用于检测人类ALDH2基因多态性的引物、探针、试剂盒及方法与流程

本发明涉及基因工程
技术领域：
，具体涉及用于检测人类aldh2基因多态性的引物、探针、试剂盒及方法。
背景技术：
：硝酸甘油是预防和治疗冠心病、心绞痛的急用药物，作用原理是进入血管平滑肌细胞后，经线粒体乙醛脱氢酶2(aldh2)代谢形成一氧化氮(no)，no通过鸟苷酸环化酶促使钙离子进入肌浆网和细胞外，从而使血管平滑肌扩张，缓解心脏缺血症状。aldh2*2(glu504lys，rs671)多态导致所编码蛋白质的504位谷氨酸被赖氨酸所取代，携带突变等位基因aldh2*2的个体aldh2酶活性下降，杂合子酶活性仅为野生型个体的10％，突变纯合子酶活性缺失。因此，携带aldh2*2型的患者无法利用硝酸甘油抵抗心肌缺血。亚洲人群中aldh2*2等位基因的携带率为30～50％。携带aldh2*2等位基因的心绞痛患者应尽可能改用其他急救药物，避免硝酸甘油含服无效。目前临床应用的基因多态性检测方法主要有四种：直接测序法，pcr-基因芯片法，pcr-溶解曲线法和荧光定量pcr法。测序法虽然为基因多态性检测的“金标准”，但是由于其需要的检测时间长，操作复杂，并且灵敏度不高；pcr-基因芯片法的操作要求高，杂交和洗片都必须避光操作，并且芯片价格昂贵；pcr-溶解曲线法无特异性，并不能精确定位基因变化位置，并且只是因单个碱基差异造成的tm差异不是很明显，通常会造成在溶解曲线上的峰不是很清晰，因而这三种方法在临床上的推广都存在一定困难。传统荧光定量pcr法在临床上应用较为广泛，该方法对样本数量以及多态性分布有一定要求，样本量少时不能对样本基因多态性进行准确检测，对于检测人类aldh2基因多态性还无法满足高效、精准、简便等要求，同时还需要对样品进行基因组dna提取等繁琐复杂的操作流程，所以亟需一种快速、有效、精准且无需dna提取的检测方法。技术实现要素：本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，基于最新的科研动态和临床应用，重新设计了用于检测人类aldh2基因多态性的引物、探针以及方法。本发明的检测方法简便快速、精准有效、结果简单易辨别且对于小样本依然适用，甚至直接利用血液样品或滤纸干血片样品为模板进行检测也能获得很好的结果。为此，本发明一方面提供了一种用于检测人类aldh2基因多态性的引物和探针组合，其中引物序列如序列1和2所示，探针序列如序列3和4所示。在本发明优选的实施方案中，该引物和探针组合中，探针的5’端有fam或vic修饰，3’端有nfq-mgb修饰。在本发明进一步优选的实施方案中，该引物和探针组合中，每条引物的浓度为300nm，每条探针的浓度为200nm。本发明基于最新的科研动态和临床应用，重新设计了用于检测人类aldh2基因多态性的引物和探针。所设计的引物tm值均在60℃附近，整合搭配各个引物，从而尽量避免了引物二聚体的产生。同时选用mgb探针使得tm值均在70℃附近，避免了探针与其他非特异性序列之间的结合，同时也避免了探针相互之间形成复杂的二聚体，提高了荧光pcr扩增的特异性和效率。针对人类aldh2基因多态性的检测，本发明设计的具体引物和探针情况如表1所示。表1、aldh2基因检测的引物和探针情况表本发明另一方面提供了一种用于检测人类aldh2基因多态性的试剂盒，其包含本发明所述的引物和探针组合。在本发明优选的实施方案中，本发明的试剂盒中还包含阳性对照液和空白对照液，所述阳性对照液为分别含有三种不同aldh2等位基因的三种细胞系dna，所述空白对照液为te缓冲液。本发明另一方面提供了本发明所述的引物和探针组合在制备检测人类aldh2基因多态性试剂盒中的应用。本发明再一方面提供了本发明所述的引物和探针组合，或者本发明所述的试剂盒在检测人类aldh2基因多态性中的应用。本发明最后一方面提供了一种检测人类aldh2基因多态性的方法，其包含以下步骤：1、获取待测样品基因组dna、直接使用待测血液样品、或者直接使用待测滤纸干血片样品。当待测样品为基因组dna时，dna的提取可以采用tiangen或者qiagen公司的dna提取试剂盒，按照说明书进行操作即可。当待测样品为血液样品时，需要将血液与超纯水按照1：2的比例进行稀释，并混匀震荡，直接向反应孔中加入1ul即可。当待测样品为滤纸干血片样品时，直接将血液混匀后滴在滤纸上风干，用打孔取样器取出一片放入反应孔中即可。2、采用本发明所述的引物和探针组合，或者采用本发明所述的试剂盒，以步骤1中获取的基因组dna、血液样品或者滤纸干血片样品为模板，进行荧光pcr扩增。3、收集荧光信号，将数据结果直接导入美国应用生物学技术公司开发的基因分型专业分析软件taqmangenotyper中进行分析。在本发明优选的实施方案中，本发明直接使用待测血液样品或者待测滤纸干血片样品为模板进行荧光pcr扩增。在本发明进一步优选的实施方案中，20ul荧光pcr反应体系包括：10ul的荧光pcr缓冲液、1.2ul的引物混合液、0.8ul的探针混合液、0.2ul的ung酶、0.1ul的roxreferencedye、1ul的dna模板或血液模板(模板为滤纸干血片时只需一片即可)以及6.7ul的nuclease-freewater。具体的荧光pcr反应体系如表2所示。表2、荧光pcr检测aldh2基因多态性反应体系表pcr缓冲液10ul各条引物300nm各条探针200nmung酶0.2ulrox0.1ul基因组dna、血液样品或者滤纸干血片样品1ul或1片超纯水6.7ul所述荧光pcr反应程序为：50℃预处理3分钟，95℃预变性15分钟，预变性后按照以下程序进行40个循环：95℃15秒，60℃32秒；50℃数据读取1分钟；如果模板为血液样品或者滤纸干血片样品，则将循环数增至45。由上述描述可知，与现有技术相比，本发明具备如下优点。1、与现有的其它基因多态性检测技术相比，本发明的检测方法基于mgb探针pcr技术，mgb探针与普通taqman探针相比，3’为非荧光淬灭基团，可大大降低本底信号强度，具有更高的特异性。2、本发明的检测方法通过合理的引物和探针搭配，可以有效避免引物与引物之间、引物与探针之间以及探针与探针之间的相互作用，从而提高特异性，降低假阳性，减少检测误差。通过与一代测序结果对比，其准确率可达到100％，最低可检测到1ng的基因组dna。3、本发明针对不同的基因多态性分别提供了细胞株dna样本作为阳性对照，使基因多态性的荧光分型分析更为精准。同时本发明可以直接利用taqmangenotyper软件对单个或小(少)样本进行基因分型，结果判读直观方便。4、本发明的检测方法可以直接使用血液(静脉采血或指尖采血)或滤纸干血片作为模板，有效避免了基因组dna提取所消耗的时间、成本与精力。综上所述，本发明提供了一种简便快速、精准有效、结果简单易辨别且对于小样本依然适用，甚至直接利用血液样品或滤纸干血片样品为模板进行人类aldh2基因多态性检测的方法，对人类aldh2基因多态性检测有着非常重要的意义。附图说明图1：实施例1中采用含aldh2各基因多态性位点的细胞系dna样本验证本发明检测体系特异性的荧光分型结果图。图2a：实施例2中采用人类基因组dna样本检测aldh2基因多态性的结果与“金标准”的测序结果的比对，验证本发明检测体系的重复性与准确性。图2b：采用实施例2中的细胞系dna样本为阳性对照，随意检测单个样本，分型结果显示发明体系可以对单个样本进行检测。图3：实施例3中采用人类基因组dna样本检测aldh2基因多态性验证本发明检测体系灵敏度的检出限荧光分型结果图。图4：实施例4中采用人类临床基因组dna样本检测aldh2基因多态性的荧光分型结果图。图5：实施例5中采用人类临床血液样本检测aldh2基因多态性的荧光分型结果图。图6：实施例6中采用人类临床滤纸干血片样本检测aldh2基因多态性的荧光分型结果图。具体实施方式下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。实施例1：采用含aldh2各基因多态性位点的细胞系dna样本验证本发明检测体系的特异性本实施例以通过测序确定含有aldh2-gg型h2228细胞系、aldh2-aa型kasumi细胞系，以及aldh2-ga型kasumi与h2228杂合细胞系来验证本发明检测方法的可行性及特异性。具体检测方法如下：采用本说明书已说明的pcr反应体系和反应条件，以kasumidna、h2228dna以及kasumi与h2228的混合dna为模板，每个dna样本重复点样一次，进行检测。检测的基因分型结果如说明书附图1所示。其中ntc为阴性对照，h2228dna样本孔为aldh2-gg型，kasumidna样本孔为aldh2-aa型，kasumi与h2228的混合dna样本孔为aldh2-ga型。由此可见，本实施例的基因分型检测结果与各细胞系的aldh2snp突变位点相一致，表明采用本发明的检测体系可以特异性地进行人类aldh2基因多态性的分型检测。在此基础上，本发明采用这两种细胞系的dna样本为不同基因型的阳性对照。实施例2：采用人类基因组dna样本检测aldh2基因多态性验证本发明检测体系的重复性本实施例采用人类基因组dna样本，以其为模板进行荧光pcr基因分型检测，检测结果直接对比“金标准”的测序结果，以此来验证本发明检测体系的重复性与准确性。具体检测方法如下：采用本说明书已说明的pcr反应体系和反应条件，以人类基因组dna样本为模板进行荧光pcr基因分型检测。代表性的78例人类基因组dna样本的基因分型结果如说明书附图2a所示，其中ntc为阴性对照，除阳性对照外，47例样本为aldh2-gg型纯合子，28例样本为aldh2-ga型杂合子，3例样本为aldh2-aa型纯合子。在所有检测的200例人类基因组dna样本中，123例样本为aldh2-gg型纯合子，65例样本为aldh2-ga型杂合子，12例样本为aldh2-aa型纯合子。通过与“金标准”一代测序的结果比对，本发明的荧光pcr基因分型检测方法的正确率为100％。通过本实施例表明，利用本发明的检测体系进行aldh2基因多态性荧光pcr分型具有很好的重复性与准确性。针对目前很多基因检测方法很难做到对于单个样本或少量样本精确分型，本发明亦对此做出改进，采用本说明书的pcr反应体系、反应条件及分析方法，可直接检测单个样本或少量样本的基因型，结果真实可靠，说明本发明具有其它基因检测方法不具备的检测优势。具体实施例的基因分型结果如说明书附图2b所示，以本发明实施例1中的细胞系样本为阳性对照，随意检测单个样本，分型结果显示此样本的基因型为aldh2-ga型杂合子。实施例3：采用人类基因组dna样本检测aldh2基因多态性验证本发明检测体系的灵敏度本实施例同样以人类基因组dna样本为模板来验证本发明检测体系的灵敏性。具体检测方法如下：采用本说明书已说明的pcr反应体系和反应条件，选取7例人类基因组dna样本为模板进行荧光pcr基因分型检测，同时设置各dna模板检出限组分别为：0.05ng；0.1ng；0.5ng；1ng；10ng；50ng；100ng。结果显示，在dna模板量只有1ng的条件下仍然可以得到清晰的分型结果，代表性的基因分型结果如说明书附图3所示，其中ntc为阴性对照，除阳性对照外，5例样本为aldh2-gg型纯合子，1例样本为aldh2-ga型杂合子，1例样本为aldh2-aa型纯合子，分型结果真实、清晰。通过本实施例表明，利用本发明的检测体系进行aldh2基因多态性荧光pcr分型具有非常高的灵敏性。实施例4：采用人类临床基因组dna样本检测aldh2基因多态性本实施例采用临床患者基因组样本并以其为模板，按照本发明的检测体系进行人类aldh2基因多态性的分型检测。本实施例采用本说明书已说明的pcr反应体系和反应条件，通过与医院合作，获得69例临床患者基因组样本，并以此为模板进行荧光pcr基因分型检测。结果显示除阳性对照外，多态性呈aldh2-gg纯合型的有45例，多态性呈aldh2-ga杂合型的有20例，多态性呈aldh2-aa突变纯合型的有4例，与中国人群中该基因的分布频率基本吻合，基因分型结果如说明书附图4所示。本实施例说明本发明对于采用人类临床基因组dna作为样本检测aldh2基因多态性具有非常好的效果。实施例5：采用人类临床血液样本检测aldh2基因多态性本实施例采集临床患者外周血或骨髓血样本并以其为模板，按照本发明的检测体系进行人类aldh2基因多态性的分型检测。本实施例采用本说明书已说明的pcr反应体系和反应条件，具体的操作方法与本发明其它实施例相同，但模板为血液，故取得血液样本后需将血液与超纯水1:2稀释，震荡摇匀，吸取1ul血液加入至pcr反应孔中，上机检测即可。在具有代表性的本实施例的22个血液样本中，除阳性对照外，检测到多态性呈aldh2-gg纯合型的有15例，多态性呈aldh2-ga杂合型的有6例，多态性呈aldh2-aa突变纯合型的有1例，基因分型结果如说明书附图5所示。本实施例不需要目前主流基因分型检测方法所依赖的基因组dna提取与纯化等繁琐步骤，极大地简化了检测条件，节约了大量成本与时间，为本发明的一大特色。实施例6：采用人类临床滤纸干血片样本检测aldh2基因多态性本实施例采集临床患者滤纸干血片样本并以其为模板，按照本发明的检测体系进行人类aldh2基因多态性的分型检测。本实施例采用本说明书已说明的pcr反应体系和反应条件，具体操作时需在检测前制备好滤纸干血片，使用微孔取样器取出一片含有风干血样的样本加入至pcr反应孔中，上机检测即可。在具有代表性的本实施例的5个滤纸干血片样本中，除去阳性对照，检测到多态性呈aldh2-gg纯合型2例，多态性呈aldh2-ga杂合型3例。荧光曲线特异、完好，结果真实可靠，基因分型结果如说明书附图6所示。本实施例同样不需要基因组dna提取与纯化等繁琐步骤，简化了检测条件，节省了时间与成本，为本发明的一大特色。以上结果表明，本发明的人类aldh2基因多态性荧光pcr检测体系可以精准可靠地对人类aldh2的基因多态性进行快速检测。并且与其它检测方法相比，本发明的荧光pcr检测体系具有较高的灵敏度、特异性与准确性，检测工序简单，大大缩短了检测时间，节省了大量人力、物力与精力，提供了一种更加全新快速简便地检测人类aldh2基因多态性的方法，具有广泛的临床应用价值。序列表<110>上海荻硕贝肯生物科技有限公司<120>用于检测人类aldh2基因多态性的引物、探针、试剂盒及方法<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1ggctacaagatgtcggggag20<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列<400>2agaccctcaagccccaaca19<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列<400>3catacactgaagtgaaaa18<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<400>4catacactaaagtgaaaac19当前第1页12