一种定位引起酵母特殊生长表型的序列位置的方法与流程

本发明涉及功能基因组学技术领域，具体涉及一种定位引起酵母特殊生长表型的序列位置的方法。

背景技术：

随着DNA测序技术的普及，越来越多物种的全基因组信息被揭示，此外，转录组、蛋白质组、代谢组等相关组学技术的发展使得科学家们对生物细胞内各种复杂的代谢通路以及精细的调控机制有了更深刻的认知。最近几年，DNA合成成本的不断降低和大片段DNA组装技术的不断更新，使得人们可以利用合成生物学方法实现大尺度DNA的理性设计或者再造，从而达到微生物细胞的特性优化或以微生物作为细胞工厂实现化学品的规模生产。例如构建合成流感疫苗病毒以快速应对流感、多基因的遗传通路、细胞器基因组、噬菌体基因组、细菌基因组、酵母基因组甚至多细胞生物基因组。合成基因组学的发展把合成生物学带入了全新的阶段，我们可以对全基因组序列进行设计、合成和重排，建立全新的生物运行体系。其应用前景是不可估量的，合成基因组技术在改变人类生产生活的方式中具有巨大的潜力，例如把二氧化碳或生物质转化为高价值的产品，如食物、生物燃料、生物材料或生物医药。

酵母是合成生物学研究的重要模式生物，也是作为细胞工厂生产高价值产品的重要底盘细胞，但野生型酵母相关性状的获得需要耗时耗力低效率的随机突变筛选过程，或者需要进行长时间的理论摸索从而进行理性改造。合成型酵母是目前较为前沿的研究领域，其根据野生型酵母菌株的基因组信息，在野生型酵母功能基因的相应位置，采用人工合成的具有特异性标签的能够表达出相同蛋白的序列进行替换。通俗的讲，合成型酵母与野生型酵母的区别仅是对应的功能基因序列不同，但均能够表达出相同的功能蛋白。整个基因组全部采用人工合成序列的合成型酵母称为全合成型酵母，而整个基因组中部分采用人工合成序列的合成型酵母称为半合成型酵母。

采用合成型酵母的优势在于，其比野生型酵母基因组结构更加稳定，同时因为在构建合成型酵母时可以增加一些便于后续试验所需要的“插件”，所以增加了合成型酵母基因组的灵活性，利于酵母基因组的快速重排和人工改造。利用合成型酵母能够快速优化酵母底盘细胞，得到相关性状(耐受性、化学品产率)提升的酵母菌株，这是野生型酵母无法具备的优势。

化学合成全新的物种基因组或者构建人工的生物系统需要科学家对每一个生物学细节都有深刻的理解，然而生物体并不是元件或模块的简单拼接。由于生命运作规律的复杂性以及人类认知的局限性，理性设计改造的基因组中往往会非主观的引入一些引起细胞生长缺陷的改变。合成型酵母同样不例外，虽然从开始就极力避免一些能够影响酵母菌株生长性状的序列的导入，但是生物体是一种精细的系统，人工设计的序列存在一定的意外，表现在宏观层面就是合成型酵母出现异于野生型酵母的生长性状，而这些特殊生长表型一般都是对实际培养或生产不利的，例如在30℃的YPGE培养基上长势变差等。而此时，对引起细胞生长缺陷的合成型序列的定位会随着合成基因组规模的扩大成为一件耗时耗力的工作。

同样地，某些野生型酵母也会存在一些对实际培养或生产不利的特殊生长表型，而其相对的全合成酵母或半合成酵母就消除了这种特殊生长表型，对规模较大的野生型酵母基因组来说，对引起细胞生长缺陷的序列的定位同样是一件繁琐的工作。

酵母是一个可以发生高效的同源重组的生物体，传统的对酵母细胞功能基因组研究的方式是利用酵母细胞减数分裂时非姐妹染色单体之间的信息交换，实现对引起生长缺陷靶点的定位。这个过程需要利用酵母显微操作仪进行大量四分体的拆分，以及对成千上万的单个孢子进行逐一基因型验证，是一个耗时耗力的过程。因此，需要一种可以高效的对产生合成型酵母菌特殊生长表型的序列位置定位的方法来解决目前的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种定位引起酵母特殊生长表型的序列位置的方法，使得所述方法能够更加简便和快速。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种定位引起全合成酵母或半合成酵母特殊生长表型的序列位置的方法，包括：

步骤1、将具有特殊生长表型的全合成酵母或半合成酵母与正常生长表型的野生型酵母交配形成二倍体酵母菌株(也称为回交)，然后进行生孢培养使所述二倍体酵母菌株发生减数分裂，收集所有孢子，获得杂合单倍体孢子库；或

合成型染色体片段替换正常生长表型的酵母野生型染色体获得的具有特殊生长表型的半合成酵母，通过收集替换过程中因同源重组产生的所有转化子，获得杂合单倍体转化子库；

步骤2、根据正常生长表型和特殊生长表型设置选择性培养条件，将杂合单倍体孢子库或杂合单倍体转化子库分为正常表型库和特殊表型库；

步骤3、分别提取正常表型库和特殊表型库中所有菌株的DNA，然后设计全合成酵母或半合成酵母每个功能基因的扩增引物，称为合成型扩增引物，设计野生型酵母每个功能基因的扩增引物，称为野生型扩增引物，以本步骤所述DNA为模板分别进行混合菌落PCR扩增；

步骤4、记录正常生长表型的菌株库DNA采用合成型扩增引物扩增后无法扩增出条带的功能基因位置，以及特殊生长表型的菌株库DNA采用野生型扩增引物扩增后无法扩增出条带的功能基因位置，两者重叠的功能基因位置即为引起全合成酵母或半合成酵母特殊生长表型的序列位置。

由于现有的定位过程需要进行大量四分体的拆分以及单个孢子(单倍体菌株)的基因型验证，这中工作量是极其庞大、繁琐的。针对这个问题，本发明提出上述高效的定位方法。

本发明所述全合成酵母为含有完整合成型染色体的酵母，所述半合成酵母为含有部分合成型染色体和部分野生型染色体的酵母。

为了便于理解本发明的技术思路，在图1所示的方法流程图的基础上对本发明方法的原理进行阐述：

具有特殊生长表型的全合成酵母或半合成酵母与野生型酵母交配形成二倍体后进行减数分裂，在减数分裂时酵母染色体之间会发生不同情形的链交换，这就使最终的单倍体孢子成为即包含合成型染色体又包含野生型染色体的杂合单倍体孢子，并且具有多种情形，所有的杂合单倍体孢子就形成了一个库，在这个库中存在特殊生长表型和正常生长表型两类菌，将其分成正常表型库和特殊表型库。

全合成酵母或半合成酵母与野生型酵母在功能基因序列上存在差别，针对这个差别本发明设计每个功能基因的扩增引物，每个合成型功能基因的引物共同组成合成型扩增引物，而每个野生型功能基因的引物共同组成野生型扩增引物。合成型扩增引物只能扩增出合成型功能基因的条带，而野生型扩增引物只能扩增出野生型功能基因的条带，借助这种特异性，本发明用合成型扩增引物和野生型扩增引物以正常表型库/特殊表型库的所有菌落DNA为模板，分别进行PCR，由于是正常表型，那么引起特殊表型的序列在链交换时都被替换成了野生型染色体，而合成型扩增引物无法扩增出这个位置的序列条带，但链交换的形式是多种多样的，肯定存在其他位置的序列也被野生型染色体替换，仅依靠正常表型菌的扩增结果无法准确定位，还需要借助特殊表型菌的扩增结果。

由于是特殊表型，那么引起特殊表型的序列在链交换时都被替换成了合成型染色体，而野生型扩增引物无法扩增出这个位置的序列条带，两种结果进行重叠，就可以排除正常表型菌中其他位置的序列也被野生型染色体替换无法扩增出条带的情形，直接定位出引起特殊表型的序列位置。

在半合成酵母的分类中，包括构建全合成酵母过程中产生的酵母、全合成酵母和野生型酵母发生链交换产生的酵母或合成型染色体片段替换酵母野生型染色体产生的酵母。这些类型的半合成酵母都可以采用和野生型酵母交配的方式进行定位，同时针对合成型染色体片段替换酵母(包括半合成酵母和野生型酵母)野生型染色体产生的半合成酵母，其在替换过程中就可以通过酵母同源重组形成和上述杂合单倍体孢子相同的情形，根据本领域专业术语的定义，其称为杂合单倍体转化子，而所有的杂合单倍体转化子则组成了单倍体转化子库，剩余的定位步骤与前述相同。因此，本发明也将这种建库方式记载在步骤1中。

在获得了定位结果后，为了更加严谨，还可以对定位结果进行验证，选择如下两种方式之一：

(1)正常表型菌中，在引起特殊生长表型的序列位置，引入合成型染色体，如果正常表型菌出现全合成酵母或半合成酵母相同的特殊生长表型，则证明序列定位结果正确；

(2)特殊表型菌中，在引起特殊生长表型的序列位置，引入野生型染色体，如果特殊表型菌恢复为野生型酵母正常生长表型，则证明序列定位结果正确。

依据上述技术思路，本发明同样可以高效定位引起野生型酵母特殊生长表型的序列的位置，具体步骤如下：

步骤1、将具有特殊生长表型的野生型酵母与正常生长表型的全合成酵母或半合成酵母交配形成二倍体酵母菌株，然后进行生孢培养使所述二倍体酵母菌株发生减数分裂，收集所有孢子，获得杂合单倍体孢子库；

步骤2、根据正常生长表型和特殊生长表型设置选择性培养条件，将杂合单倍体孢子库分为正常表型库和特殊表型库；

步骤3、分别提取正常表型库和特殊表型库中所有菌株的DNA，然后设计全合成酵母或半合成酵母每个功能基因的扩增引物，称为合成型扩增引物，设计野生型酵母每个功能基因的扩增引物，称为野生型扩增引物，以本步骤所述DNA为模板分别进行混合菌落PCR扩增；

步骤4、记录正常生长表型的菌株库DNA采用野生型扩增引物扩增后无法扩增出条带的功能基因位置，以及特殊生长表型的菌株库DNA采用合成型扩增引物扩增后无法扩增出条带的功能基因位置，两者重叠的功能基因位置即为引起野生型酵母特殊生长表型的序列位置。

由于野生型酵母不存在半合成酵母形成转化子的情形，故在对引起野生型酵母特殊生长表型的序列的定位中，只通过构建孢子库的形式进行。

在本领域中，对酵母的生孢培养(减数分裂)能够得到数量极为庞大的菌落，因此所述杂合单倍体孢子库有足够多的信息量，即包含了足够多的因链交换的杂合情形，同样地，在形成转化子的过程中，酵母的数量和因同源重组形成的杂合情形也极其丰富，从而使本发明方法实现了准确定位。

作为优选，步骤1所述生孢培养为在生孢培养基上于25℃、200转/分钟条件下培养4-7天。

在本发明的具体实施方式中，引物的设计原则按照常规即可，所述PCR体系可选择如下：

总体积为20μL，包括10x Taq Buffer 2μL，2.5mM dNTPs 2μL，上游引物(10μM)0.4μL，下游引物(10μM)0.4μL，ddH₂O 14μL，TransFast Taq DNA Polymerase 0.2μL，模板DNA 1μL。

所述PCR程序可参照如下：

94℃预变性4min；94℃变性30s；53℃退火30s；72℃延伸30s；30个循环；72℃延伸3min,4℃保存。

本发明正常表型菌和特殊表型菌的分离方法，根据正常生长表型和特殊生长表型设置选择性培养条件，例如特殊生长表型为在非发酵碳源培养基(YPGE)或者高温(37℃)的培养条件下长势较差，那么就可以根据这种特殊生长表型设置对应的培养基、温度等培养条件，实现两种生长表型的菌的分离。

本发明中所述特殊生长表型和正常生长表型是一对相对概念，其没有绝对的正常和特殊区分，一般来讲是根据人类实际应用来划分，通常是将不利于人类实际应用的表型划分为特殊生长表型，以酵母在30℃的YPGE培养基上长势较差这种生长表型为例，由于这种生长表型对于人类的实际应用较为不利，故其被定义为特殊生长表型；如果这种表型对实际应用有利，则其为正常生长表型。

在对全合成或半合成酵母定位过程中，特殊生长表型为全合成或半合成酵母生长状态相对于野生型酵母生长状态出现差异的特征。在对野生型酵母定位过程中，特殊生长表型为野生型酵母生长状态相对于全合成或半合成酵母生长状态出现差异的特征。这些特征可选自如下一项或多项：(1)温度耐受性发生显著变化；(2)目标产物产量发生显著变化；(3)耐药性发生显著变化；(4)对代谢过程中的目标产物或副产物耐受性发生显著变化。

在本发明具体实施方式中，本发明以半合成酿酒酵母yYW0062(对应的野生型酿酒酵母为BY4741)为试验对象进行验证试验，半合成酵母yYW0062在用合成型染色体片段替换酿酒酵母BY4741野生型染色体后，出现在30℃YPGE平板长势明显降低的特殊表型。按照本发明方法，以构建杂合单倍体转化子库的方式进行序列的准确定位，发现菌株yYW0062在YPGE上有生长缺陷的靶点定位到基因YJR121W(ATP2)附近。分析基因YJR121W附近的合成型改动，发现在基因YJR120W开放阅读框(ORF)的3’端有一段合成型特异性序列(loxPsym)插入。分析野生型对照菌株和菌株yYW0062基因ATP2的转录水平，可以发现在菌株yYW0062中基因ATP2的转录水平降低约60％，推测原因为合成型特异性序列的插入破坏了ATP2的启动子区域而影响了基因ATP2的正常转录。在菌株yYW0062中将定位区域的loxPsym序列移除后，发现菌株可以在YPGE培养基上恢复正常的生长，而且ATP2的转录也恢复了正常水平。

由以上技术方案可知，本发明所述方法利用全合成酵母或半合成酵母与野生型酵母在功能基因上的序列差异，采用合成型扩增引物和野生型扩增引物，分别对特殊生长表型和正常生长表型的酵母进行PCR，根据结果分别锁定正常生长表型酵母DNA和特殊生长表型酵母DNA采用扩增引物扩增后无法扩增出条带的功能基因位置，从而快速确定两者重叠的功能基因位置即为引起酵母特殊生长表型的序列位置，避免了耗时耗力的单独菌株的基因型验证过程。

附图说明

图1所示为本发明所述方法的流程示意图；其中，SYN表示合成型扩增引物扩增条带，WT表示野生型扩增引物扩增条带；a代表正常表型菌利用合成型扩增引物无法扩增出条带的结果，c代表特殊表型菌利用野生型扩增引物无法扩增出条带的结果，b代表a、c结果的重叠；绿色代表野生型染色体，红色代表合成型染色体；半合成的染色体、合成型染色体、野生型染色体分别代表半合成酵母、全合成酵母和野生型酵母，合成型模块表示合成型染色体片段；

图2所示为移除引发特殊表型序列的酵母yYW0062、酵母yYW0062和野生型对照菌株的菌落梯度稀释平板培养结果以及相关联基因转录水平结果；其中，平板培养结果中菌落梯度稀释从左至右依次稀释倍数×10，直到有单菌落出现，培养条件是在相同的30℃YPGE平板下。

具体实施方式

本发明公开了一种定位引起酵母特殊生长表型的序列位置的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

以下就本发明所提供的一种定位引起酵母特殊生长表型的序列位置的方法做进一步说明。

实施例1：对半合成酵母yYW0062的序列定位

半合成酵母菌株yYW0062(从野生型酿酒酵母菌BY4741出发，通过合成型片段的逐步替换得到的半合成的酵母菌株)在30℃非发酵型碳源培养基(YPGE)上有生长缺陷，而菌株BY4741不存在(见图2)。收集合成型模块整合过程中产生的转化子构建转化子文库，将转化子文库翻印到YPGE的培养基上，2天后观察转化子在YPGE上的长势。根据上述特殊生长表型设置选择性培养条件，在存在筛选压力的情况下可将转化子分为两类：在YPGE上正常生长的转化子库，在YPGE上有生长缺陷的转化子库。利用半合成酵母染色体特有的PCR标签和野生型酵母染色体特有的PCR标签，设计两者每一个功能基因的扩增引物，分别提取两个有不同表型的菌株库的混合基因组DNA作为PCR反应的模版，针对该合成型模块区域进行PCR反应。

PCR反应如下：使用20μL的PCR反应体系：10x Taq Buffer 2μL，2.5mM dNTPs 2μL，上游引物(10μM)0.4μL，下游引物(10μM)0.4μL，ddH2O 14μL，TransFast Taq DNA Polymerase 0.2μL，模板DNA1μL。PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s；53℃退火30s；72℃延伸30s；30个循环；72℃延伸3min,4℃保存。

分析PCR胶图结果，针对在YPGE上有生长缺陷的转化子库会有野生型扩增引物不能扩增出条带的区域，与此同时，针对正常生长表型的转化子库会有一段合成型扩增引物不能扩增出条带的区域，这两个区域的重叠区域将引起菌株yYW0062在YPGE上有生长缺陷的靶点定位到基因YJR121W(ATP2)附近。

分析基因YJR121W附近的合成型改动，发现在基因YJR120W开放阅读框(ORF)的3’端有一段合成型特异性序列(loxPsym)插入。分析野生型对照菌株和菌株yYW0062基因ATP2的转录水平，可以发现在菌株yYW0062中基因ATP2的转录水平降低约60％，推测原因为合成型特异性序列的插入破坏了ATP2的启动子区域而影响了基因ATP2的正常转录。在菌株yYW0062中将定位区域的loxPsym序列移除后，发现菌株可以在YPGE培养基上恢复正常的生长，而且ATP2的转录也恢复了正常水平(图2)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。