一株具有降血清胆固醇作用的耐久肠球菌SWUN5857及其应用的利记博彩app

本发明属于微生物技术领域，具体地说，涉及一株具有降血清胆固醇作用的耐久肠球菌SWUN5857及其应用。

背景技术：

胆固醇是机体生存所必不可少的重要成分，是类脂中的一种重要的化合物，胆固醇以游离和胆固醇酯两种形式普遍存在于动物细胞和组织中，若胆固醇含量过高会产生一定的危害，机体对异物的清除能力会随体内胆固醇水平的升高而下降，从而会导致致癌率的升高；血清总胆固醇含量过高时会导致内皮细胞功能紊乱，尤其是调节钙离子浓度的低密度脂蛋白的水平过高就会增大心脏负荷，从而提高心脑血管疾病的发病率。调节机体血清胆固醇水平主要从减少机体外源摄取胆固醇、抑制胆固醇的内源性合成、促进机体胆固醇的代谢等方面进行研究，目前，调节机体血清胆固醇水平主要有以下几种方式：(1)改善生活方式并同时改变饮食结构，(2)药物治疗，(3)应用物理、化学方法降低或去除食物中的胆固醇低脂品如脱脂乳、脱脂蛋白等，(4)依靠某些具有降胆固醇功能的微生物如益生菌的特殊生理生化活性开发研制新型微生态制剂，使其在肠道内发挥调节微生态系统平衡的同时也能起到降低。

益生菌在机体肠道内定植后能通过自身代谢产物以及竞争性优势与其他有害细菌进行相互作用，预防和调整肠道内的菌群失调，维持胆固醇等物质的正常代谢，从而保护机体肠道微生态系统的最佳状态；同时，益生菌还可通过减少机体外源胆固醇的摄取量和调整机体胆固醇代谢功能而达到降低机体胆固醇的目的。益生菌在机体内发挥降胆固醇作用的同时，能够识别有害菌和有益菌，抑制有害菌生长，可减少由于广谱抗菌类药物杀死有害菌的同时也将有益菌杀死而导致的肠道内菌群数量比例失衡、免疫力低下及肠道疾病等现象的产生，因此，益生菌类制剂可以避免或弥补抗生素类药物产生的不足之处。

综上所述，益生菌制剂在治疗机体胆固醇水平偏高方面打破了传统的抗生素类药物治疗的局限性，即其在治疗此类疾病的同时还可改善肠道菌群平衡，因此益生菌制剂对于胆固醇水平偏高的临床研究具有一定的应用价值，并且也是一条全新的治疗途径和未来解决人类心脑血管疾病的一个新方法，因此，研究开发具有降胆固醇功能的益生菌制剂具有重大的现实意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种具有降血清胆固醇作用的耐久肠球菌SWUN 5857及其应用，该菌株具有良好的作为益生菌的能力，耐酸性，耐胆盐，对小鼠的生长性能和免疫功能都有良好的作用。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种具有降血清胆固醇作用的耐久肠球菌SWUN 5857，该菌株已于2016年08月02日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武汉大学校内，邮编430072)，保藏号为CCTCC NO:M 2016420。

进一步地，耐久肠球菌的菌落特征具体为：菌落表面光滑，呈白色或乳白色的单个菌落，显微镜下呈圆形或椭圆形，无芽孢，革兰氏染色呈阳性。

进一步地，耐久肠球菌的耐受特征为：

耐久肠球菌的菌株耐酸性较强，在pH3.0的人工胃液下3h后存活率为99±2％；在3％浓度胆盐下可以缓慢生长，存活率为78±2％。

本发明还公开了一种上述的耐久肠球菌SWUN5857在制备具有降血清胆固醇作用的益生菌中的应用。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明耐久肠球菌SWUN 5857对小鼠的生长性能和免疫功能都有良好的作用。

2)本发明耐久肠球菌SWUN 5857对酸和胆盐都有良好的耐受性，在pH 1.0的情况下耐久肠球菌SWUN 5857的存活率为35％，在胆盐浓度为0.3％的情况下耐久肠球菌SWUN 5857的存活率为78％。

3)本发明耐久肠球菌SWUN 5857具有降低血清中胆固醇的效果。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明耐久肠球菌PCR扩增产物；其中，M：DNA Maker DL2000；P：阳性对照；1-5：耐久肠球菌PCR扩增产物；N：阴性对照；

图2是本发明乳酸菌革兰氏染色结果(10×100)；

图3是本发明耐久肠球菌SWUN5857的生长曲线。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1菌的分离与鉴定

一、菌的分离：川西北地区牧民家庭自然发酵的牦牛酸奶中，吸取酸奶样品1ml进行梯度稀释，取10^-2、10^-3、10^-4稀释度，分别吸取200μl涂布于MRS培养基双层培平板，每个稀释度做2个重复，置于37℃恒温箱中，培养48h，待菌落长出，挑取培养平板上具有溶钙圈的菌落，不同形态的菌落挑取5个，不足5个者重复取样，进行平板划线纯化，连续纯化2次。

向洁净的玻片上滴一点无菌生理盐水，用接种环挑取少量细菌，涂布于无菌生理盐水上，待干燥后进行革兰氏染色，镜检并观察菌落形态，挑选菌体呈圆形或椭圆形，无芽孢，革兰氏染色呈阳性的菌株统一编号，经过筛选耐酸耐胆盐等试验后发现SWUN5857的生物学特性效果最好(耐酸耐胆盐结果见图3、表2和表3)。

二、鉴定：

一)、PCR鉴定

表1引物序列

采用25μl反应体系，DNA模板2μl，上、下游引物各1μl(10pmol)，Taq酶0.1μl(5U/ul)，含Mg+的4×dNTPs(10mmol/L)2.5μl，10×PCR buffer2.5μl，用ddH₂O补足至25μl。反应程序如下：95℃预变性5min，94℃变性60s，50℃退火60s，72℃延伸90s，35个循环，再72℃延伸10min，4℃保存至结束。以实验室保存的嗜热链球菌为标准菌株模板作为阳性对照，无菌的ddH₂O为阴性对照检测目标模板，PCR产物由1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，选取阳性模板的剩余PCR产物进行测序。

上述PCR扩增结果大小约为1505的片段(PCR扩增结果是1.5kb左右，上述测序结果除多余的载体序列得到结果大小约为1197bp的片段)，进行测序，测得的序列如SEQ ID No.1所示。将序列进行BLAST比对，与GenBank已知的耐久肠球菌(登录号为：KM495855)同源性为99％，判断为耐久肠球菌(Enterococcus durans)。

在四川省兽药监察所用细菌鉴定仪判读生化结果，如图1所示，结果显示这株肠球菌均为耐久肠球菌(Enterococcus durans)。

二)、生化鉴定

将上述分子鉴定为耐久肠球菌的菌株，用接种环挑取单个菌落，接种于营养琼脂平面，37℃培养24h，送到四川省兽药监察所，用无菌棉签蘸取适量菌落，悬浮于5ml的生理盐水中，按顺序滴加菌液和试剂后，37℃恒温培养24h，用细菌鉴定仪判读结果。

结果：培养48h后，挑取在双层MRS平板上具有溶钙圈，菌落表面光滑，呈白色或乳白色的单个菌落，显微镜下呈圆形或椭圆形，无芽孢，革兰氏染色呈阳性的分离株判定为乳酸菌球菌属(如图2所示)。

基于以上特征，将菌株SWUN5857命名为耐久肠球菌(Enterococcus durans)SWUN5857。该菌株已于2016年8月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武汉大学校内，邮编430072)，保藏号为CCTCC NO:M 2016420。

实施例2耐久肠球菌的生物特性

一、耐久肠球菌的生长曲线

将充分活化的菌株按照1％的量接入200ml的MRS液体培养基中，37℃培养，在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20h时快速的无菌取样2ml，于600nm波长处测定不同时间点的OD值，以未接种的MRS液体培养基为空白调零。每次取样重复三次读数，求平均值。用Excel软件建立以MRS液体培养基为背景的耐久肠球菌SWUN5857的生长曲线，如图3所示，如图3所示牦牛酸奶源耐久肠球菌SWUN5857遵循延滞期、对数期、稳定期、衰亡期的规律。菌株在前2h处于延滞期，没有大的变化，之后进入对数期，大约到11h达到生长高峰，进入稳定期后和衰亡期后，活菌就会被自身代谢产物所抑制，从该曲线上可以确定该菌体的最佳收获时间是11h。

二、耐酸性试验

将SWUN 5857的菌株接种于MRS液体培养基，37℃培养24h后，充分混匀后，按2％比例将上述菌液分别加入到pH为1.0、2.0、3.0MRS液体培养基中，37℃恒温培养3h后。于600nm处测OD值，MRS液体培养基为调零对照。取三个重复求平均值后，计算存活率即可代表菌株对酸的耐受性。

表2耐久肠球菌在酸存在下的存活率(％)

从表2可以得到，在pH 1.0的情况下存活率为35％，证明其对酸有很强的耐受性。

三、耐胆盐试验

将SWUN 5857菌株接种于MRS液体培养基，37℃培养24h后，充分混匀后，按2％比例将上述菌液分别加入到3％的牛胆酸盐中，37℃恒温培养3h后。于600nm处测OD值，MRS液体培养基为调零对照。取三个重复求平均值后，计算存活率即可代表菌株对酸的耐受性。

表3耐久肠球菌在胆盐存在下的存活率(％)

从表3可以看出，在胆盐浓度为0.3％的情况下的存活率为78％，证明其对胆盐有较强的耐受性。

实施例3耐久肠杆菌SWUN5857对小鼠生长性能、免疫功能及肠道粘膜免疫的影响

1.1、实验动物的分组及处理

预实验：将35只雌性昆明鼠适应性饲喂小鼠三天后，随机分为5组，每组7只，在环境为SPF级实验动物房隔笼饲养，自由采食。各组处理如下：

10⁴cfu/ml组：灌服浓度为10⁴cfu/ml的耐久肠球菌SWUN5857，0.5ml/只/d，连续7d；

10⁵cfu/mL组：灌服浓度为10⁵cfu/ml的耐久肠球菌SWUN5857，0.5ml/只/d，连续7d；

10⁶cfu/ml组：灌服浓度为10⁶cfu/ml的耐久肠球菌SWUN5857，0.5ml/只/d，连续7d；

10⁷cfu/ml组：灌服浓度为10⁷cfu/ml的耐久肠球菌SWUN5857，0.5ml/只/d，连续7d；

对照组：灌服等浓度的MRS培养基，0.5ml/只/d，连续7d；

每周各组小鼠分别称重一次，统计数据，分析结果后，筛选出对小鼠生长性能影响最佳的浓度进行正式试验。

正式试验：筛选出最佳浓度后，采用与预实验相同的分组方法，将56只雌性昆明鼠随机分为2组，每组28只，在环境为SPF级实验动物房隔笼饲养，自由采食。各组处理如下：

10⁵cfu/ml组：灌服浓度为10⁵cfu/ml的耐久肠球菌SWUN5857，0.5ml/只/d，连续7d；

培养基对照组：灌服等浓度的MRS培养基，0.5ml/只/d，连续7d；

各组在最后一次灌胃后间隔12h，对所有昆明小鼠肌注鸡新城疫弱毒鸡新城疫La Sota活毒冻干疫苗2头份/只。在免疫结束后第7、14、21天每组取出6只小鼠，眼球采血，迅速分成两份，一份不加抗凝剂，常温静置2h，血液凝固后分离获取血清，用于血清中抗体效价的测定；另一份使用肝素抗凝后，用于淋巴细胞转化实验。处死并解剖小鼠，分离并获得小鼠的脾脏和胸腺。

1.2小鼠体质量的测定

从开始灌胃起，每隔7d分别对各组小鼠称重一次，并记录结果。

1.3微量间接血凝抑制试验测定抗体水平

分别将每组小鼠眼球采血获得的0.3ml左右的非抗凝血制备的血清标记编号，放于56℃的水浴锅中灭活30min，采用β-微量法血凝抑制试验测定小鼠血清中新城疫抗体的效价(王延树,张芳.血凝和血凝抑制试验操作要领[J].中国动物保健,2009,(8):75-76.)。

1.3.1血球凝集试验(HA)

凝集试验在96孔V型微量反应板上进行，自左至右给各孔加上各加50μl生理盐水。分别将50μl新城疫标准抗原加入左侧第1孔，混合均匀后吸取50μl至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50μl，并以第12孔为对照孔，每个样设三个重复行。自右向左给各孔加入1％鸡红细胞悬液50μl，室温放置于振荡器上小心振荡2min，静置10～20min，等对照孔的红细胞完全沉淀便可进行结果观察，并判定标准抗原的血凝价，随后用生理盐水配制4个血凝单位的标准抗原。

1.3.2血凝抑制试验(HI)

用固定病毒稀释血清的方法，首先在96孔微量反应板上的各行第1孔至第11孔均加50μl生理盐水；然后每行的第1孔加入需检测的小鼠血清50μl，对应编号标记，并吹吸混合均匀，均吸取50μl至第2孔，依此倍比稀释至第11孔后弃去50μl。将96孔微量反应板从右至左全部孔各加50μl的4个血凝单位的新城疫标准抗原，其中第12列为新城疫标准抗原对照。在振荡器上小心震荡混匀，静置在室温中作用15min。向各个孔均加入1％鸡红细胞悬液50μl，振荡混匀，室温下静置后观察结果。血清的血凝抑制HI抗体效价为该血清100％抑制凝集的最大稀释度，用以2为底的负对数(-log2)表示，即Xlog2。

1.4淋巴细胞转化试验

1.4.1 CCK-8测定条件选取

参考王洪鸽等(王洪鸽.白花蛇舌草多糖和超微粉的免疫调节作用研究[D].西南民族大学，2013.)的L9(3⁴)正交表设计试验，细胞培养时间48h、刀豆蛋白A的浓度5μg/ml、细胞数1×106个/孔，加入CCK-8后培养时间4h时为CCK-8的测定条件。

1.4.2小鼠外周血淋巴细胞转化试验

ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化试验参考文献(陈肃标，谢素和，曾庆馀.提高外周血淋巴细胞梯度离心分离率[J].汕头大学医学院学报，2011,12(2)：135-137.)中的方法。

将无菌操作采得小鼠眼球肝素抗凝血0.5ml，按Ficoll密度梯度离心法分离外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)悬液。将抗凝血与等体积PBS轻轻震荡混匀，然后轻轻加在等体积的小鼠淋巴细胞分离液上，置于水平转子的离心机中离心，2000r/min离心15min。离心结束后可见位于血浆层下面的一层较薄的白色云雾状即为PBMC，小心将此层细胞吸出，然后用5倍体积的PBS洗涤细胞，2500r/min离心10min，并重复洗涤3次。最后一次离心后，吸取掉上层PBS，留下PBMC，加入200μl左右的无菌1640完全培养基(25mmol/L的l-谷氨酰胺、100U/mL的双抗和0.1mL/mL的胎牛血清)混匀，并吸取少许使用快速细胞分析仪进行计数，然后用无菌1640完全培养基分别将每份细胞悬液稀释成约10⁶个/ml，配制成单细胞悬液，按组别依次编号。

将每份小鼠分离得到的的PBMC悬液中取单细胞悬液100μl以组为单位接种于96孔培养板内，按照参照文献(赵世云,赵新新,苏华荔,等.猪外周血T淋巴细胞增殖反应MTT检测方法的建立[J].中国畜牧兽医,2010,(12):35-38.)，每份样品加两空，分为未刺激组和ConA组，未刺激组加入10μl1640完全培养基，ConA组每孔分别加入10μl浓度为5μg/ml的ConA，另各设3孔作空白组，各孔只加有110μl1640完全培养基。将培养板置于体积分数为5％的CO₂恒温培养箱里37℃培养48h。小心拿出培养板，无菌条件下向各孔加入10μl的CCK-8溶液并小心混匀，继续培养4h后，使用酶联免疫检测仪检测其在450nm处的吸光度A。按下面的公式计算对应小鼠样本的刺激指数(SI)。

1.5小鼠的脏器指数的测定

将各组小鼠眼球采血后处死，称量并解剖各时间点的小鼠，获得小鼠的脾脏和胸腺，立即用滤纸吸干表面的血液和水分，称重并记录，按照下面的公式计算脾脏指数(mg/g)和胸腺指数(mg/g)。

1.6腹腔巨噬细胞吞噬试验

按照文献(付绍玲.小鼠巨噬细胞吞噬功能测定实验方法探讨[J].湖北民族学院学报,2008,25(4):48-48.)的方法，通过测定各小组小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力来评价小鼠的非特异性免疫力。

从免疫后第22d开始连续3天给各组小鼠腹腔注射6％淀粉肉汤液，最后一次注射后1h后再腹腔注射5％鸡红细胞悬液1ml，轻揉小鼠腹部，使鸡红细胞分散的同时刺激小鼠腹腔巨噬细胞渗出，半小时后断颈处死小鼠。用酒精对小鼠体表消毒，迅速剖开腹腔，用无菌棉签蘸取小鼠腹腔液体，涂布于干净的玻片上，瑞氏染色镜检。

1.7饲喂耐久肠球菌SWUN5857对小鼠肠粘膜SIgA的影响

将48只雌鼠分为两组，每组24只，灌胃和饲养同上，在灌胃7d后的第1、7、14、21d各组随机取出6只小鼠，眼球采血获得血清用于检测小鼠的血液生化指标。采用张和平等(张和平，张七斤，孟和毕力格，等.L.casei Zhang对小鼠淋巴细胞亚群及血清IgG和肠黏膜SIgA的影响[J].中国乳品工业，2006,34(10):131-132)的方法，采血后立即解剖小鼠空肠和回肠,刮取肠黏膜放于1ml的PBS里，充分搅拌，10000rmp离心15min，获得上清液-20℃保存。采用双抗夹心ELISA法定量测定其中的sIgA含量。

1.8饲喂耐久肠球菌SWUN5857对小鼠血液生化的影响

每组抽取不同时期的4个上述血清，送至成都里来生物医学实验中心，检测血液生化指标。

1.9统计学处理

采用spss19.0软件对以上试验数据进行单因素方差分析，同时进行LSD比较，以P﹤0.05为具有统计学意义上的差异，以_χ±s表示。

2.结果

2.1耐久肠杆菌SWUN5857对小鼠体质量的影响

预实验中给药结束后不同时期各组小鼠体质量见表4。

表4饲喂耐久肠球菌SWUN5857对小鼠体质量的影响(g，X±S，n＝7)

注：**代表与对照组相比p<0.01,*代表与对照组相比p<0.05。下同。

从表4可见，给药结束后的各时间段内，10⁴cfu/ml组、10⁵cfu/ml组、10⁶cfu/ml组与对照组相比差异极显著(p<0.01)，而10⁷cfu/ml组只有在灌胃结束后1d与对照组差异显著(p<0.05)，其中饲喂10⁵cfu/ml组对小鼠的体质量的影响最大。结果表明，耐久肠球菌SWUN5857能够显著提高小鼠体质量，不同浓度的耐久肠球菌SWUN5857对小鼠体质量的影响存在差异，且从全期综合来看10⁵cfu/ml组效果最好。

正式实验中灌胃结束后不同时期各组小鼠体质量见表5。

表5饲喂10⁵cfu/ml耐久肠球菌SWUN5857对小鼠体质量的影响(X±S,n＝10)

由表5可见，灌胃结束后的各时间段，10⁵cfu/ml组与对照组相比差异极显著(p<0.01)。结果表明，10⁵cfu/ml耐久肠球菌SWUN5857能够显著提高小鼠的体质量。

2.2耐久肠球菌SWUN5857对小鼠体液免疫的影响

灌胃结束后不同时间各组小鼠血清抗ND HI抗体效价见表6。

表6灌胃耐久肠球菌SWUN5857对小鼠血清ND HI抗体效价的影响(log2,X±S,n＝6)

由表6可知，灌胃结束后第7、14d，10⁵cfu/ml组与对照组差异极显著(p<0.01)。结果表明，饲喂10⁵cfu/ml耐久肠球菌SWUN5857能够显著提高小鼠的体液免疫。

2.3饲喂耐久肠球菌SWUN5857对小鼠细胞免疫水平的影响

灌胃结束后不同时间各组见表7。

表7灌胃耐久肠球菌SWUN5857对小鼠外周血淋巴细胞增殖的刺激指数的影(X±S,n＝6)

由表7可知，灌胃结束后的第7、14d，10⁵cfu/ml组与对照组差异极显著(p<0.01)，且在第14d时达到最大；第21d差异显著(p<0.05)。结果表明，灌胃10⁵cfu/ml耐久肠球菌SWUN5857能够显著提高小鼠细胞免疫水平。

2.4饲喂耐久肠球菌SWUN5857不同时间对小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响

灌胃结束后不同时间各组小鼠的脾脏指数和胸腺指数见表8和表9。

表8灌胃耐久肠球菌SWUN5857对小鼠脾脏指数的影响(X±S，n＝6)

由表8可知灌胃结束后的第7天，10⁵cfu/ml组与对照组差异显著(p<0.05)，且实验组小鼠的脾脏指数在14天时达到最高，结果表明灌胃10⁵cfu/mL耐久肠球菌SWUN5857能够显著提高小鼠脾脏指数。

表9灌胃耐久肠球菌SWUN5857对小鼠胸腺指数的影响(X±S,n＝6)

由表9可知，在灌胃后的第7、14d实验组小鼠的胸腺指数高于对照组，且在灌胃后第14d时达到最高，但并没有统计意义。

2.5饲喂耐久肠球菌SWUN5857腹腔巨噬细胞吞噬吞噬能力的影响

灌胃结束后第22d，各组小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分比和吞噬指数结果见表10。

表10饲喂SWUN5857对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响(X±S,n＝10)

10⁵cfu/ml组小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分比和吞噬指数与对照组均差异显著(p<0.01)。结果表明，与对照组相比饲喂耐久肠球菌SWUN5857能够显著提高小鼠的非特异性免疫水平。

2.6耐久肠球菌SWUN5857对小鼠肠粘膜SIgA的影响

双抗夹心ELISA法测定各时间段小鼠肠粘膜SIgA的含量见表11。

表11饲喂SWUN5857不同时间对小鼠肠粘膜SIgA的影响(ng/mL,X±S,n＝6)

由表11可知，10⁵cfu/ml组各时间段小鼠肠粘膜SIgA的含量均高于对照组，且在灌胃一周结束后的第1d与对照组差异极显著。结果表明，饲喂耐久肠球菌SWUN5857能够显著提高小鼠肠粘膜SIgA的分泌。

2.7耐久肠球菌SWUN5857对小鼠血液生化的影响

表12(a)耐久肠球菌SWUN5857不同时期各组小鼠血液生化指标(x±S,n＝4)

表12(b)耐久肠球菌SWUN5857不同时期各组小鼠血液生化指标(x±S,n＝4)

灌胃耐久肠球菌SWUN5857 7 d后两组小鼠在各个时间点的生化指标见表。由表表12(a)和表12(b)可知，ALT、AST、ALP、TB、ALB、GLO、CRE、T、GLU等生化指标在各个时间点均没有统计学差异。说明耐久肠球菌SWUN5857对小鼠并无毒副作用。

实施例4耐久肠球菌SWUN5857降SD大鼠胆固醇试验

试验动物：SD大鼠、雄性、200±10g；

将28只SD大鼠适应性饲喂7天后，随机分成4组，每组7只；

1.对照组：高胆固醇饮食+灭菌生理盐水(100g/ml，每天)；

2.实验组：

(1)高胆固醇饮食+耐久肠球菌悬浮于灭菌生理盐水(2x10⁷CFU/ml、100g/ml，每天)；

(2)高胆固醇饮食+耐久肠球菌悬浮于灭菌生理盐水(2x10⁸CFU/ml、100g/ml，每天)；

(3)高胆固醇饮食+耐久肠球菌悬浮于灭菌生理盐水(2x10⁹CFU/ml、100g/ml，每天)；灌胃28天后，禁食12小时，解剖采集血液样本。

结果如下：血液生化指标结果见表13，其结果显示饲喂高胆固醇饲料后，SD大鼠胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白与空白组相比都有明显升高，而实验组与对照组相比胆固醇含量差异显著(P<0.05)，结果显示耐久肠球菌SWUN 5857能显著降低SD大鼠血清中胆固醇。

表13耐久肠球菌SWUN5857对大鼠胆固醇等指标的影响

注：*代表与对照组相比p<0.05。

动物的体重是机体营养吸收能力和健康状况的总体反应，本研究证明饲喂各个浓度的耐久肠球菌SWUN5857能够显著增加小鼠的体重，表明耐久肠球菌有良好的促生长作用；饲喂耐久肠球菌SWUN5857能够显著提高小鼠循环血液中的抗体水平，延长高抗体水平的作用时间，显著提高了小鼠的淋巴细胞转化率和腹腔巨噬细胞的吞噬能力；耐久肠球菌SWUN5857在灌胃结束后第7d显著提高了小鼠的脾脏指数，胸腺指数也有一定程度的提高，但未达到显著水平；饲喂耐久肠球菌SWUN5857能够显著提高小鼠肠粘膜SIgA的分泌量，表明了耐久肠球菌SWUN5857对小鼠的肠黏膜局部免疫具有增强和调节的功能，本实验中灌胃7d后的各时间点，10⁵cfu/ml组小鼠的血液生化指标与对照组没有显著差异，均在正常值范围内，表明饲喂耐久肠球菌SWUN5857一周对昆明鼠无消极影响；SD大鼠实验中实验组与对照组相比胆固醇含量差异显著(P<0.05)，表明耐久肠球菌SWUN 5857能显著降低SD大鼠血清中胆固醇，避免了因为机体胆固醇过高导致的一些列的疾病。

由上述结果可发现，耐久肠球菌SWUN5857具有良好的作为益生菌的潜力。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南民族大学

<120> 一株具有降血清胆固醇作用的耐久肠球菌及其应用

<130> 2017

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1197

<212> DNA

<213> 耐久肠杆菌SWUN5857

<400> 1

gcaggcgggt gctataatgc aagtcgtacg cttctttttc caccggagct tgctccaccg 60

gaaaaagaag agtggcgaac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcccat cagaagggga 120

taacacttgg aaacaggtgc taataccgta taacaatcga aaccgcatgg ttttgatttg 180

aaaggcgctt tcgggtgtcg ctgatggatg gacccgcggt gcattagcta gttggtgagg 240

taacggctca ccaaggccac gatgcatagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacattggg 300

actgagacac ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcg gcaatggacg 360

aaagtctgac cgagcaacgc cgcgtgagtg aagaaggttt tcggatcgta aaactctgtt 420

gttagagaag aacaaggatg agagtaactg ttcatccctt gacggtatct aaccagaaag 480

ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat 540

ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc 600

aaccggggag ggtcattgga aactgggaga cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc 660

atgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatatg gaggaacacc agtggcgaag gcggctctct 720

ggtctgtaac tgacgctgag gctcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg 780

tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttggaggg tttccgccct tcagtgctgc 840

agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa 900

ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 960

cttaccacgt cttgacatcc tttgaccact ctagagatag agcttcttct tcgggggcaa 1020

agtgacaggt ggtgcatgct gtcgtcagct cgtgtcgtga gatggtgggt taagtcccgc 1080

aacgagcgca acccttattg ttagcttgca tcaattcagc tgggcactct accaggactg 1140

cacggtgaca acccggacgg acggcggggg aatgacggtc gaatcattca tggctct 1197

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggctcaga ttgaacgc 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caggttcccc tacggtta 18