的恶性肿瘤，一般可分为霍奇金淋巴瘤（hl）和非霍奇金淋巴瘤（nhl）两大类，nhl是成人淋巴瘤的主要类型，占世界上常见恶性肿瘤的第七位。弥漫性大b细胞淋巴瘤（dlbcl）是其中最为常见的一种亚型，而其又可分为三种亚型，分别是活化b细胞样型（abc）、生发中心b细胞样型（gcb）和原发性纵隔b细胞淋巴瘤（pmbl）。目前治疗淋巴瘤的主要手段是通过单克隆抗体的靶向治疗，但是这种治疗方式对于活化b细胞样型弥漫性大b细胞淋巴瘤预后较差。
根据目前的研究表明，黏膜相关型淋巴组织淋巴瘤易位蛋白1（malt1）是abc型淋巴瘤的有效靶分子，它可以切割多种底物，以促进淋巴细胞增殖，提高淋巴瘤细胞的存活率。基于malt1在淋巴瘤细胞中潜在的靶点作用进行药物的开发与设计，目前已经发现一系列先导化合物如下所示：
本发明通过六步反应得到1,3,5-三取代吡唑化合物，其制备方法简单，反应条件温和，能耗低，收率高，产品纯度高，实用性强，且所合成的1,3,5-三取代吡唑化合物是一类靶向malt1的小分子化合物，其相对分子质量在500以下，具有较高的体外抗癌活性，有望用于制备淋巴癌的靶向治疗药物。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种1,3,5-三取代吡唑化合物及其制备方法和应用，该化合物能够选择性的抑制toledo细胞（abc型弥漫性大b细胞淋巴瘤细胞）以及su-dhl细胞（gcb型弥漫性大b细胞淋巴瘤细胞）的生长，具有一定的药理活性，且其制备方法简单，实验条件温和，不要求高温高压、强酸强碱等苛刻条件，反应收率高。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种1,3,5-三取代吡唑化合物，其具体为5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-(2-氯乙酰胺基)苯氧基)-1-(2-甲氧基乙基)吡唑，其结构式如下：
所述化合物的制备途径如下：
其具体制备步骤包括：
1）在冰浴条件下，将10mmol3,4-二氯苯乙酮溶于5ml四氢呋喃（thf）中，然后分批加入20mmolnah，搅拌混匀后移至室温、氮气气氛中，继续搅拌2h，然后逐滴加入50mmol碳酸二甲酯，搅拌混匀后回流反应1h，经tlc检测体系中无原料后停止反应，经纯化获得3,4-二氯苯甲酰基乙酸甲酯（化合物1）；
2）取10.0mmol步骤1）所得3,4-二氯苯甲酰基乙酸甲酯，加13ml无水乙醇混合溶解，然后加入15.0mmol水合肼，于100℃下搅拌反应1h，得黄色澄清溶液，经tlc检测体系中无原料后停止反应，经纯化获得5-(3,4-二氯苯)-3-羟基吡唑（化合物2）；
3）将0.3mmol步骤2）所得5-(3,4-二氯苯)-3-羟基吡唑与0.36mmol1-溴-4-硝基苯、0.003mmolnicl2(pph3)2、0.45mmolkhco3混合，加入1ml二甲基亚砜（dmso）摇匀，将反应瓶中充满氩气后密封，于90℃反应16h，经tlc检测体系中无原料后停止反应，经纯化获得5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-硝基苯氧基)吡唑（化合物3）；
4）在冰浴条件下，将0.18mmol步骤3）所得5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-硝基苯氧基)吡唑与0.36mmolpph3于1ml四氢呋喃（thf）中溶解混匀，然后依次加入0.36mmol乙二醇单甲醚、0.27mmol偶氮二甲酸二异丙酯（diad），然后于室温下搅拌反应4h，经tlc检测体系中无原料后停止反应，经纯化获得5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-硝基苯氧基)-1-(2-甲氧基乙基)吡唑（化合物4）；
5）取0.06mmol步骤4）所得5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-硝基苯氧基)-1-(2-甲氧基乙基)吡唑，加入0.6mmolzn及2ml甲醇，然后在搅拌条件下加入0.5ml冰醋酸，继续室温搅拌反应6h，经tlc检测体系中无原料后停止反应，经纯化获得5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-氨基苯氧基)-1-(2-甲氧基乙基)吡唑（化合物5）；
6）取0.06mmol步骤5）所得5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-氨基苯氧基)-1-(2-甲氧基乙基)吡唑，加入1ml二氯甲烷，然后在搅拌条件下加入0.09mmol氯乙酸、0.12mmol1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edci），常温搅拌反应0.5h，经tlc检测体系中无原料后停止反应，经纯化获得5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-(2-氯乙酰胺基)苯氧基)-1-(2-甲氧基乙基)吡唑。
所得化合物与mi-2药物分子具有相近的药物活性，其对于toledo细胞（abc型弥漫性大b细胞淋巴瘤细胞）以及su-dhl细胞（gcb型弥漫性大b细胞淋巴瘤细胞）具有较好的选择抑制性，对两种细胞株的ic50值均可达到1μm以下，有望用于淋巴癌的靶向治疗药物。
本发明的显著优点在于：
（1）本发明经过酮酯缩合、吡唑环的环化、buchwald反应、mitsunobu反应、硝基还原、酰胺化反应等六步，高效合成目标化合物，其合成方法简单，实验条件温和，不要求高温高压等苛刻条件，且反应时间短，收率一般可达到60%以上，部分反应的收率可达到90%以上。
（2）本发明所得1，3，5-三取代吡唑化合物的相对分子质量小于500，属于小分子化合物，其脂水分配系数（clogp）小于5，且生物细胞实验证实该化合物具有一定的抗癌活性，因此该化合物具有用于制备抗癌药物的前景。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1
（1）3,4-二氯苯甲酰基乙酸甲酯（化合物1）的制备
1.反应：取一个干燥洁净的100ml茄形烧瓶，在冰浴条件下，将3,4-二氯苯乙酮（1.89g，10mmol）溶于5mlthf之中，再用药匙将纯度60%的nah（800mg，20mmol）分批加入到反应体系中（加入应尽可能迅速，防止体系接触过多的空气），加完后移到室温下，在氮气氛围中搅拌反应2h，然后逐滴加入碳酸二甲酯（4.2ml，50mmol），在室温条件下搅拌、回流反应1h，tlc（展开体系：pe:ch2cl2=1:1）检测体系中无原料3,4-二氯苯乙酮后停止反应。
2.纯化：a）将反应液用40ml乙酸乙酯稀释，再用饱和氯化铵水溶液萃取洗涤三次，每次20ml，饱和食盐水洗涤两次，分液得到有机层；有机层加适量无水硫酸钠，搅拌2-3分钟除水干燥，然后过滤，用少量乙酸乙酯（3×2ml）洗涤硫酸钠；滤液经旋转蒸发仪蒸干后得到粗产物；b）先用pe（石油醚）：ch2cl2=1：1为洗脱剂冲洗，然后用纯ch2cl2洗脱并收集目标产物，用旋转蒸发仪旋蒸除去溶剂，再用油泵抽去少量残留溶剂，最终得到约2.0g浅黄色固体，收率85%。
产物性状：浅黄色固体（常温下）。熔点：52.3-52.7℃。
：rf=0.50（pe:ch2cl2=1:1）。
1（400mhz，cdcl3）δ：12.49（s，1h），8.05（d，j=2.1hz，2h），7.89（d，j=2.1hz，1h），7.79（dd，j=8.4，2.1hz，2h），7.62-7.57（m，3h），7.51（d，j=8.4hz，1h），5.67（s，1h），3.99（s，4h），3.84（s，3h），3.78（s，6h）。
13（101mhz，cdcl3）δ：190.33，173.32，168.92，167.42，138.69，135.57，135.55，133.78，133.43，133.24，131.09，130.72，130.62，128.17，127.67，125.25，88.23，52.83，51.81，45.70。
（esi）：calcdforc10h8cl2o3[m+h]+m/z246.9923，found246.9939。
（2）5-(3,4-二氯苯)-3-羟基吡唑（化合物2）的制备
1.反应：向反应瓶中加入化合物1（2.47g，10.0mmol），用注射器量取13ml无水乙醇，将其加入到反应瓶中，常温下搅拌或者超声使其混合均匀，然后将水合肼（910μl，15.0mmol）加入到反应体系中，此时溶液中有大量的固体未溶解，将反应瓶放置于100℃下反应，随着温度的上升，固体全部溶解，1h后反应瓶内得到黄色澄清液，取出冷却，取少量液体用tlc（展开体系：pe:etoac=1:1）检测体系中无原料后停止反应。
2.纯化：将反应液在减压条件下旋蒸除去少量乙醇，然后取下反应瓶；在一个200ml的锥形瓶中装入适量h2o，用滴管逐次移取反应浓缩液滴加至匀速搅拌的h2o中，有大量白色固体析出，将浑浊液进行减压抽滤，以抽干固体表面的水分，然后将得到的较干燥的白色固体放入真空干燥器中干燥2h，取出称重，得到2.1g白色固体，产率92%。
产物性状：白色固体（常温下）。熔点：201.9-202.5℃。
：rf=0.50（pe:etoac=1:1）。
1（400mhz，dmso-d6）δ：12.24（s，1h），10.16（s，1h），7.96（s，1h），7.67（d，j=2.8hz，2h），6.00（s，1h）。
13（101mhz，dmso-d6）δ：131.68，130.97，129.89，126.35，124.90。
（esi）:calcdforc9h6cl2n2o[m+h]+m/z228.9930，found228.9925.
（3）5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-硝基苯氧基)吡唑（化合物3）的制备
1.反应：将化合物2（69mg，0.3mmol）、1-溴-4硝基苯（73mg，0.36mmol）、nicl2(pph3)2（2mg，0.003mmol）、khco3（45mg，0.45mmol）装入反应瓶中，然后加入1mldmso，适当摇匀，充入氩气使反应瓶中的气体排除后密封，置于90℃的搅拌器中进行反应，16h后用tlc（展开体系：ch2cl2:etoac=30:1）检测体系中原料基本反应完全后停止反应。
2.纯化：a）将反应液用40ml乙酸乙酯稀释，再依次用0.5mol/l的hcl溶液萃取洗涤3次、去离子水洗涤2次、饱和食盐水洗涤1次，每次20ml，分液得到有机层，有机层加适量无水硫酸钠，搅拌2-3分钟除水，然后对反应液进行过滤，用少量乙酸乙酯（3×2ml）洗涤硫酸钠，收集洗涤液和滤液，经旋转蒸发仪旋蒸后得到粗产物；b）取适量粗产物于1ml离心管中，用乙酸乙酯溶解，上样，先用纯ch2cl2作为洗脱剂冲洗除去杂质，然后用ch2cl2：etoac=20:1为洗脱剂冲洗，合并含有产物的洗脱液，旋转蒸发仪除去溶剂，再用油泵抽去少量残留溶剂，最终得到约88mg白色固体，收率为84%。
产物性状：浅黄色固体（常温下）。熔点：170.2-171.0℃。
：rf=0.60（ch2cl2:etoac=30:1）。
1（400mhz，dmso-d6）δ：13.27（s，1h），8.26（d，j=9.2hz，2h），8.17–7.86（m，1h），7.89–7.51（m，2h），7.31（d，j=9.2hz，2h），6.73（d，j=2.1hz，1h）。
13（101mhz，dmso-d6）δ：161.90，159.06，142.56，141.47，131.95，131.25，130.97，129.39，126.81，126.01，125.14，117.22，92.77。
（esi）：calcdforc15h9cl2n3o3[m+h]+m/z350.0094，found350.0077。
（4）5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-硝基苯氧基)-1-(2-甲氧基乙基)吡唑（化合物4）的制备
1.反应：向反应瓶中加入化合物3（84.7mg，0.18mmol），pph3（94.3mg，0.36mmol），在冰浴条件下加入1mlthf使固体混合均匀，用移液枪迅速移取乙二醇单甲醚（28μl，0.36mmol）、diad（49μl，0.27mmol），依次加入到反应瓶中，待添加完后触摸瓶壁接近室温后移去冰浴，室温下搅拌反应4小时后用tlc（展开体系：pe:etoac=4:1）检测体系中无原料时停止反应。
2.纯化：将反应液转移至100ml的茄形烧瓶中，用旋转蒸发仪进行减压旋蒸，用ch2cl2：meoh=10：1溶解旋干后的固体，取少量溶解后的样品留样，剩余的溶液均匀的涂布在新的薄层色谱硅胶板上，选择pe:etoac:ch2cl2=4:1:1作为展开剂进行薄层色谱分离，选择中间含有目标产物的色谱带刮下，用ch2cl2:meoh=10:1洗脱，用旋转蒸发仪进行减压旋蒸除去溶剂，最终得到35mg浅黄色固体，收率为47%。
产物性状：黄色固体（常温下）。熔点：83.6-84.0℃。
：rf=0.45（pe:etoac=4:1）。
1（400mhz，cdcl3）δ：8.26（d，j=9.3hz，1h），7.86（d，j=2.0hz，1h），7.57（dd，j=8.4，2.1hz，1h），7.44（d，j=8.4hz，1h），7.25（d，j=9.3hz，1h），6.08（s，1h），4.23（t，j=5.4hz，2h），3.77（t，j=5.4hz，2h），3.24（s，3h）。
13（101mhz，cdcl3）δ：161.40，150.21，148.16，144.05，133.41，132.94，131.88，130.68，127.19，126.04，124.60，117.33，89.57，70.54，58.87，47.65。
（esi）：calcdforc18h15cl2n3o4[m+h]+m/z408.0512，found408.0509。
（5）5-(3，4-二氯苯基）-3-(4-氨基苯氧基）-1-（2-甲氧基乙基）吡唑（化合物5）的制备
1.反应：向反应瓶中加入化合物4（25mg，0.06mmol）和zn（39mg，0.6mmol），用注射器量取2ml甲醇加入到反应瓶中，在搅拌条件下逐滴加入0.5ml冰醋酸，室温下搅拌6h后用tlc（展开体系：pe:etoac=2:1）检测体系中无原料时停止反应。
2.纯化：将反应液转移至分液漏斗中，加入15ml乙酸乙酯稀释，用饱和nahco3溶液萃取洗涤3次（3×5ml），用水洗涤1次（1×5ml），用饱和nacl洗涤1次（1×5ml），水相再用乙酸乙酯反萃2次（2×5ml），所得乙酸乙酯层用水洗涤1次（1×5ml），用饱和nacl洗涤1次（1×5ml），然后将有机相用无水na2so4干燥，过滤，压旋蒸条件下旋干，得到黄色油状物22.2mg，收率96%。
产物性状：黄色油状物（常温下）。
：rf=0.75（pe:etoac=2:1）。
1（400mhz，cdcl3）δ：7.80（d，j=2.0hz，1h），7.51（dd，j=8.3，2.0hz，1h），7.39（d，j=8.3hz，1h），6.99（d，j=8.8hz，2h），6.71（d，j=8.8hz，2h），5.70（s，1h），4.27（t，j=5.8hz，2h），3.82（t，j=5.8hz，3h），3.36（s，3h）。
13（101mhz，cdcl3）δ：154.61，148.89，147.58，143.09，133.97，132.73，131.37，130.51，127.15，124.59，119.96，116.50，86.21，70.70，58.97，47.01。
（6）5-(3，4-二氯苯基)-3-(4-(2-氯乙酰胺基)苯氧基)-1-(2-甲氧基乙基)吡唑（1，3，5-三取代吡唑化合物的合成）
1.反应：向反应瓶中加入化合物5（23mg，0.06mmol），用注射器量取1ml二氯甲烷，加入到反应瓶中，然后在搅拌条件下加入氯乙酸（9mg，0.09mmol）、edci（23mg，0.12mmol），常温下搅拌反应0.5h后，用tlc（展开体系：pe:etoac=2:1）检测体系中无原料时停止反应。
2.纯化：将反应液经硅胶板进行色谱分离（展开剂pe:etoac=4:1），选出所需色带，刮下，用ch2cl2:meoh=10:1进行淋洗，淋洗液在减压旋蒸条件下旋干，油泵抽干并称重，得到浅黄色固体22mg，收率80%。
产物性状:浅黄色固体（常温下）。熔点：109.1-109.8℃。
rf=0.45（pe:etoac=2:1）。
1（400mhz，cdcl3）δ：8.27（s，1h），7.82（d，j=2.0hz，1h），7.63–7.51（m，3h），7.42（d，j=8.4hz，1h），7.17（d，j=9.0hz，2h），5.84（s，1h），4.27（t，j=5.7hz，2h），4.21（s，2h），3.81（t，j=5.6hz，2h），3.33（s，3h）。
13（101mhz，cdcl3）δ：163.88，153.31，152.82，147.67，133.60，133.33，132.71，131.47，130.47，127.07，124.49，121.89，118.74，87.37，70.54，58.86，47.10，42.83.
hrms（esi）：calcdforc20h18cl3n3o3[m+h]+m/z454.0487，found454.0478。
实施例2活性测试
（1）化合物对toledo肿瘤细胞增殖和存活的抑制作用
材料：abc型弥漫性大b细胞淋巴瘤细胞株toledo；
受试药物：实施例1所得最终化合物fm；
细胞培养方法：取出液氮中冻存的toledo细胞，在37℃的温水中解冻，将细胞悬液移入1.5ml离心管中，置于离心机中，1500rpm离心5min，弃去上清液，加入1mlrpmi1640完全培养液，轻轻吹打均匀，将细胞悬液加入培养皿中，补加3mlrpmi1640完全培养液，将培养皿置于5%co2、37℃培养箱中培养。
细胞毒性实验：将toledo细胞以2×104个细胞/孔的密度接种到96孔培养板中，加入10μμ/l的化合物，将其置于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养48小时。取出培养板，每孔加入10μlcck-8试剂，将培养板继续置于37℃、5%二氧化碳培养箱中孵育2小时后，终止培养，小心吸弃上清液，每孔加入150μldmso，避光振荡10min使结晶物充分溶解；以酶标仪检测450nm处的吸收度od450，并按照以下公式计算细胞存活率：
细胞存活率%=（处理组od450/对照组od450）×100%，
然后使用spss13.0软件对数据进行处理，并计算癌细胞增殖的半数抑制浓度（ic50）。
（2）化合物对su-dhl-6肿瘤细胞增殖和存活的抑制作用
材料：gcb型弥漫性大b细胞淋巴瘤细胞株su-dhl-6；
受试药物：实施例1所得最终化合物fm；
细胞培养方法：取出液氮中冻存的su-dhl-6细胞，在37℃的温水中解冻，将细胞悬液移入1.5ml离心管中，置于离心机中，1500rpm离心5min，弃去上清液，加入1mlrpmi1640完全培养液，轻轻吹打均匀，将细胞悬液加入培养皿中，补加3mlrpmi1640完全培养液，将培养皿置于5%co2、37℃培养箱中培养。
细胞毒性实验：将su-dhl-6细胞以2×104个细胞/孔的密度接种到96孔培养板中，加入10μμ/l的化合物，将其置于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养48小时。取出培养板，每孔加入10μlcck-8试剂，将培养板继续置于37℃、5%二氧化碳培养箱中孵育2小时后，终止培养，小心吸弃上清液，每孔加入150μldmso，避光振荡10min使结晶物充分溶解；以酶标仪检测450nm处的吸收度od450，并按照以下公式计算细胞存活率：
细胞存活率%=（处理组od450/对照组od450）×100%，
然后使用spss13.0软件对数据进行处理，并计算癌细胞增殖的半数抑制浓度（ic50）。
实施例1所得化合物fm的活性参数如表1所示，表中m.w.为对应化合物的相对分子质量，tpsa为拓扑极性表面积参数，clogp为计算脂水分配系数，ic50值为化合物fm作用于淋巴瘤细胞48小时后对应淋巴瘤细胞半数有效抑制浓度。
表1所得化合物的活性参数
由表1可见，所得化合物可有效抑制abc型弥漫性大b细胞淋巴瘤细胞及gcb型弥漫性大b细胞淋巴瘤细胞的生长增殖，其半数有效抑制浓度ic50均小于1μm。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。