褐飞虱NlMLP基因、编码蛋白及其应用的利记博彩app

本发明涉及生物技术领域。具体涉及褐飞虱NlMLP基因及其dsRNA和针对该基因的RNA干扰在控制褐飞虱方面的应用。

背景技术：

褐飞虱(BPH；Nilaparvata lugens )，属同翅目飞虱科(Homoptera；Delphacidae)，是我国及许多亚洲国家水稻上的首要害虫。褐飞虱有远距离迁飞习性，是单食性害虫，只能在水稻和普通野生稻上取食和繁殖后代。褐飞虱的刺吸式口器可以刺入植物体内，吸食韧皮部汁液。褐飞虱不仅仅只取食韧皮部汁液，造成直接损伤，而且褐飞虱是草状丛矮病和齿叶矮缩病传播的媒介，从而引起间接损伤。褐飞虱取食分蘖期之前的水稻，会引起水稻穗数和谷粒数的减少；褐飞虱取食成熟期的水稻，会引起成熟谷粒的数目减少，重量减轻。水稻被褐飞虱危害严重时，会造成水稻大面积死亡，出现“飞虱火烧”的现象，从而颗粒无收。很早之前，褐飞虱虽然零星爆发，但是一旦发生就是灾难性的(Suenaga&Nakatsuka,1958；Miyashita,1963)。自1970年后，褐飞虱在一些热带国家频繁爆发。2000年之后整个亚洲水稻产地褐飞虱爆发的频率和规模均逐渐扩大(Catindig et al.,2009)。据统计2005至2007年间，我国每年均有超过2500万公顷水稻田爆发褐飞虱灾害(Qiu et al.,2012)。褐飞虱每年大约造成10到15亿公斤的水稻产量减少，相当于数十亿元的经济损失。目前一般使用杀虫剂来控制褐飞虱，但是随着杀虫剂的大量使用，已经引起褐飞虱产生了抗药性，比如灭必虱，卡巴呋喃，扑灭松，甚至合成的除虫菊酯(Nagata,1982；Lakshmi et al.,2010)。并且喷洒农药，不仅对人畜有害，还造成在严重的环境污染。因此，积极开展褐飞虱生物防治技术的研究及应用，对我国及全世界发生的褐飞虱的危害实施科学有效控制，以及保障我国粮食安全和环境安全具有重要意义。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指双链RNA介导的诱发同源mRNA高效特异性降解的现象。从发现以来，迅速发展，成为基因功能研究的一个有效工具，目前也在昆虫基因研究中广泛应用。使用显微注射仪将体外合成的dsRNA注射到昆虫的血淋巴中或者特定的部位的方法称为显微注射法。显微注射法是目前应用最普遍的导入方法之一(Ober and Jockusch,2006)。显微注射法有以下优点，注射量可精确控制，可特定的观察特定基因表达量降低后对单头褐飞虱的影响，在对基因功能的理论研究有着很大的帮助。转基因植物法是指通过转基因技术让植物表达出含有目标物种的发卡环RNA(hairpin RNA)，昆虫取食植物的同时摄入dsRNA或降解产生的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)，从而在昆虫体内达到RNAi效果。目前，应用此方法已经有关于棉铃虫和玉米甲虫(Baum et a1.,2007)等有害生物成功的报道。在植物介导的RNAi之中，由于有害生物的基因是被有目的的选择插入到植物之中的，根据碱基配对原则，这种dsRNA的靶标具有特异性，对非靶标基因或生物是安全的。因此，挖掘和鉴定新型褐飞虱有功能的特异基因及其dsRNA，利用转基因技术培育抗褐飞虱新品种，对于保障我国粮食安全和环境安全具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种从褐飞虱中克隆的NlMLP基因的cDNA序列以及蛋白质序列。通过显微注射法和植物介导的RNAi沉默褐飞虱NlMLP基因，导致褐飞虱存活率降低。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明提供一种褐飞虱NlMLP基因，所述NlMLP基因的cDNA的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种褐飞虱NlMLP基因编码的蛋白，所述编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明还设计一种褐飞虱基因的dsRNA，具体为由SEQ ID NO.1所示序列的能达到抑制NlMLP基因表达效果的核苷酸和其反向互补序列的核苷酸组成的双链RNA。

优选地，所述的褐飞虱NlMLP基因的dsRNA，含有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

本发明还提供含有上述RNA分子或DNA分子的重组表达载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒。

本发明还保护上述RNA分子或DNA分子在制备产品中的应用，所述产品的用途如下(1)-(3)任一项中的应用：

1)防治褐飞虱或制备防治褐飞虱的产品；

2)降低褐飞虱存活率或制备降低褐飞虱存活率的产品；

3)抑制褐飞虱基因NlMLP基因表达或制备抑制褐飞虱NlMLP基因表达的产品。

进一步地，本发明所述应用为将dsRNA导入褐飞虱，从而实现防治褐飞虱，降低褐飞虱存活率或抑制褐飞虱NlMLP基因的表达。

优选的，所述导入的方式为显微注射，将dsRNA注射入褐飞虱体内，然后使褐飞虱取食。

优选的，所述导入的方式为在植物体内表达RNAi载体，然后使褐飞虱取食。

本发明提供一种抑制褐飞虱生长及存活的植物的方法，包括：

1)用多核苷酸转化植物细胞；所述多核苷酸含有褐飞虱NlMLP基因的RNAi载体；

2)将被转化的植物细胞再生为植物；

3)培养再生的植物并使上述多核苷酸得到复制。

其中所述植物是水稻。

根据NlMLP基因的ORF序列，选择了约500bp的片段进行RNAi载体的构建。通过重叠PCR的方法构建出中间为内含子两边为互补的500bp序列的片段，将该片段加A后连入经XcmI酶切的PCXUN载体内。测序验证无误后，所得载体即为NlMLP基因的RNAi载体，将其电转入农杆菌EHA105中。采用农杆菌介导的遗传转化方法，将载体导入正常籼稻品种Kasalath中，最后获得阳性植株30株。用T2代纯合的阳性植株进行了褐飞虱取食表型鉴定，结果表明，褐飞虱取食后虫重和存活率都降低。

上述制备NlMLP基因RNAi载体的内含子为PDK，扩增引物是：

PdkP3F：CTCGAGGAATTCGGTACCCC

PdkP4R：TTCGAACCCAATTTCCCAACTG

扩增PDK内含子两端序列的引物是：

PdkP3F：CTCGAGGAATTCGGTACCCC

PdkP4R：TTCGAACCCAATTTCCCAACTG

R1F：CTACAGCAGTGTCTTCAGCCAG

P3RR2R：

GGGGTACCGAATTCCTCGAGAGCCGATGTATTTCCTGTAGATP4FR2R：

CAGTTGGGAAATTGGGTTCGAAAGCCGATGTATTTCCTGTAGAT。

本发明具有的积极有益的技术效果：

1、本发明是国内外首次公开褐飞虱NlMLP基因核苷酸序列。目前关于其抑制表达并可显著影响褐飞虱生长发育的功能未见相关报道。

2、实验证明，本发明得到了褐飞虱NlMLP基因的cDNA序列，采用显微注射dsRNA的RNAi技术，沉默褐飞虱NlMLP基因，导致褐飞虱产生致死效应，随着时间的延长，存活率越来越低；显然该基因的dsRNA及其对应的表达盒、重组载体或重组菌等产品在褐飞虱防治领域有着重要的应用价值。

3、构建了一种针对褐飞虱NlMLP基因的RNAi载体，实验证明，将该载体转入褐飞虱寄主水稻植株中，褐飞虱取食转基因植株后，NlMLP表达量降低，褐飞虱的存活率减低，说明NlMLP的RNAi载体对抑制褐飞虱存活有着重要作用。本发明对培育抗虫植株具有重要意义，有着很好的应用前景，对降低农药使用，维持生态平衡及可持续发展有着重大的应用价值。

附图说明

图1为NlMLP基因的克隆。

图2为dsMLP和dsGFP的琼脂糖凝胶电泳图。

图3为显微注射后NlMLP基因相对表达量分析。

褐飞虱注射后，每天取样，实时定量PCR分析褐飞虱体内NlMLP基因的表达量。以褐飞虱actin基因为内参。CK为未注射的褐飞虱，dsGFP为注射dsGFP的褐飞虱，D1-D6为注射dsMLP不同天数的褐飞虱。**表示P<0.01，达极显著差异。

图4为显微注射后褐飞虱存活率和虫增重分析。

A：显微注射后将褐飞虱放在水稻上，每天统计褐飞虱的存活率。

B：注射后的褐飞虱，待其羽化为成虫，称取雌虫在三天内的虫增重。

图5为NlMLP RNAi载体构建示意图。

图6为褐飞虱取食野生型WT和NlMLP RNAi植株表型分析。

A：野生型WT和NlMLP RNAi植株中RNAi片段表达量分析。

B：褐飞虱长期取食转基因植株亲本WT以及NlMLP RNAi转基因植株SG33-2后，褐飞虱体内NlMLP表达量分析。二龄褐飞虱在不同的水稻上取食，奇数天取样，实时定量PCR分析褐飞虱体内NlMLP基因的表达量，actin为内参。

C：褐飞虱长期取食转基因植株亲本WT以及NlMLP RNAi转基因植株SG33-2后，褐飞虱存活率分析。

D：褐飞虱长期取食转基因植株亲本WT以及NlMLP RNAi转基因植株SG33-2后，十天后的褐飞虱虫重分析。

具体实施方式

以下的实施例进一步说明本发明的内容，但不应该理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可市购。

下述实例中所用褐飞虱，饲养于武汉大学遗传研究所，在水稻品种TN1上生长。饲养温度26±2℃。

【实施例1】褐飞虱NlMLP基因的克隆

取20头生物型1褐飞虱，提取总RNA，并反转为cDNA。通过该序列设计引物，使用TaKaRa公司5’与3’FμLl RACE试剂盒，获得了该候选基因5’末端及3’末端序列，确定了候选基因的转录起始位点及终止位点，并拼接出该基因的全长cDNA序列。根据全长cDNA序列重新合成引物MLP-F，MLP-R，扩增获得NlMLP的全长cDNA，预测ORF，其ORF序列如序列表SEQ ID NO.1所示(图1)。

MLP-F：ATGAGGTGTTTCTCAGTTATCGC

MLP-R：TCAGTAGTATCCACCAAAACCA

【实施例2】用于沉默褐飞虱NlMLP基因的dsRNA(dsMLP)以及用于对照的绿色荧光蛋白GFP基因dsGFP的制备

1.以实施例1得到的cDNA为模板，用MU-F，MU-R为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

MU-F(正向引物):

TAATACGACTCACTATAGGGAGAAGCCGATGTATTTCCTGTAGAT

MU-R(反向引物)：

TAATACGACTCACTATAGGGAGACTACAGCAGTGTCTTCAGCCAG

下划线标注的区域为T7RNA聚合酶启动子序列。

2.以实验室已有的含GFP的质粒为模板，用dsGFP-F，dsGFP-R为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

dsGFP-F(正向引物)：TAATACGACTCACTATAGGGCGGACT

dsGFP-R(反向引物)：TAATACGACTCACTATAGGGCGATGC

下划线标注的区域为T7RNA聚合酶启动子序列。

3.将扩增产物，回收，加A，连pMD18-T(TAKARA)载体，阳性克隆送测序。得到正确的克隆，以该克隆质粒为模板，同样用上述引物扩增，扩增产物纯化，浓缩，使其浓度为1μg/μL，该产物为dsRNA合成的模板。

4.按以下比例加入Transcription buffer 10μL，ATP，CTP，GTP，UTP(100mM)各1μL，RNA酶抑制剂1.25μL，T7RNA Polymerase 1μL，模板1.5μg，DEPC H₂O定容至49μL。轻弹混匀，瞬时离心。放入PCR中，程序为37℃，4h；75℃，5min；16℃保存。吸出1μL，凝胶电泳检测，检测到目的条带后继续下一步操作。

5.10×Reaction buffer 6μL，DNaseⅠ2μL，RNase 0.5μL，DEPC H2O 1.5μL，充分混匀，瞬时离心，放入PCR仪中37℃，30min。之后取出加入EDTA(Fementas)1μL，继续放回PCR仪中65℃，5min终止反应。吸出1μL，稀释10倍，2μL凝胶电泳检测，2μL用NANOdrop紫外分光光度计检测浓度。如果检测条带是很单一明亮的条带，如图1所示，且OD260/280在1.8-2.0之间，则说明dsRNA质量良好，可以进行下一步：RNA酚氯仿抽提。

6.常规酚氯仿抽提，去除蛋白质，根据浓度将dsRNA调到5μg/μL，每管10μL分装好，放入-80℃保存。

【实施例3】dsMLP和dsRNA的显微注射及效果检测

1.褐飞虱准备：取30头雌虫，10头雄虫于有TN1苗子的杯子中，24h后，取出成虫。待孵化，20d后为四龄若虫，注射使用。

2.平板准备：称取1.5g的琼脂粉加入到100ml水中，煮沸，倒入玻璃平皿中，待其凝固备用。

3.注射：取长势相似的虫子5-8头于试管中，通入CO₂麻醉20s，通入CO2时不要对着虫子吹，避免虫子乱飞造成碰撞损伤。再将虫子倒于1.5％的琼脂粉平板上，腹部朝上。用Nanoliter 2010显微注射仪依照说明书进行注射。注射位置在前中胸之间。注射量为46nl(5μg/μL)。

4.褐飞虱注射dsRNA后，从注射后第一天开始取样，每天取样三头，取样六天，同时取没有注射的以及注射dsGFP的褐飞虱作为对照，用RT-PCR验证基因表达量变化。

具体操作如下：取样后，提RNA(参照2.1.2)，用TAKARA的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(货号RR047A)按照说明书进行反转，得反转产物。将反转得到的cDNA取5μL，用TE稀释10倍，按以下操作进行实时定量PCR。PCR反应在CFX96TouchTM Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad)仪器上进行，遵循以下反应体系：DNase/RNase-Free ddH₂O 2.9μL，2×Supermix 4μL，Primers(5mM)0.6μL，cDNA模板0.5μL。反应条件：95℃预变性2min，95℃变性5-10s，TM(55-65℃)退火延伸30s，重复后两步骤40个循环，最后65℃-95℃，每步增加0.5℃，5s做溶解曲线以确定扩增产物的特异性。

首先对不同引物做55-65℃梯度PCR确定最适退火延伸温度(起峰早，溶解曲线特异)，取PCR产物稀释10⁶后作为第一个梯度，然后再10倍稀释3个梯度，通常以这四个模板作标准曲线来筛选扩增效率高的引物作为基因的定量引物。每一个样品做3个技术重复，每一板PCR都做扩增效率。结果采用Bio-Rad CFX Manager来分析，首先分析其溶解曲线，QC(质控)等，去除不合格数据，基因表达分析用软件自带Gene Study功能为(1+E)^-ΔΔCt算法分析。

内参基因actin引物：

Actin-F：GACAGGATGCAGAAGGAAATCA

Actin-R：GACTCGTCGTACTCCTGCTTTG

NlMLP定量引物：

QMU-F：GTCAGGAACTTTGCCAGACGC

QMU-R：CGGGAAGCAGCACTCCACAT

5.结果附图3所示，显微注射dsMLP的实验组，与未注射的褐飞虱以及注射dsGFP的对照组相比，从注射第一天起，褐飞虱体内NlMLP基因的相对表达量显著降低，达10％以下，与对照相比有极显著差异(P<0.01)。结果表明，通过显微注射dsMLP能够引起褐飞虱体内唾液腺分泌NlMLP基因的RNAi效应，导致基因表达量明显降低。

【实施例4】显微注射后褐飞虱表型检测

褐飞虱存活率实验：褐飞虱分三组，未注射，注射dsGFP，注射dsMLP，注射后待其复苏，放回水稻上。每次做十头虫，重复5次。结果如图4A所示，注射dsMLP后褐飞虱的存活率一直低于注射dsGFP和未注射的褐飞虱。并且在第十天的时候，注射dsMLP的褐飞虱几乎完全死去，注射dsGFP和未注射的褐飞虱至少还有40％的存活。

褐飞虱虫增重实验：褐飞虱注射后放回水稻上，待其羽化，将第一天羽化的褐飞虱，单头称重，然后放入绑在水稻苗子上的蜡袋中，三天后，取下存活的褐飞虱，再次称重，两次重量之差，记为虫增重。每次做十头虫，重复5次。如图4B所示，对刚羽化褐飞虱在72h内的虫增重进行分析，发现注射dsMLP以后，虫增重显著降低，而注射dsGFP和未注射的基本没有差异。结果表明，注射dsMLP后，由于该基因的表达量降低，导致褐飞虱取食受到影响，进而影响褐飞虱的存活率。

【实施例5】褐飞虱NlMLP基因RNAi载体的构建

1.片段扩增：用高保真酶KOD Plus Neo(TOYOBO)，及引物PdkP3F和PdkP4R，模板为含有PDK内含子的pKANNIBAL质粒，扩增PDK内含子814bp。继续用高保真酶KOD Plus Neo，引物对R1F/P3RR2R,R1F/P4FR2R分别扩增含有NlMLP的质粒，得到与PDK内含子两端序列分别相同的两个片段，片段1和2，大小为500bp左右。

PdkP3F：CTCGAGGAATTCGGTACCCC

PdkP4R：TTCGAACCCAATTTCCCAACTG

R1F：CTACAGCAGTGTCTTCAGCCAG

P3RR2R：GGGGTACCGAATTCCTCGAGAGCCGATGTATTTCCTGTAGAT

P4FR2R：CAGTTGGGAAATTGGGTTCGAAAGCCGATGTATTTCCTGTAGAT

2.片段重叠：

第一轮反应：依次向200μL离心管中加入以下试剂：10×buffer 5μL，25mM MgSO4 3μL，2mM dNTPs 5μL，片段1(50ng)1μL，片段2(50ng)

1μL，片段3(50ng PDK intron)1μL，ddH₂0 34μL；PCR程序为94℃，2min；98℃10s，50℃60s，68℃45s，10个循环。

第二轮反应：上述Mix 50μL，10×buffer 5μL，25mM MgSO₄ 3μL，2mM dNTPs 5μL，引物R1F(10μM)3μL，KOD Plus Neo 2μL，ddH₂0 29μL；PCR程序为94℃，2min；98℃10s，55℃30s，68℃1min，18个循环。

3.反应完成后，取2μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。切胶回收目的大小的片段，大约为1.8kb，由于KOD PLUS NEU扩增片段末端没有A尾巴，故需加A后连接载体。

4.PCXUN载体用Xcm I酶切回收，可形成T末端，与上述加A产物16℃连接过夜。转化，挑单克隆，Bam HI酶切验证插入片段大小，大小为2kb左右的片段送公司测序，如图5。

5.将测序正确的载体质粒通过常规电转方法转入农杆菌菌株EHA105。

【实施例6】NlMLP抑制后的功能验证

1.农杆菌介导的NlMLP RNAi转基因植株获得

采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Hiei等，1994，Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant Journal 6:271-282)将上述NlMLP RNAi载体导入褐飞虱感性的普通水稻品种Kasalath。

2.褐飞虱取食NlMLP RNAi转基因植株后表型验证

NlMLP RNAi转化载体获得阳性转基因植株30株。收获种子后，用T2代纯合植株(SG33-2)进行表型鉴定，首先对转基因植株中RNAi载体区段的表达进行定量PCR检测，引物为Q1-F，Q1-R，内参为水稻actin，引物为Osactin-F，Osactin-R。结果如图6A所示，NlMLP RNAi片段在植物体大量积累。

RNAi-F：AGGGCTACGACTATTCAA

RNAi-R：AGGGTGCTGCTCATCT

Osactin-F：GATCACTGCCTTGGCTCCTA

Osactin-R：GTACTCAGCCTTGGCAATCC

将生物型1的二龄褐飞虱放在WT(kasa)和SG33-2上，长期取食。奇数天取样，每天5头，提RNA，反转，做定量。结果如图6B所示，当褐飞虱持续取食转基因植株时，取食SG33-2的褐飞虱自身体内的NlMLP表达量比取食野生型WT的褐飞虱的表达量要低。

生物型I的二龄褐飞虱20头分别取食WT(kasa)和SG33-2，按天数虫子的存活率，重复五次。结果如图6C所示，由于NlMLP表达量的降低，影响了褐飞虱的取食，使其在第7天到第10天的存活率显著降低。

生物型I的二龄褐飞虱长期饲养于WT(kasa)和SG33-2上，十天后，称其虫重，每次10头。三次重复。结果如图6D所示，褐飞虱长期取食转基因植株，褐飞虱的虫重也降低。这些都说明NlMLP对褐飞虱的生存有非常重要的作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉大学

<120> 褐飞虱NlMLP基因、编码蛋白及其应用

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2187

<212> DNA

<213> 褐飞虱NlMLP基因

<400> 1

atgaggtgtt tctcagttat cgcactcctt gctgcatgca tttctgctgc aacatgcatg 60

agctatggaa gttatggtgg cgccgctgca gcctatgaag ctacagctgg agctgcccag 120

cagtatggca tggaacagtc ccagtcccaa tacagcgcaa gtcagcagga atcatcatca 180

tcatccagct atgaatctac agaatacgat tatgctgcag gtgccaccag tggttatgtt 240

ggtcaatctg ctcaagctgc aggagctgct tatggtgctg ccactggcgc tggttatggt 300

gtcgctggcg ctggttatgg tgctgctgaa gctgcttatg gtgccgctta tggcagttcg 360

gcttatggag ctagtatggc cagtggagcc tcaaactacg ctgccgcatc ctcctccaaa 420

ttcagctccg cttcgtcaat ggctgcctct tcagcttcat ctagcgccgc catgtcagcc 480

tctgcctctt cctatcaggc cagcctcgac tactacccaa aactcagaac tattcctttc 540

ttcaacaacg tcttccaggc catgtcttgt gatgacatct catcttacag cagcctctgg 600

accagcaact tcaacgttca aagcaccttg accagcatgt tccaaagcaa ctccctgttt 660

aagagctact tgagttgtgc caccggtatg agcttctcaa gcttccaagg tgccgaattc 720

tctagagttt gctctgcctt ctcatcgaac aagggtgctt ttgtcggact cgtcaggaac 780

tttgccagac gcggttacat ctacaaatcc agcttcgcta cctctctttt gtcctacaca 840

caatccacag agatgtggag tgctgcttcc cgtttctctt cattctccaa catgcagact 900

tggtcacagt gtggaatcaa cgctttcttc cagcacaagg cttacaggag ttatatcatg 960

aatttctgtg gtgttcaatc ctgggacgaa actgctattt caagaaccct ttccggatac 1020

ttcagatcta acccagtcgc aacctcattg ttcttcagac atcttctcct caacagggtg 1080

agctcatcat gctcgttcca gcagtacgcc gctttgaacc aacagtcgta catggctacc 1140

agaagctcca gctttgccta ctacggaggt ttctacaatg ccttccaaca atcatcatcg 1200

tcatcgtcat acgccagaac acaaagcatg tcatcttctt catcatcatc aatgagctct 1260

tcctcctcat cttactctgc ctcaaggtca taccaatcag tccagcagta ctacagctcc 1320

accctctacc agagcagcct cttccgtgga tgcttcgaac ttcaatccgt tgacacctcc 1380

aaacaagccg gtttctacag cagtgtcttc agccagggct acgactattc aagcaacttc 1440

ggaacctgct tccaagatgc ctactaccgt aaatacttgt tggcatgcac tggatattac 1500

ggcgaataca acgctcagat gagcagcacc ctcttctctt acgcccagca gcatccagga 1560

ttcttcgcca ggagtaccag gctttatgct agaaacggtg ctttcttctc atcacaaatt 1620

ggaaaaatgt tcgtggacca gaattccaac tttttcttct cacagcaggt ccaacagtac 1680

cgttcgcaat tcttgagcgt ccaagcttgg aattcatttg gactggccaa tctcttccaa 1740

tgtcgttact accaacgtaa aatctgcagc ttcttcggat tctcttccta caactaccat 1800

caagtgtcca atgcgtttat ctcactcttc aataccaact tctctggagg tcttcttgct 1860

ttgagacatt tgatctacag gaaatacatc ggctcttcct tcaacgtcca ggcctaccgc 1920

agtctaagaa gctacagtta tgccagctct ctggcctaca gctgtccatt ctactcgcag 1980

tggtctagct actgcagttc cttctcacag agatcgcagt tcagtcgctc agctgcctcc 2040

agtcgctcgg cttacatgca gcagcagcag tcagcttcta gctcaagcac cagctcctac 2100

caggctggtg cccagtcggc agctgctgga tacgctgctc agtcgggata cgctggtgga 2160

gcctctggtt ttggtggata ctactga 2187

<210> 2

<211> 728

<212> PRT

<213> 褐飞虱NlMLP基因编码的蛋白

<400> 2

Met Arg Cys Phe Ser Val Ile Ala Leu Leu Ala Ala Cys Ile Ser Ala

1 5 10 15

Ala Thr Cys Met Ser Tyr Gly Ser Tyr Gly Gly Ala Ala Ala Ala Tyr

20 25 30

Glu Ala Thr Ala Gly Ala Ala Gln Gln Tyr Gly Met Glu Gln Ser Gln

35 40 45

Ser Gln Tyr Ser Ala Ser Gln Gln Glu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Tyr

50 55 60

Glu Ser Thr Glu Tyr Asp Tyr Ala Ala Gly Ala Thr Ser Gly Tyr Val

65 70 75 80

Gly Gln Ser Ala Gln Ala Ala Gly Ala Ala Tyr Gly Ala Ala Thr Gly

85 90 95

Ala Gly Tyr Gly Val Ala Gly Ala Gly Tyr Gly Ala Ala Glu Ala Ala

100 105 110

Tyr Gly Ala Ala Tyr Gly Ser Ser Ala Tyr Gly Ala Ser Met Ala Ser

115 120 125

Gly Ala Ser Asn Tyr Ala Ala Ala Ser Ser Ser Lys Phe Ser Ser Ala

130 135 140

Ser Ser Met Ala Ala Ser Ser Ala Ser Ser Ser Ala Ala Met Ser Ala

145 150 155 160

Ser Ala Ser Ser Tyr Gln Ala Ser Leu Asp Tyr Tyr Pro Lys Leu Arg

165 170 175

Thr Ile Pro Phe Phe Asn Asn Val Phe Gln Ala Met Ser Cys Asp Asp

180 185 190

Ile Ser Ser Tyr Ser Ser Leu Trp Thr Ser Asn Phe Asn Val Gln Ser

195 200 205

Thr Leu Thr Ser Met Phe Gln Ser Asn Ser Leu Phe Lys Ser Tyr Leu

210 215 220

Ser Cys Ala Thr Gly Met Ser Phe Ser Ser Phe Gln Gly Ala Glu Phe

225 230 235 240

Ser Arg Val Cys Ser Ala Phe Ser Ser Asn Lys Gly Ala Phe Val Gly

245 250 255

Leu Val Arg Asn Phe Ala Arg Arg Gly Tyr Ile Tyr Lys Ser Ser Phe

260 265 270

Ala Thr Ser Leu Leu Ser Tyr Thr Gln Ser Thr Glu Met Trp Ser Ala

275 280 285

Ala Ser Arg Phe Ser Ser Phe Ser Asn Met Gln Thr Trp Ser Gln Cys

290 295 300

Gly Ile Asn Ala Phe Phe Gln His Lys Ala Tyr Arg Ser Tyr Ile Met

305 310 315 320

Asn Phe Cys Gly Val Gln Ser Trp Asp Glu Thr Ala Ile Ser Arg Thr

325 330 335

Leu Ser Gly Tyr Phe Arg Ser Asn Pro Val Ala Thr Ser Leu Phe Phe

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Arg His Leu Leu Leu Asn Arg Val Ser Ser Ser Cys Ser Phe Gln Gln

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Tyr Ala Ala Leu Asn Gln Gln Ser Tyr Met Ala Thr Arg Ser Ser Ser

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Phe Ala Tyr Tyr Gly Gly Phe Tyr Asn Ala Phe Gln Gln Ser Ser Ser

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Ser Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Gln Ser Met Ser Ser Ser Ser Ser Ser

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Ser Met Ser Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ser Ala Ser Arg Ser Tyr Gln

420 425 430

Ser Val Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Thr Leu Tyr Gln Ser Ser Leu Phe

435 440 445

Arg Gly Cys Phe Glu Leu Gln Ser Val Asp Thr Ser Lys Gln Ala Gly

450 455 460

Phe Tyr Ser Ser Val Phe Ser Gln Gly Tyr Asp Tyr Ser Ser Asn Phe

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Gly Thr Cys Phe Gln Asp Ala Tyr Tyr Arg Lys Tyr Leu Leu Ala Cys

485 490 495

Thr Gly Tyr Tyr Gly Glu Tyr Asn Ala Gln Met Ser Ser Thr Leu Phe

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Ser Tyr Ala Gln Gln His Pro Gly Phe Phe Ala Arg Ser Thr Arg Leu

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Tyr Ala Arg Asn Gly Ala Phe Phe Ser Ser Gln Ile Gly Lys Met Phe

530 535 540

Val Asp Gln Asn Ser Asn Phe Phe Phe Ser Gln Gln Val Gln Gln Tyr

545 550 555 560

Arg Ser Gln Phe Leu Ser Val Gln Ala Trp Asn Ser Phe Gly Leu Ala

565 570 575

Asn Leu Phe Gln Cys Arg Tyr Tyr Gln Arg Lys Ile Cys Ser Phe Phe

580 585 590

Gly Phe Ser Ser Tyr Asn Tyr His Gln Val Ser Asn Ala Phe Ile Ser

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Leu Phe Asn Thr Asn Phe Ser Gly Gly Leu Leu Ala Leu Arg His Leu

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Ile Tyr Arg Lys Tyr Ile Gly Ser Ser Phe Asn Val Gln Ala Tyr Arg

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Ser Leu Arg Ser Tyr Ser Tyr Ala Ser Ser Leu Ala Tyr Ser Cys Pro

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uauugaagag ugagauaaac gcauuggaca cuugauggua guuguaggaa gagaauccga 120

agaagcugca gauuuuacgu ugguaguaac gacauuggaa gagauuggcc aguccaaaug 180

aauuccaagc uuggacgcuc aagaauugcg aacgguacug uuggaccugc ugugagaaga 240

aaaaguugga auucuggucc acgaacauuu uuccaauuug ugaugagaag aaagcaccgu 300

uucuagcgua aagccuggua cuccuggcga agaauccugg augcugcugg gcguaagaga 360

agagggugcu gcucaucuga gcguuguauu cgccguaaua uccagugcau gccaacaagu 420

auuuacggua guaggcaucu uggaagcagg uuccgaaguu gcuugaauag ucguagcccu 480

ggcugaagac acugcuguag 500

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<212> DNA

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gtactcagcc ttggcaatcc 20