本发明涉及小花清风藤中一种新化合物的制备方法及应用，属于医药技术领域。
背景技术：
小花清风藤为清风藤科清风藤属藤本植物小花清风藤Sabia parviflora Wall.ex Roxb.的干燥茎。贵州产小花清风藤为布依族、苗族的民间药，主要分布在贵州的兴义市、安龙县、册亨县、望谟县等地，其根茎、叶均可入药，有祛风除湿、消炎止痛的作用，治疗甲型和乙型病毒性肝炎疗效显著，且副作用小。其相关品种，临床多用于肝脏部位的相关疾病，然而，目前小花清风藤中主要活性成分不明，其肝部疾病的作用物质仍不清楚。
技术实现要素：
本发明的目的是对小花清风藤的化学成分进行深入研究，提供一种新化合物的制备方法及应用。
小花清风藤中一种新化合物：2,2,7-三甲基-2,7,8,9-四氢-7-羟甲基-2H-萘并(2,3-b)吡喃-6-酮，其结构式如下：
小花清风藤中一种新化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取干燥的小花清风藤药材，加入12倍重量的浓度70％乙醇提取三次，时间分别为5小时、3小时、3小时，过滤，合并提取液，减压浓缩至无醇味，得到提取物；
(2)取步骤(1)的提取物加入浓度为20-50％乙醇增溶，用离心机离心除去不溶物，得到上清液；
(3)取步骤(2)得到的上清液上大孔树脂柱，先用30％乙醇-水洗脱5个柱体积，得到流份1，再用50％乙醇-水洗脱5个柱体积，浓缩，干燥，得到流份2，取流份2经200-300目的硅胶柱层析，用二氯甲烷和甲醇的混合液依次按体积比20:1、10:1、5:1、2:1梯度洗脱，每个浓度梯度洗脱4个柱体积，每个柱体积接4个流份，每个流份500ml，共得到16个流份，取二氯甲烷和甲醇的混合液体积比为20:1洗脱的4个流分，合并，经凝胶柱层析，用甲醇洗脱10次，依次得到10个流份，每个流份50ml，取流份3-8合并，再经ODS中低压柱层析，用甲醇和水的混合液依次按体积比1:9、3:7、1:1、7:3、1:0洗脱，取甲醇和水的混合液体积比为1:0洗脱得到的流份，最后用制备高效液相色谱，色谱条件为：ODS色谱柱，甲醇-水55：45为流动相，保留时间37min，最后分离得到纯的化合物。
其中，步骤(1)中所述的提取方法为冷浸法、渗漉法、微波提取法、超声提取法、回流提取法或连续回流提取法。
本发明提供了小花清风藤中一种新化合物在制备保肝药物中的应用。
本发明提供了一种药物组合物，其包括治疗有效量的小花清风藤中一种新化合物及其药学上可接受的载体，制备成片剂、胶囊剂、注射剂、粉针剂、颗粒剂、脂肪乳剂、微囊、滴丸、软膏剂或透皮控释贴剂。
附图说明
图1为本发明提供的小花清风藤中一种新化合物的结构示意图；
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好的理解本发明。
实施例1
小花清风藤中一种新化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取干燥的小花清风藤药材100kg，加入12倍重量的浓度70％乙醇提取三次，时间分别为5小时、3小时、3小时，过滤，合并提取液，减压浓缩至无醇味，得到提取物；
(2)取步骤(1)的提取物加入浓度为20-50％乙醇增溶，用离心机离心除去不溶物，得到上清液；
(3)取步骤(2)得到的上清液上大孔树脂柱，先用30％乙醇-水洗脱5个柱体积，得到流份1，再用50％乙醇-水洗脱5个柱体积，浓缩，干燥，得到流份2，取流份2经200-300目的硅胶柱层析，用二氯甲烷和甲醇的混合液依次按体积比20:1、10:1、5:1、2:1梯度洗脱，每个浓度梯度洗脱4个柱体积，每个柱体积接4个流份，每个流份500ml，共得到16个流份，取二氯甲烷和甲醇的混合液体积比为20:1洗脱的4个流分，合并，经凝胶柱层析，用甲醇洗脱10次，依次得到10个流份，每个流份50ml，取流份3-8合并，再经ODS中低压柱层析，用甲醇和水的混合液依次按体积比1:9、3:7、1:1、7:3、1:0洗脱，取甲醇和水的混合液体积比为1:0洗脱得到的流份，最后用制备高效液相色谱，色谱条件为：ODS色谱柱，甲醇-水55：45为流动相，保留时间37min，最后分离得到纯的化合物(收率：780mg，纯度：99.1％)，结构式图如附图1所示。
化合物的结构解析：
主要利用光谱技术，包括紫外、红外、质谱、核磁共振(1H-NMR、13C-NMR、2D-NMR)鉴定其结构，再经TOF高分辨质谱精确确定其分子量及分子式。
其波谱数据如下：
(1)白色无定形粉末，高分辨质谱ESI-TOF-MS：287.1272[M-H]-。其分子式可能为C17H20O4，NMR谱中δC:202.03(C-6),表明结构中存在羰基；δC：18.89,28.76,28.80，δH:1.16,1.43,1.42(each 3H,s,-CH3)，为三个甲基信号，δC：117.39(C-10),143.82(C-9a),159.61(C-1a),126.32(C-5),126.67(C-6a),121.45(C-4a),δH:7.61(1H,s,H-5),6.61(1H,s,H-10),提示结构中含一四取代的苯环，δC：122.61(C-4),132.33(C-3),δH:5.74(1H,d,J＝10.2Hz,H-3),6.41(1H,d,J＝9.6Hz,H-4)，表明结构有一个顺式双键。δC:73.81(C-8),δH:4.22(1H,dd,J＝3.7,4.7Hz,H-8),δC:35.32(C-9),δH:3.01(1H,dd,J＝4.9,17.5Hz,H-9a),3.24(1H,dd,J＝3.5,17.7Hz,H-9b),提示结构中含有-CH-CH2-结构基团，结合HMBC,HSQC,等二维核磁共振波谱数据，最终确定化合物的结构，如附图1所示。
1H NMR(600MHz,CD3OD)δH:1.16,(3H,s,-CH3),1.43,1.42(each 3H,s,-CH3),5.74(1H,d,J＝10.2Hz,H-3),6.41(1H,d,J＝9.6Hz,H-4),6.61(1H,s,H-5),22(1H,dd,J＝3.7,4.7Hz,H-8),3.01(1H,dd,J＝4.9,17.5Hz,H-9a),3.24(1H,dd,J＝3.5,17.7Hz,H-9b),6.61(1H,s,H-10),3.81(1H,d,J＝10.8Hz,H-11a),3.97(1H,d,J＝10.8Hz,H-11b).13C NMR(150MHz,CD3OD)δC:28.80,159.61(C-1a),78.88(C-2),132.33(C-3),122.61(C-4),121.45(C-4a),126.32(C-5),202.03(C-6),126.67(C-6a),52.25(C-7),73.81(C-8),35.32(C-9),143.82(C-9a),117.39(C-10),66.06(C-11),28.80(C-12),18.89(C-13),28.76(C-14).
实施例2药效实验研究
一、实验材料与动物
1.药物和试剂
谷丙转氨酶测定试剂盒(R1、R2)(日本和光纯药工业株式会社)、谷草转氨酶测定试剂盒(R1、R2)(日本和光纯药工业株式会社)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)；四氯化碳(分析纯)，临用前用花生油配制成0.1％的花生油溶液；D-氨基半乳糖(上海润成生物科技有限公司)，临用前用生理盐水配成10％的水溶液；双环醇片(北京协和药厂)，临用前磨成细粉用0.5％CMC-Na制成1.25mg/ml混悬液。
2.实验动物
清洁级ICR小鼠，体重18-22g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号：SCXK(湘)2013-0004。
3.实验仪器
日立7180型全自动生化分析仪(日立公司)，AL204型电子分析天平(Mettler Toledo仪器(上海)有限公司)，HC-3018R型高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)，MTV—100型多管漩涡混合仪(杭州奥盛仪器有限公司),KQ-4000B型超声清洗机(巩义市予华仪器有限责任公司)。
4.受试药物及处理方法
取实施例1制备得到的化合物，加水稀释成浓度为1.5mg/ml,阳性药为双环醇，临用前磨成细粉用0.5％CMC-Na制成所需浓度的混悬液。
二、实验方法
1.对CCl4致小鼠急性肝损伤的影响
取ICR雄性小鼠48只，随机分成4组：空白对照组、模型组、阳性药双环醇组(25mg·kg-1·d-1)、实施例1制备得到的化合物组(30mg·kg-1·d-1)。空白对照组和模型组给予等量蒸馏水，给药组灌胃给药，连续7d，于末次给药后2h，除空白对照组外，其余各组腹腔注射0.1％CCl4花生油溶液10mL·kg-1；空白对照组腹腔注射同体积的生理盐水，禁食不禁水，16h后眼眶取血。所取得血液，以3000r·min-1离心10min，取上清液，按试剂盒操作方法测定CCl4致肝损伤小鼠血清中ALT、AST含量。取血后处死小鼠，迅速取肝脏、将周围结缔组织剔除后放入冰冷的生理盐水中清洗血污，取部分肝脏，制成10％肝匀浆，按照试剂盒说明测定MDA含量及SOD活力。
2.对D-氨基半乳糖致小鼠急性肝损伤的影响
取ICR雄性小鼠48只，随机分成4组：空白对照组、模型组、阳性药双环醇组(25mg·kg-1·d-1)、实施例1制备得到的化合物组(30mg·kg-1·d-1)。空白对照组和模型组给予等量蒸馏水，给药组灌胃给药，连续7d，于末次给药后2h，除空白对照组外，其余各组腹腔注射10％D-氨基半乳糖溶液10mL·kg-1；空白对照组腹腔注射同体积的生理盐水，禁食不禁水，16h后眼眶取血。所取得血液，以3000r·min-1离心10min，取上清液，按试剂盒操作方法测定D-氨基半乳糖致肝损伤小鼠血清中ALT、AST含量。取血后处死小鼠，迅速取肝脏、将周围结缔组织剔除后放入冰冷的生理盐水中清洗血污，取部分肝脏，制成10％肝匀浆，按照试剂盒说明测定MDA含量及SOD活力。
3.对乙醇致小鼠肝损伤的影响
取ICR雄性小鼠48只，随机分成4组：空白对照组、模型组、阳性药双环醇组(25mg·kg-1·d-1)、实施例1制备得到的化合物组(30mg·kg-1·d-1)。空白对照组小鼠给予生理盐水10ml/kg，2次，间隔4h。模型组小鼠给予生理盐水10ml/kg，间隔4h后，给予50％乙醇5ml/kg。阳性药组小鼠给予双环醇药物，间隔4h后，给予50％乙醇5ml/kg。实施例1制备得到的化合物组小鼠给予实施例1制备得到的化合物，间隔4h后，给予50％乙醇5ml/kg。按照以上分组方法，生理盐水、酒精以及双环醇、实施例1制备得到的化合物的给予方式均为经口灌胃，每天一次，连续20d。末次灌胃24h后眼眶取血。所取得血液，以3 000r·min-1离心10min，取上清液，按试剂盒操作方法测定酒精致肝损伤小鼠血清中ALT、AST含量。取血后处死小鼠，迅速取肝脏、将周围结缔组织剔除后放入冰冷的生理盐水中清洗血污，取部分肝脏，制成10％肝匀浆，按照试剂盒说明测定MDA含量及SOD活力。
4.统计学处理
各组实验数据均以表示，采用统计软件SPSS 19.0，肝损伤试验血清中各指标测定的数据采用方差分析组间比较t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
三、实验结果
1、本化合物对CCl4致小鼠急性肝损伤的影响
CCl4肝损伤模型组与正常组比较，小鼠血清ALT、AST和肝组织MDA水平明显升高(P<0.01)，SOD活性明显降低(P<0.01)；本发明的化合物、双环醇组与模型组比较，均不同程度地使肝损伤小鼠血清ALT、AST降低(P<0.01)；本化合物具有降低肝组织MDA水平，升高肝组织SOD水平的功效；具体实验结果见表1。
表1本化合物对CCl4致急性肝损伤小鼠血清ALT、AST及肝脏SOD、MDA的影响(mean±SD，n＝12)
注：*代表与模型组相比较，差异显著(*P<0.05)，**代表与模型组相比较，差异极显著(**P<0.01)。
2、本化合物对D-氨基半乳糖致小鼠急性肝损伤的影响
D-氨基半乳糖肝损伤模型组与正常组比较，小鼠血清ALT、AST和肝组织MDA水平明显升高(P<0.01)，SOD活性明显降低(P<0.01)；实施例1制备得到的化合物组和双环醇组与模型组比较均不同程度地使肝损伤小鼠血清ALT、AST降低(P<0.01)；实施例1制备得到的化合物组和双环醇组与模型组比较均不同程度地使肝损伤小鼠组织MDA水平降低(P<0.05)，SOD水平升高(P<0.05)。具体实验结果见表2。
表2本化合物对D-氨基半乳糖致急性肝损伤小鼠血清ALT、AST及肝脏SOD、MDA的影响(mean±SD，n＝12)
注：*代表与模型组相比较，差异显著(*P<0.05)，**代表与模型组相比较，差异极显著(**P<0.01)。
3、本化合物对乙醇致小鼠急性肝损伤的影响
乙醇致肝损伤模型组与正常组比较，小鼠血清ALT、AST和肝组织MDA水平明显升高(P<0.01)，SOD活性明显降低(P<0.01)；实施例1制备得到的化合物组、双环醇组与模型组比较均不同程度地使肝损伤小鼠血清ALT、AST降低(P<0.05)；实施例1制备得到的化合物组和双环醇组与模型组比较均不同程度地使肝损伤小鼠组织MDA水平降低(P<0.05)，SOD水平升高(P<0.05)。具体实验结果见表3。
表3化合物对乙醇致肝损伤小鼠血清ALT、AST及肝脏SOD、MDA的影响(mean±SD，n＝12)
注：*代表与模型组相比较，差异显著(*P<0.05)，**代表与模型组相比较，差异极显著(**P<0.01)。
以上实验结果表明，本发明提供的化合物可显著降低CCl4、D-氨基半乳糖和乙醇所致肝损伤模型小鼠血清ALT、AST含量、肝组织MDA含量，增强肝脏SOD活性。
因此，本发明制备得到的新的化合物有望开发成为新一代安全有效，用于防治肝损伤的药物或保健品。