鉴定棉花闭花授粉材料的引物对、试剂盒以及方法与流程

本发明涉及棉花品种鉴别领域，具体而言，涉及鉴定棉花闭花授粉材料的引物对、试剂盒以及方法。
背景技术：
：棉花是常异花授粉作物，一般天然异交率在3～20％，高的可达50％。目前，常规种和杂交种在生产上都得到大面积推广。在常规种自交繁种和杂交种亲本自交繁殖的过程中，由于棉花存在一定的异交率，很容易发生异交，造成生物学混杂，使优良品种特征特性发生退化。鉴于此，育种家和种子公司每年需要投入大量的人力物力财力对棉花常规品种和杂交种亲本进行隔离繁殖或者人工自交保纯。闭花授粉现象在现代棉花品种中非常罕见，早期曾有过零星记载。秘鲁boza在海岛棉坦奎斯品种的异交后代中选到闭花授粉的品系，苏联kaansh在(海岛棉×草棉)×海岛棉的自交后代中发现具有闭花授粉花朵的杂种，印度neelakantan和balasubrahmanyan在陆地棉×海岛棉的f2代中亦观察到闭花授粉变异体。80年代以后，埃及、苏联和法国等棉区又相继发现闭花授粉棉花，并进行了初步遗传分析。1990年，国内首次从陆海杂种后代中分离到稳定的闭花授粉棉花材料1057-1，等等。与正常开花授粉棉花材料相比，棉花闭花授粉材料在开花期花朵开花散粉授粉当天，花瓣紧闭，不开放，完成自我授粉。棉花闭花授粉材料的发现和应用，在棉花遗传育种和良种繁育上具有广阔的应用前景。在育种过程中，不需要繁琐的人工自交提纯，通过棉花多代种植后，自我自交，就可以实现后代的纯合，显著地提高了效率。在制种过程中，可以使棉花常规种繁种和杂交种亲本繁殖过程中，无需人工干涉，进行自交，杜绝了品种生物学混杂退化。在棉花生产过程中，可有效地防止阴雨天气，雨水进入花内致使花粉破裂而授粉受精不良，从而减少落铃，提高产量。鉴于棉花闭花授粉材料的重要性，快速准确地鉴定该材料对于品种选育和知识产权保护均有重要作用。然而，目前我国很多材料真伪的鉴定大多依靠田间性状表现，此法虽然直观，但是费时费工。而且，闭花授粉特性受环境影响较大，在某些生态区或环境条件下，与正常开花棉花材料一样，花朵表现为全部开放。随着分子生物学技术的发展，从dna水平上进行分子鉴定使得结果更准确，方法更简便。目前，利用ssr分子标记对材料进行鉴定的方法已经在各种作物中得到广泛应用。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供鉴定棉花闭花授粉材料的引物对，该引物对通过大量实验筛选得到，特异性强，能稳定有效地鉴别棉花闭花授粉材料。本发明的第二目的在于提供鉴定棉花闭花授粉材料的试剂盒，该试剂盒为棉花闭花授粉材料的鉴定提供便利。本发明的第三目的在于提供鉴定棉花闭花授粉材料的方法，该方法通过分子水平进行鉴定，方法简便快捷，鉴定结果稳定可靠。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：鉴定棉花闭花授粉材料的引物对，包括以下引物对中的任一种或多种：nau2173引物对的上下游核酸序列如seqidno.1和seqidno.2所示，nau2343引物对的上下游核酸序列如seqidno.3和seqidno.4所示，nau7024引物对的上下游核酸序列如seqidno.5和seqidno.6所示，tmb1638引物对的上下游核酸序列如seqidno.7和seqidno.8所示，bnl3875引物对的上下游核酸序列如seqidno.9和seqidno.10所示，hau0979引物对的上下游核酸序列如seqidno.11和seqidno.12所示，nau1102引物对的上下游核酸序列如seqidno.13和seqidno.14所示，nau6601引物对的上下游核酸序列如seqidno.15和seqidno.16所示，nau2251引物对的上下游核酸序列如seqidno.17和seqidno.18所示，dpl0133引物对的上下游核酸序列如seqidno.19和seqidno.20所示。本发明针对陆地棉26条染色体选择180对引物(平均每条染色体上最少3对引物)进行ssrpcr扩增，将闭花授粉材料与多个普通棉花品种进行比较，筛选得到这些特异性引物对。这些引物对特异性强，检测结果稳定可靠。普通棉花品种包括栽培棉花的两个主要的棉种(海岛棉和陆地棉)，特别选择海岛棉遗传标准系(3-79)和陆地棉遗传标准系(tm-1)。另外，针对种植面积占绝大多数的陆地棉种，试验材料涵盖三大棉区(黄河流域、长江流域、西北内陆)，包括来源于不同血缘系谱的种质资源和目前大面积推广的品种，比如黄河流域棉区陆地棉品种鲁棉研28号、西北内陆陆地棉品种中棉所49。具体的棉花品种如下：海岛棉品种：新海21号、海7124、吉扎76以及海岛棉遗传标准系3-79；陆地棉遗传标准系tm-1；黄河流域棉区陆地棉品种中棉所10号和鲁棉研28号；长江流域棉区陆地棉品种苏棉22号、川棉239和鄂抗棉9号；黄河流域和长江流域棉区陆地棉品种中棉所12；西北内陆棉区陆地棉品种中棉所49、新陆中69号和新陆棉1号。以上这些棉花品种均可从中国农业科学院棉花研究所获得。本发明提供的鉴定棉花闭花授粉材料的引物对，可以为上述引物对中的任意一种，也可以为任意两种、任意三种、任意四种、任意五种、任意六种、任意七种、任意八种、任意九种以及这十种的组合，当然，鉴定的时候采用的引物越多，则鉴定更为确切。进一步地，所述棉花闭花授粉材料为棉花闭花授粉材料cj1548143。本发明还提供了鉴定棉花闭花授粉材料的试剂盒，含有权利要求1中所述的引物对。该试剂盒中，可以含有上述引物对中的任一种或几种。试剂盒为鉴定棉花闭花授粉材料的进行提供便利。本发明还提供了鉴定棉花闭花授粉材料的方法，采用上述的引物对对待检测棉花材料的基因组进行检测。该处的上述的引物对为上述引物对中的任一种或几种。进一步地，所述检测为分子水平的检测。如可以为杂交、基因芯片、pcr检测等。pcr检测简便易行，因此，优选为pcr检测。进一步地，所述pcr检测时，pcr扩增所用的退火温度为58±1℃。该退火温度，扩增得到的产物特异性强，杂带少。如pcr扩增程序为：94-95℃预变性3-5分钟；94℃变性30秒；58℃退火30秒；72℃延伸30秒；35个循环；72℃延伸5-10分钟；产物4℃保存。由于本发明提供的引物对针对棉花染色体上的ssr序列得到，因此，使用该引物得到的片段的长度较小，一般在200bp左右。pcr检测时，pcr扩增产物一般采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，或者毛细管电泳进行检测。优选地，所述pcr检测时，pcr扩增产物采用毛细管电泳检测结果。本发明创新性地采用毛细管电泳分辨ssrpcr扩增产物，相对于传统的利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨扩增产物，提高了效率和准确性。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨扩增产物，包括制作聚丙烯酰胺凝胶、点样、电泳1h和显色等步骤，一般每次完成48个样品，最多96个样品的条带采集。利用毛细管电泳分辨扩增产物仅需要在扩增后的96孔pcr板中加入te缓冲液，电泳1h，直接用prosize2.0软件观察条带，每次可以完成95个样品的条带采集，大大节约了时间，提高了效率。另外，毛细管电泳可以区分开相差2bp以上的条带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳结果只能凭借肉眼观察，分辨率较低。优选地，所述pcr检测所用的pcr反应体系为10-25μl。如pcr反应体系为10μl，包括以下成分：基因组20-50ng,浓度为10μm上下游引物各0.5μl；taqmix5μl，无菌双蒸水补齐至10μl。相应地，若pcr反应体系的体积更大，每个成分相应的增加即可。为了获得稳定的检测效果，优选地，所述pcr反应体系中的模板dna的含量不小于5ng,优选为20-50ng。优选地，待检测棉花材料的基因组所用的提取材料为待检测棉花材料的种仁。是将该棉花材料的种子去壳得到。本发明还提供了另一种鉴定棉花闭花授粉材料的方法，若待检测棉花材料的花朵开花当天花瓣紧闭，散粉正常，并且花粉活性正常，则判断为棉花闭花授粉材料。该方法采用形态学特征进行鉴定，只要判断待检测棉花材料在花朵开花当天花瓣紧闭，散粉正常，并且花粉活性正常，这三个特征同时存在的话，则判断该待检测棉花品种为闭花授粉材料。与现有技术相比，本发明的有益效果为：(1)本发明提供的引物对，特异性强，能稳定有效地鉴别棉花闭花授粉材料。(2)本发明提供的鉴定棉花闭花授粉材料的方法，能快速高效地、准确地、稳定地检测出是否为闭花授粉材料。(3)本发明对pcr扩增产物采用毛细管电泳分辨，大大节约了时间，提高了效率和准确性。(4)本发明还提供了形态学鉴定闭花授粉材料的方法，适宜在棉株生长过程中鉴定。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为本发明实施例1中利用毛细管电泳分辨引物bnl3875的扩增产物图谱；图2为本发明实施例1中利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨引物bnl3875的扩增产物电泳图；图3为本发明实施例3中正常开花材料的花朵开放动态观察图；图4为本发明实施例3中棉花闭花授粉材料的花朵开放动态观察图；图5为本发明实施例3中棉花闭花授粉材料与正常开花材料的散粉情况观察图；图6为本发明实施例3中棉花闭花授粉材料与正常开花材料的花粉活性观察图。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例11、材料取以下棉花品种的种子：海岛棉品种：新海21号、海7124、吉扎76以及海岛棉遗传标准系3-79；陆地棉遗传标准系tm-1；黄河流域棉区陆地棉品种中棉所10号和鲁棉研28号；长江流域棉区陆地棉品种苏棉22号、川棉239和鄂抗棉9号；黄河流域和长江流域棉区陆地棉品种中棉所12；西北内陆棉区陆地棉品种中棉所49、新陆中69号和新陆棉1号；棉花闭花授粉材料cj1548143。以上这些棉花品种均可从中国农业科学院棉花研究所获得。2、dna提取取棉花闭花授粉材料与上述14个对照材料的种子，采用sds法提取基因组dna，具体提取步骤如下：(1)剥去棉种种皮外壳，并尽量保证种仁的完整性。(2)置于放入钢珠的2ml离心管中，在组织研磨仪上粉碎。(3)加入800μlsds提取液(组成成分:1wt％sds，0.01mol/ledta，0.705mol/lnacl，0.05mol/ltris，0.5wt％山梨醇，1wt％pvp，1wt％β-巯基乙醇)，漩涡充分后，65℃水浴30min，间隔10min左右轻摇一次。(4)加入等体积800μl酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，混匀至不分层，12000r/min离心10min。(5)取上清，加入1μlrnasea(10mg/ml)，37℃水浴30min。(6)重复抽提一次后离心取上清，加入0.7倍体积异丙醇，缓慢混匀至dna成团析出，室温静置30min。(7)70％乙醇洗涤dna沉淀2次，无水乙醇洗涤1次。(8)倒置晾干，加入200μlddh2o充分溶解dna，备用，测定模板dna浓度为20-50ng/μl。3、ssr引物的扩增和检测以上述提取的基因组dna为模板，针对陆地棉26条染色体选择180对引物(平均每条染色体上最少3对引物)进行ssrpcr扩增。pcr扩增程序如表1所示。表1pcr扩增程序pcr扩增反应所用体系为10μl反应体系，扩增反应体系如表2所示。表2pcr扩增反应体系所用试剂用量taqmix5.0μl正向引物(10μm)0.5μl反向引物(10μm)0.5μl模板dna1.0μlddh2o3.0μl总体积10μlpcr产物用毛细管电泳进行检测，使用fa-96全自动毛细管电泳系统和配套的dnf-910试剂盒。操作过程如下：(1)将试剂盒中的5×buffer稀释5倍，96孔分析托盘中每孔加1ml，放入毛细管电泳系统的b托盘中，每跑六板样品更换一次。(2)在96孔平面pcr板的每个点样孔中加入30μlmaker，上面覆盖一滴mineraloil，放入毛细管电泳仪m托盘中。(3)每10mlgel和1μldye混合后加入毛细管电泳仪的gel1盛液瓶中。(4)将试剂盒中的5×conditioningsolution溶液稀释5倍，加入毛细管电泳系统的conditioning盛液瓶中，并清空废液瓶。(5)在96孔板的10μlpcr产物中加入14μl1×te，共24μl。最后一个点样孔中加入24μlladder，然后按顺序放在毛细管电泳系统的样品托盘中。(6)打开fragmentanalyzer软件按实际情况进行参数设置，每六板一个循环，第一板样品选择fc-dnf-900-33-dna35-500bp.mthds程序，剩下五板选择gp-dnf-900-33-dna35-500bp.mthds程序。(7)在prosize2.0软件中查看结果相关信息。通过毛细管电泳，最终鉴定出10对在闭花授粉材料中有特异性扩增条带的引物，具体如表3所示。表310对特异性ssr引物及其序列引物名称正向引物反向引物nau2173gccaaataggtcacacacaaagcgagaaggagacagaaaanau2343gctttgctttggaatgagatatactgcaacccctcacactnau7024acataagacacaaagagaggaaggaggagagattaaagaatmb1638aaaaccaagaatcgaggaaaaatgcaatcctcgaaggtctttbnl3875catgtaggaacgagcatagtgaacacataccagtcccagtcghau0979cacccctaaagtaacaaacaaaatcttcctcagcactccaagnau1102atctctctgtctcccccttcgcatatctggcgggtataatnau6601tctattttacaacgcgaccatggcaaagtggtaaatgttgnau2251ttctccagtaaccaacaaaggaaaatatcatccccgtcaaadpl0133cagtttctctaccggtctcaaatcggtatcacaccacatactttcacg10对特异性引物的扩增产物如下：引物nau2173的扩增组中，闭花授粉材料有268bp的扩增产物，而其它对照均无此大小的片段；引物nau2343的扩增组中，闭花授粉材料有419bp的扩增产物，而其它对照均无此大小的片段；引物nau7024的扩增组中，闭花授粉材料有276bp的扩增产物，而其它对照均无此大小的片段；引物tmb1638的扩增组中，闭花授粉材料有219bp的扩增产物，而其它对照均无此大小的片段；引物bnl3875的扩增组中，闭花授粉材料有133bp的扩增产物，而其它对照均无此大小的片段；引物hau0979的扩增组中，闭花授粉材料有258bp的扩增产物，而其它对照均无此大小的片段；引物nau1102的扩增组中，闭花授粉材料有186bp的扩增产物，而其它对照均无此大小的片段；引物nau6601的扩增组中，闭花授粉材料有177bp的扩增产物，而其它对照均无此大小的片段；引物nau2251的扩增组中，闭花授粉材料有162bp的扩增产物，而其它对照均无此大小的片段；引物dpl0133的扩增组中，闭花授粉材料有210bp的扩增产物，而其它对照均无此大小的片段。具体地，bnl3875的扩增产物进行毛细管电泳的结果如图1所示。图1中，从下至上的曲线依次代表以下的f1-g3；f1：新海21号；f2：3-79；f3：海7124；f4：吉扎76；f5：tm-1；f6：中棉所10号；f7：中棉所12；f8：鲁棉研28号；f9：苏棉22号；f10：川棉239；f11：鄂抗棉9号；f12：中棉所49；g1：新陆中69号；g2：新陆棉1号；g3：闭花授粉材料。红色箭头指示特异性条带；35bp和1500bp处峰分别指示最低和最高分子量标准。另外，对应于图1中的pcr产物采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，具体结果见图2。图2中，1：新海21号；2：3-79；3：海7124；4：吉扎76；5：tm-1；6：中棉所10号；7：中棉所12；8：鲁棉研28号；9：苏棉22号；10：川棉239；11：鄂抗棉9号；12：中棉所49；13：新陆中69号；14：新陆棉1号；15：闭花授粉材料；m：分子量标准。红色箭头指示特异性条带。综合考虑，优选采用毛细管电泳分辨ssrpcr扩增产物，相对于传统的利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨扩增产物，提高了效率和准确性。聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨扩增产物，包括制作聚丙烯酰胺凝胶、点样、电泳1h和显色等步骤，一般每次完成48个样品，最多96个样品的条带采集。毛细管电泳分辨扩增产物仅需要在扩增后的96孔pcr板中加入te缓冲液，电泳1h，直接用prosize2.0软件观察条带，每次可以完成95个样品的条带采集，大大节约了时间，提高了效率。另外，毛细管电泳可以区分开相差2bp以上的条带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳结果只能凭借肉眼观察，分辨率较低。实施例2对已知棉花品种进行鉴定，取以下棉花品种在不同种植地或者不同时期采集到的种子，每个棉花品种采用10个种子：海岛棉品种：新海21号、海7124、吉扎76以及海岛棉遗传标准系3-79；陆地棉遗传标准系tm-1；黄河流域棉区陆地棉品种中棉所10号和鲁棉研28号；长江流域棉区陆地棉品种苏棉22号、川棉239和鄂抗棉9号；黄河流域和长江流域棉区陆地棉品种中棉所12；西北内陆棉区陆地棉品种中棉所49、新陆中69号和新陆棉1号；棉花闭花授粉材料cj1548143。采用实施例1的dna提取方式提取基因组；对提取到的基因组测定浓度，浓度均在5ng/μl以上；进行pcr扩增，采用的引物为表3中所示，pcr扩增程序和扩增体系同实施例1；扩增产物采用毛细管电泳，电泳结果显示，这10对特异性引物均在闭花授粉材料中得到了同实施例1中的大小的特异性条带；并且，不同地方或者不同时期采集得到的闭花授粉材料均得到了一致大小的特异性条带；而在其他棉花品种中均未得到相应大小的特异性条带。说明，本发明提供的鉴定棉花闭花授粉材料的方法，鉴定结果稳定可靠。实施例3棉花闭花授粉材料cj1548143闭花授粉特性的形态学鉴定将棉花闭花授粉材料cj1548143种植在河南省安阳市中国农业科学院棉花研究所试验农场，以正常开花材料为对照。在开花期对当天即将开放花朵的动态观察，与正常开花材料(图3)明显不同，棉花闭花授粉材料花朵开花当天花瓣紧闭，不开放(图4)。但是，与正常开放花朵相比，散粉正常(图5)，花粉活性正常(图6)。持续的观察也表明，闭花授粉的花朵能发育成棉铃，完成吐絮，收获纤维和种子。这些结果表明，棉花闭花授粉材料能够自主闭花完成自我授粉。将这些种植得到的对照组以及闭花授粉材料的种子各收集50个，采用实施例2相同的方法进行pcr检测。pcr产物结果进行毛细管电泳，闭花授粉材料的50个样本均在10对特异性引物中扩增得到了同实施例1中闭花授粉材料的相应大小的特异性条带；而对照组的50个样本中均未得到这些特异性条带。尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。<110>中国农业科学院棉花研究所<120>鉴定棉花闭花授粉材料的引物对、试剂盒以及方法<160>20<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1gccaaataggtcacacacaa20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2agcgagaaggagacagaaaa20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3gctttgctttggaatgagat20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4atactgcaacccctcacact20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5acataagacacaaagagagg20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6aaggaggagagattaaagaa20<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列<400>7aaaaccaagaatcgaggaaaaa22<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8tgcaatcctcgaaggtcttt20<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列<400>9catgtaggaacgagcatagtg21<210>10<211>21<212>dna<213>人工序列<400>10aacacataccagtcccagtcg21<210>11<211>22<212>dna<213>人工序列<400>11cacccctaaagtaacaaacaaa22<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列<400>12atcttcctcagcactccaag20<210>13<211>20<212>dna<213>人工序列<400>13atctctctgtctcccccttc20<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列<400>14gcatatctggcgggtataat20<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列<400>15tctattttacaacgcgacca20<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列<400>16tggcaaagtggtaaatgttg20<210>17<211>21<212>dna<213>人工序列<400>17ttctccagtaaccaacaaagg21<210>18<211>20<212>dna<213>人工序列<400>18aaaatatcatccccgtcaaa20<210>19<211>24<212>dna<213>人工序列<400>19cagtttctctaccggtctcaaatc24<210>20<211>24<212>dna<213>人工序列<400>20ggtatcacaccacatactttcacg24当前第1页12