本发明涉及生物技术中蛋白肽制备领域，具体涉及一种无钠胶原蛋白肽的制备方法。
背景技术：
胶原蛋白是一种细胞外基质，属于结构蛋白质，广泛存在于动物的皮肤、骨、牙齿、肌腱韧带和血管中，是动物体内含量最丰富、分布最广的蛋白质，占体内蛋白总量的25%-30%，起着支撑器官，保护机体的功能。除此之外，胶原蛋白还对细胞增生、分化、运动、免疫、关节润滑、伤口愈合有着积极的作用，已广泛应用于化妆品、保健品、生物材料、临床等领域，产品众多，如市面上常见的胶原蛋白口服液、固体饮料、胶囊、泡腾片等。
人类对食盐的生理需要量是很低的，成人每日摄入2g氯化钠（相当于每天摄入0.8 g钠）就足以满足一般人体的生理需要。根据最新的《全国居民营养与健康状况的调查》结果显示：我国居民每人食盐的摄入量为12 g/d，是世界卫生组织标准的2倍多。高盐饮食是高血压发病最重要的危险因素，对身体代谢或通路等负面影响是多方面的，如抑制平滑肌细胞膜钠泵；增加可激活交感神经的活性，并不同程度地损害肾脏排钠功能；钠盐的摄入量的增加可提高血管对各种升压物质的敏感性等等。不仅如此，摄入食盐过多还可能与胃炎、胃癌以及某些呼吸道疾病的发病有关。减少食盐摄入，减少钠摄入，减少高盐或高钠食品的摄入量具有重要的健康意义，所以2008年我国出台的《食品营养标签管理办法》特别规定，钠是应在食品营养标签中注明的四种“核心营养素”之一。
目前生产胶原蛋白的原料，如动物的皮、骨、鳞均含有钠盐，且在胶原蛋白的生产过程中如原料脱脂、pH调节、商品酶制剂添加等步骤也会带入大量钠盐，其终端产品因风味调整、营养强化等目的进一步带入钠盐，从而使产品保持有较高的钠含量。根据热销胶原蛋白产品营养标签数据分析，钠含量分布在330～4500ppm，且钠含量在1200ppm以上产品居多。
中国专利CN103540635A公开了一种鱼鳞胶原蛋白的制备工艺，经过预处理、脱钙、中和去杂质、水洗、溶胶、固液分离过滤、水解、胶原蛋白过滤分离、大分子蛋白过滤分离、脱盐、脱水、干燥等步骤制得胶原蛋白粉。中国专利CN201310559993.1公开了一种水产胶原蛋白的提取方法，包括原料处理、酶解处理和纯化处理步骤，该方法制备的胶原蛋白产品分子量低，溶解性好，克服了传统水产胶原蛋白有异味、腥味、纯度低、色泽差等技术问题。中国专利 CN103243144A公开了一种富含胶原三肽的胶原蛋白粉的制备方法，以鱼皮为原料，先采用复合蛋白酶对鱼皮胶原蛋白进行提取并降解成小分子肽，再利用自主筛选的胶原蛋白酶对小分子肽进一步定向降解成胶原三肽，然后经离心、脱腥脱色、浓缩、喷雾干燥获得富含胶原三肽的胶原蛋白粉。中国专利CN102703555A公开了一种小分子鱼皮胶原蛋白肽的提取制备方法，工艺步骤包括以淡水鱼的鱼皮为原料，除去非胶原蛋白，经过脱脂、脱腥、磨碎等步骤，在酸性条件下对胶原蛋白加热水解处理，然后采用酶解法控制胶原蛋白的降解程度，采用膜分离法获得目标小分子胶原蛋白肽并对蛋白酶回收再利用，接着通过纳滤脱盐，活性炭结合树脂脱色脱腥后，利用喷雾干燥获得无色无味的小分子鱼皮胶原蛋白肽粉。以上方法分别涉及到用离子交换树脂和纳滤脱盐，但未对脱盐效果作特别界定。常规的纳滤脱盐只能脱除一定比例的盐分，脱盐不彻底；离子交换树脂会吸附胶原蛋白中的两性分子导致得率下降，使其应用受限。
技术实现要素：
本发明的发明目的在于针对现有技术存在的不足提供了一种制备无钠胶原蛋白的制备方法。该方法通过原料预处理、反应过程及后处理三段控制，制得的胶原蛋白钠含量低于50ppm，低于GB 28050-2011《低钠食品》中钠含量“0”界限值。产品原料利用率高，工艺简单，加工成本低，有益健康。且因内源酶系中脂肪酶对原料中脂肪的分解作用和内源酶无糖等辅料不会发生美拉德反应的特点，产品色泽白、无腥味、保质期长。
本发明的目的是通过如下技术方案得以实现的：
提供一种无钠胶原蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将新鲜鱼内脏破碎后清洗去除表面脂肪及内容物，匀浆，得到匀浆液待用，整个过程需在4℃以下进行；
（2）将鱼鳞、鱼皮粉碎后用纯净水漂洗数次，充分去除其中的钠离子；
（3）将漂洗干净的鱼鳞、鱼皮于反应罐中加热预处理后冷却至50-60℃，用氢氧化钙调节pH至8-9，加入步骤（1）所制备的匀浆液反应3-6h；
（4）反应液经灭酶、离心脱脂、脱色过滤后用纳滤浓缩，浓缩液加入纯净水洗滤数次，充分去除其中的钠离子，浓缩液干燥后得无钠胶原蛋白肽成品。
进一步地，所述的新鲜鱼内脏为活鱼剖杀后0.5h以内的鱼内脏，具体步骤为：将新鲜鱼内脏迅速于0～4℃冰水中破碎、清洗去除表面脂肪及内容物后，匀浆，得到匀浆液，储存待用。
进一步地，步骤（1）中鱼内脏的匀浆液需在2h内使用，且浆液温度不得高于4℃。
进一步地，步骤（2）中鱼鳞、鱼皮粉碎后，单次漂洗所用纯净水的量是原料质量2～4倍，缓慢搅拌漂洗30～60min，漂洗结束后静置倾去上清，重复漂洗次数为4～6次，并以漂洗液钠离子含量在10ppm以下为漂洗终点。
进一步地，步骤（3）中的加热预处理为120-130℃处理10-20min。
进一步地，步骤（3）中所加内脏匀浆液的质量为鱼鳞、鱼皮质量的5～10%，反应温度维持在50～60℃，反应液钠离子含量在600ppm以内，远低于商品酶水解液钠离子含量水平（约1000ppm）。
进一步地，步骤（4）中当纳滤浓缩液固形物含量至30～35%时，加入浓缩液1倍质量的纯净水开始洗滤，当所加入的纯净水全部滤出时继续加入浓缩液1倍质量的纯净水开始洗滤，重复此过程5～8次至浓缩液钠离子含量在15ppm以下。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：
本发明通过漂洗去除原料含有的钠盐，并利用新鲜鱼内脏作酶源，既避免了使用商品酶制剂引入外源钠离子，又降低了生产成本；酶解反应后配合纳滤脱盐浓缩的基础上进行洗滤，脱盐更彻底，且能保持较高的回收率，由此最终获得了无钠胶原蛋白，制得的胶原蛋白钠含量低于50ppm，低于GB 28050-2011食品安全国家标准预包装食品营养标签通则中钠含量“0”界限值。因内源酶系中脂肪酶对原料中脂肪的分解作用和内源酶无糖等辅料不会发生美拉德反应的特点，产品色泽白、无腥味、保质期长。
具体实施方式
下面申请人将结合具体的实施例对本发明方法做进一步的阐述，应理解，以下实施例仅用于详细说明本发明的技术方案，而不应在任何程度上被理解为对本发明请求保护范围的限制。
实施例1
一种制备无钠胶原蛋白的方法，其步骤如下：
（1）称取1000Kg的新鲜鱼皮，粉碎，加入2000Kg纯净水，缓慢搅拌60min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为1207ppm。向沉淀中加入2500kg纯净水，缓慢搅拌50min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为310ppm。向沉淀中加入3500kg纯净水，缓慢搅拌35min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为75ppm。向沉淀中加入3000kg纯净水，缓慢搅拌30min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为19ppm。向沉淀中加入4000kg纯净水，缓慢搅拌55min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为5ppm，漂洗过程结束。
（2）取刚剖杀的新鲜鱼内脏破碎后用冰水降温并冲洗去除表面及内部杂质，匀浆，匀浆液暂存于冷库待用，匀浆过程及匀浆液温度保持在0-4℃；
（3）将漂洗好的鱼皮投入反应罐中，加入1500Kg纯净水，升温至121℃维持10min后降温至58℃，氢氧化钙调节反应液pH至8.5，加入内脏匀浆液55Kg，保温反应5h，反应结束时反应液钠离子含量为320ppm；
（4）反应结束后反应液灭酶、经碟式离心机分离去除脂肪及不溶物，离心机转速6500rpm、重相出口压力1.5bar，脱脂去杂后的反应液加入活性炭脱色，脱色液过滤后进入纳滤脱盐浓缩，当浓缩液固形物含量至30%时，加入浓缩液1倍质量纯净水约550Kg进行洗滤，当洗滤滤液量达到550Kg时开始第二次洗滤，一次洗滤结束时浓缩液钠离子含量为193ppm。重复洗滤步骤，二次、三次、四次、五次和六次洗滤结束时浓缩液钠离子含量分别为117ppm、73ppm、45ppm、28ppm和13ppm，结束洗滤过程；
（5）纳滤浓缩液于进风温度195℃、出风温度93℃、雾化压力45bar条件下喷雾干燥得胶原蛋白肽粉185Kg。
经检测所得胶原蛋白肽水分4.8%、灰分0.1%、总氮16.7%、钠含量为45.1ppm、白度81.3%，无腥味。
实施例2
一种制备无钠胶原蛋白的方法，其步骤如下：
（2）称取1500Kg的新鲜鱼皮、鱼鳞混合物，粉碎，加入4000Kg纯净水，缓慢搅拌35min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为951ppm。向沉淀中加入5000kg纯净水，缓慢搅拌50min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为203ppm。向沉淀中加入6000kg纯净水，缓慢搅拌55min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为37ppm。向沉淀中加入4500kg纯净水，缓慢搅拌45min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为7ppm，漂洗过程结束。
（2）取刚剖杀的新鲜鱼内脏破碎后用冰水降温并冲洗去除表面及内部杂质，匀浆，匀浆液暂存于冷库待用，匀浆过程及匀浆液温度保持在0-4℃；
（3）将漂洗好的鱼皮投入反应罐中，加入2000Kg纯净水，升温至128℃维持15min后降温至50℃，氢氧化钙调节反应液pH至9.0，加入内脏匀浆液75Kg，保温反应6h，反应结束时反应液钠离子含量为430ppm；
（4）反应结束后反应液灭酶、经碟式离心机分离去除脂肪及不溶物，离心机转速6370rpm、重相出口压力1.5bar，脱脂去杂后的反应液加入活性炭脱色，脱色液过滤后进入纳滤脱盐浓缩，当浓缩液固形物含量至32%时，加入浓缩液1倍质量纯净水约900Kg进行洗滤，当洗滤滤液量达到900Kg时开始第二次洗滤，一次洗滤结束时浓缩液钠离子含量为280ppm。重复洗滤步骤，二次、三次、四次、五次洗滤结束时浓缩液钠离子含量分别为149ppm、70ppm、30ppm和12ppm，结束洗滤过程；
（5）纳滤浓缩液于进风温度198℃、出风温度91℃、雾化压力55bar条件下喷雾干燥得胶原蛋白肽粉283Kg。
经检测所得胶原蛋白肽水分4.4%、灰分0.2%、总氮16.9%、钠含量为39ppm、白度80.9%，无腥味。
实施例3
一种制备无钠胶原蛋白的方法，其步骤如下：
（1）称取2500Kg的新鲜鱼鳞，粉碎，加入10000Kg纯净水，缓慢搅拌60min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为763ppm。向沉淀中加入5000kg纯净水，缓慢搅拌50min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为237ppm。向沉淀中加入8500kg纯净水，缓慢搅拌50min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为51ppm。向沉淀中加入6000kg纯净水，缓慢搅拌30min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为27ppm。向沉淀中加入7500kg纯净水，缓慢搅拌30min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为12ppm。向沉淀中加入5500kg纯净水，缓慢搅拌55min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为8ppm，漂洗过程结束。
（2）取刚剖杀的新鲜鱼内脏破碎后用冰水降温并冲洗去除表面及内部杂质，匀浆，匀浆液暂存于冷库待用，匀浆过程及匀浆液温度保持在0-4℃；
（3）将漂洗好的鱼皮投入反应罐中，加入3500Kg纯净水，升温至121℃维持10min后降温至55℃，氢氧化钙调节反应液pH至8.0，加入内脏匀浆液250Kg，保温反应3.5h，反应结束时反应液钠离子含量为473ppm；
（4）反应结束后反应液灭酶、经碟式离心机分离去除脂肪及不溶物，离心机转速6350rpm、重相出口压力1.5bar，脱脂去杂后的反应液加入活性炭脱色，脱色液过滤后进入纳滤脱盐浓缩，当浓缩液固形物含量至35%时，加入浓缩液1倍质量纯净水约1600Kg进行洗滤，当洗滤滤液量达到1600Kg时开始第二次洗滤，一次洗滤结束时浓缩液钠离子含量为315ppm。重复洗滤步骤，二次、三次、四次、五次和六次洗滤结束时浓缩液钠离子含量分别为173ppm、85ppm、47ppm、28ppm、14ppm，结束洗滤过程；
（5）纳滤浓缩液于进风温度185℃、出风温度95℃、雾化压力40bar条件下喷雾干燥得胶原蛋白肽粉501Kg。
经检测所得胶原蛋白肽水分4.2%、灰分0.15%、总氮17.0%、钠含量为41ppm、白度81.7%，无腥味。
实施例4
一种制备无钠胶原蛋白的方法，其步骤如下：
（1）称取2000Kg的新鲜鱼皮，粉碎，加入7000Kg纯净水，缓慢搅拌60min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为890ppm。向沉淀中加入8000kg纯净水，缓慢搅拌50min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为134ppm。向沉淀中加入6500kg纯净水，缓慢搅拌45min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为25ppm。向沉淀中加入4500kg纯净水，缓慢搅拌30min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为7ppm，漂洗过程结束。
（2）取刚剖杀的新鲜鱼内脏破碎后用冰水降温并冲洗去除表面及内部杂质，匀浆，匀浆液暂存于冷库待用，匀浆过程及匀浆液温度保持在0-4℃；
（3）将漂洗好的鱼皮投入反应罐中，加入3000Kg纯净水，升温至121℃维持10min后降温至60℃，氢氧化钙调节反应液pH至8.6，加入内脏匀浆液155Kg，保温反应3h，反应结束时反应液钠离子含量为390ppm；
（4）反应结束后反应液灭酶、经碟式离心机分离去除脂肪及不溶物，离心机转速6480rpm、重相出口压力1.5bar，脱脂去杂后的反应液加入活性炭脱色，脱色液过滤后进入纳滤脱盐浓缩，当浓缩液固形物含量至33%时，加入浓缩液1倍质量纯净水约1000Kg进行洗滤，当洗滤滤液量达到1000Kg时开始第二次洗滤，一次洗滤结束时浓缩液钠离子含量为269ppm。重复洗滤步骤，二次、三次、四次、五次、六次和七次洗滤结束时浓缩液钠离子含量分别为171ppm、95ppm、53ppm、31ppm、17ppm和9ppm，结束洗滤过程；
（5）纳滤浓缩液于进风温度193℃、出风温度97℃、雾化压力43bar条件下喷雾干燥得胶原蛋白肽粉325Kg。
经检测所得胶原蛋白肽水分4.1%、灰分0.12%、总氮17.2%、钠含量为39ppm、白度82.1%，无腥味。
实施例5
一种制备无钠胶原蛋白的方法，其步骤如下：
（1）称取2500Kg的新鲜鱼鳞，粉碎，加入9000Kg纯净水，缓慢搅拌55min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为905ppm。向沉淀中加入8000kg纯净水，缓慢搅拌50min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为218ppm。向沉淀中加入7500kg纯净水，缓慢搅拌45min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为51ppm。向沉淀中加入6000kg纯净水，缓慢搅拌30min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为17ppm。向沉淀中加入5000kg纯净水，缓慢搅拌30min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为6ppm，漂洗过程结束。
（2）取刚剖杀的新鲜鱼内脏破碎后用冰水降温并冲洗去除表面及内部杂质，匀浆，匀浆液暂存于冷库待用，匀浆过程及匀浆液温度保持在0-4℃；
（3）将漂洗好的鱼皮投入反应罐中，加入3000Kg纯净水，升温至121℃维持10min后降温至,51℃，氢氧化钙调节反应液pH至8.3，加入内脏匀浆液175Kg，保温反应4.5h，反应结束时反应液钠离子含量为513ppm；
（4）反应结束后反应液灭酶、经碟式离心机分离去除脂肪及不溶物，离心机转速6530rpm、重相出口压力1.5bar，脱脂去杂后的反应液加入活性炭脱色，脱色液过滤后进入纳滤脱盐浓缩，当浓缩液固形物含量至34%时，加入浓缩液1倍质量纯净水约1400Kg进行洗滤，当洗滤滤液量达到1400Kg时开始第二次洗滤，一次洗滤结束时浓缩液钠离子含量为414ppm。重复洗滤步骤，二次、三次、四次、五次、六次、七次和八次洗滤结束时浓缩液钠离子含量分别为293ppm、163ppm、69ppm、41ppm、23ppm、16ppm和4ppm，结束洗滤过程；
（5）纳滤浓缩液于进风温度197℃、出风温度101℃、雾化压力42bar条件下喷雾干燥得胶原蛋白肽粉451Kg。
经检测所得胶原蛋白肽水分3.9%、灰分0.18%、总氮17.5%、钠含量为34ppm、白度81.5%，无腥味。
实施例6
一种制备无钠胶原蛋白的方法，其步骤如下：
（1）称取1500Kg的新鲜鱼鳞，粉碎，加入5500Kg纯净水，缓慢搅拌50min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为913ppm。向沉淀中加入6000kg纯净水，缓慢搅拌50min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为197ppm。向沉淀中加入5000kg纯净水，缓慢搅拌40min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为47ppm。向沉淀中加入6000kg纯净水，缓慢搅拌35min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为9ppm，漂洗过程结束。
（2）取刚剖杀的新鲜鱼内脏破碎后用冰水降温并冲洗去除表面及内部杂质，匀浆，匀浆液暂存于冷库待用，匀浆过程及匀浆液温度保持在0-4℃；
（3）将漂洗好的鱼鳞投入反应罐中，加入2000Kg纯净水，升温至121℃维持10min后降温至,58℃，氢氧化钙调节反应液pH至8.8，加入内脏匀浆液140Kg，保温反应5.5h，反应结束时反应液钠离子含量为378ppm；
（4）反应结束后反应液灭酶、经碟式离心机分离去除脂肪及不溶物，离心机转速6430rpm、重相出口压力1.5bar，脱脂去杂后的反应液加入活性炭脱色，脱色液过滤后进入纳滤脱盐浓缩，当浓缩液固形物含量至32%时，加入浓缩液1倍质量纯净水约900Kg进行洗滤，当洗滤滤液量达到900Kg时开始第二次洗滤，一次洗滤结束时浓缩液钠离子含量为274ppm。重复洗滤步骤，二次、三次、四次、五次、六次和七次洗滤结束时浓缩液钠离子含量分别为187ppm、102ppm、68ppm、38ppm、19ppm和11ppm，结束洗滤过程；
（5）纳滤浓缩液于进风温度192℃、出风温度99℃、雾化压力46bar条件下喷雾干燥得胶原蛋白肽粉280Kg。
经检测所得胶原蛋白肽水分4.0%、灰分0.09%、总氮17.1%、钠含量为37ppm、白度80.6%，无腥味。
实施例7
一种制备无钠胶原蛋白的方法，其步骤如下：
（1）称取2000Kg的新鲜鱼鳞、鱼皮混合物，粉碎，加入8000Kg纯净水，缓慢搅拌50min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为725ppm。向沉淀中加入7000kg纯净水，缓慢搅拌50min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为137ppm。向沉淀中加入7500kg纯净水，缓慢搅拌55min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为36ppm。向沉淀中加入8000kg纯净水，缓慢搅拌60min，静置分层后倾去上清液留下沉淀物，上清液钠离子含量为5ppm，漂洗过程结束。
（2）取刚剖杀的新鲜鱼内脏破碎后用冰水降温并冲洗去除表面及内部杂质，匀浆，匀浆液暂存于冷库待用，匀浆过程及匀浆液温度保持在0-4℃；
（3）将漂洗好的鱼鳞、鱼皮混合物投入反应罐中，加入3500Kg纯净水，升温至121℃维持10min后降温至59℃，氢氧化钙调节反应液pH至8.7，加入内脏匀浆液115Kg，保温反应3.5h，反应结束时反应液钠离子含量为357ppm；
（4）反应结束后反应液灭酶、经碟式离心机分离去除脂肪及不溶物，离心机转速6510rpm、重相出口压力1.5bar，脱脂去杂后的反应液加入活性炭脱色，脱色液过滤后进入纳滤脱盐浓缩，当浓缩液固形物含量至35%时，加入浓缩液1倍质量纯净水约900Kg进行洗滤，当洗滤滤液量达到900Kg时开始第二次洗滤，一次洗滤结束时浓缩液钠离子含量为234ppm。重复洗滤步骤，二次、三次、四次、五次和六次洗滤结束时浓缩液钠离子含量分别为155ppm、93ppm、69ppm、31ppm和13ppm，结束洗滤过程；
（5）纳滤浓缩液于进风温度192℃、出风温度94℃、雾化压力46bar条件下喷雾干燥得胶原蛋白肽粉310Kg。
经检测所得胶原蛋白肽水分4.7%、灰分0.2%、总氮16.9%、钠含量为47ppm、白度81.6%，无腥味。