本发明属于分子生物学领域,涉及一种糖肽类抗生素耐药基因检测的并联探针、基因芯片、试剂盒与检测方法。
背景技术:
在过去的几十年,抗生素广泛用于各种感染性疾病的治疗,但也正是由于抗生素的广泛使用,导致新的抗生素耐药形式不断出现。粪肠球菌、结核分枝杆菌、铜绿假单胞菌对临床上使用的100多种抗生素具有耐药性,成为目前威胁人类生命的重要的细菌杀手。糖肽类抗生素(G1ycopeptides,Dalbahepides)即D-丙氨酰-D-丙氨酸结合性并具有七肽结构的一类抗生素,对包括主要病原菌如凝固酶阳性或阴性葡萄球菌、各组链球菌、肠球菌(包括粪肠球菌和屎肠球菌)、棒杆菌、厌氧球菌和单核细胞增生利斯特氏菌在内的几乎所有的革兰氏阳性菌都具有活性,在临床上常用于由革兰氏阳性菌尤其是葡萄球菌、肠球菌和肺炎链球菌所致严重感染性疾病的治疗,代表着治疗这些严重感染性疾病的最后防线。
自1988年报道糖肽类抗菌药物耐药的肠球菌以来,在全球范围内的医院中常出现。现已发现主要耐药基因VanA、VanB、VanC、VanH、VanR、VanS和VanX 7个基因型。糖肽类抗生素耐药基因可由转座子、质粒携带,通过细菌间的接合作用来传递,使肠球菌中糖肽耐药率不断增加,而且许多万古霉素耐药性肠球菌还对其它抗生素(如β-内酰胺类和氨基糖苷类抗生素)耐药,给万古霉素耐药性肠球菌感染的临床治疗造成很大的困难。另一方面,已发现一些甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌临床分离株对万古霉素和替考拉宁的敏感性减弱,在牛链球菌临床分离株中发现了可转移性vanB耐药决定子,在环状芽孢杆菌临床分离株中发现存在vanA基因簇,说明糖肽耐药基因不仅在肠球菌间传播,而且可传递至肠球菌外的其它细菌,给未来的抗感染治疗带来了极大的威胁,对研制和开发高效准确的糖肽耐药基因的检测在临床辅助治疗具有重要的意义。
生物芯片技术是九十年代发展起来的一项新兴生物技术。按照检测对象来分类,可以分为基因芯片和蛋白质芯片等两大类。与蛋白质芯片相比,基因芯片利用的是核苷酸链之间的互补作用,特异性强,性好。本发明所提供的糖肽类抗生素耐药基因芯片与传统的细菌药敏性检测方法相比,直接针对病原体糖肽类抗生素耐药基因进行检测,其检测通量大、所需样本量少、灵敏度高、准确性高和特异性好等优势。
技术实现要素:
本发明目的是提供一种特异性好、结果准确、假阳性率低、检测效率高的糖肽类抗生素耐药基因检测的并联探针、基因芯片、试剂盒与检测方法。
本发明实现其目的技术方案为:
一种糖肽类抗生素耐药基因检测并联探针,包括探针1~23,其对应的序列如SEQ ID NO.1~23所示。
一种糖肽类抗生素耐药基因检测芯片,包括固体相和权利要求1所述的探针组。
作为优选地,所述固相载体为氨基修饰的玻璃基片、尼龙膜或硝酸纤维素膜。
一种糖肽类抗生素耐药基因检测试剂盒,包括前述的基因芯片。
在上述糖肽类抗生素耐药基因检测试剂盒中,还包括糖肽类抗生素耐药靶基因扩增引物对,引物序列如SEQ ID NO.24~39所示。
作为优选地,所述引物对的下游引物的5’端含有CY3荧光染料标记。
作为优选地,上述糖肽类抗生素耐药基因检测试剂盒,还包括PCR反应体系、杂交缓冲液、洗涤液。
在上述技术方案中,20 μL 的PCR反应体系包括:50~150 ng/μL的扩增模板 2 μL,Premix Taq 10 μL,浓度为8~12 μM的上、下游引物各1 μL,双蒸水6 μL。
一种糖肽类抗生素耐药基因检测方法,使用前述的糖肽类抗生素耐药基因检测试剂盒进行检测,当检测对象的三个探针显示的检测结果一致时可以判断样品是否感染糖肽类抗生素耐药基因;当检测对象的三个探针显示的检测结果不一致时,不能判断该待测样品为阳性或阴性,建议使用该检测试剂盒重新检测或者使用现有其它检测方法进一步验证。
作为优选地,PCR扩增反应程序为95℃ 5 min;95℃10 s、55℃ 30 s、72℃30 s、30个循环;72℃ 10 min。
本发明的有益效果是:每个耐药基因设计3条高特异性的探针,当3条探针的检测结果均为阳性时才判断该项指标为阳性,能极大的提高产品的准确性和精确性,减少其它方法容易出现的假阳性问题;本发明通过PCR技术对病原体糖肽类抗生素耐药基因组进行扩增,检测的特异性高,扩增产物与生物芯片上的寡核苷酸探针进行杂交,通过CY3标记的PCR反向扩增引物检测杂交结果。操作简单、结果易读,满足医疗等现场检测需求,为临床医生快速诊断患者是否被感染糖肽类抗生素耐药基因提供了便捷、快速和准确的理论依据,具有广阔的临床应用市场潜力。
附图说明
图 1 检测糖肽类抗生素耐药基因的基因芯片示意图。
图2待测样品糖肽类抗生素耐药基因扩增后PCR产物电泳条带图;Marker DL2000 (TAKARA)。
具体实施方式
下面将结合附图,对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如分子克隆实验指南(第三版,J. 萨姆布鲁克等著)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。以下实施例用于说明本发明,但不用于限制本发明的范围。
实施例1目的片段引物与探针设计
查找NCBI数据库中糖肽类抗生素耐药基因的基因序列VanA、VanB、VanC、VanH、VanR、VanS和VanX,使用芯片探针设计软件(ArrayDesigner4.2)针对每个耐药基因设计3条探针,另设计16sRNA基因的探针作为阳性质控探针(PC)与随机合成一段探针作为阴性质控探针(NC),对应探针序列如SEQ ID NO .1~23所示。
使用NCBI在线设计软件(Primer-BLAST)设计VanA、VanB、VanC、VanH、VanR、VanS和VanX基因的PCR扩增引物,同时设计16sRNA基因的扩增引物。为了使芯片结果更为直观,在反向扩增引物(R)5’端用CY3荧光染料进行标记,对应的引物序列如SEQ ID NO .24~39所示。
实施例2 芯片的制备
将实施例1中的并联探针按照表1的顺序点样到氨基修饰的玻璃基片上,得到含有探针的基因芯片(如图1所示)。探针浓度为30 μM,每个点0.2 μL,然后80℃孵育1.5 h。
实施例3 检测方法
1、待测样品基因组提取
使用细菌基因组DNA提取试剂盒,按照操作说明书的步骤提取待测样品的基因组作为扩增模板。
2、PCR扩增目的片段
经过大量实验摸索,确定Van检测的靶基因PCR扩增体系和PCR反应程序。将每个Van基因VanA、VanB、VanC、VanH、VanR、VanS、VanX和16SrRNA扩增的引物,分别配制PCR扩增缓冲液体系,总体积为20 μL的PCR扩增体系中含有试剂分别为:Premix LATaq 10μL、F引物(10μM)1 μL、F引物(10 μM)1 μL、扩增模板2 μL、双蒸水6 μL。
PCR反应程序为:95℃ 5 min;95℃10 s、55℃ 30 s、72℃30 s、30个循环;72℃ 10 min。
3、PCR产物与芯片杂交
按照如下步骤操作:
a. 在实施例2中制备好的基因芯片上,将待测样品的VanA、VanB、VanC、VanH、VanR、VanS、VanX和16SrRNA的PCR扩增产物混匀并点样到芯片的检测槽中,VanA引物的PCR产物分别点到VanA-1、VanA-2、VanA-3探针上,VanB、VanC、VanH、VanR、VanS、VanX引物的PCR产物分别对应点到探针上,16sRNA引物的PCR产物分别点到阳性质控探针(PC)与阴性质控探针(NC)。具体步骤为:PCR产物95℃解链5分钟,迅速置于冰上,PCR产物与杂交缓冲液(50%甲酰胺,10×SSC,0.2%SDS)等体积混合,每孔点10 μL混合液,在湿盒中,于60℃杂交孵育2小时;
b. 取出孵育后的基因芯片,用洗涤液(0.3×SSC缓冲液)清洗3次;
c.将芯片放入激光共聚焦检测仪(GenePix)在650 nm处扫描芯片;软件分析荧光信号强度值,给出结果。
实施例4 检测待测样品
从第三军医大学获取糖肽类抗生素耐药细菌感染的样本5份(膝关节积液),无糖肽类抗生素耐药基因感染样本1份(对照组)。按照实施例1和3中的引物和方法分别提取待测样品的基因组,进行PCR扩增后,使用实施例2中的基因芯片进行检测。PCR扩增后的产物电泳条带表明本发明设计的扩增引物特异性高,能特异、灵敏地扩增出目标基因(如图2所示)。
对于细菌感染的样品,激光共聚焦检测仪(GenePix)在650 nm处扫描芯片,探针点荧光信号较强(大于20),记为(+),荧光信号较弱(小于5),则记为(-),荧光信号强度难以分辨(5~20)则记为(*)。检测中同时设计阳性和阴性质控对照,只有当阳性和阴性质控对照的检测结果同时分为别阳性(+)和阴性(-),才认为该组检测结果可信。
判断检测结果时,当VanA、VanB、VanC、VanH、VanR、VanS、VanX基因的3个探针均显示阳性时才判断该样本带有该耐药基因,如果其中某一个或者两个探针显示阳性,则应对该检测样品重新检测,3个探针结果须一致才能采信该检测结果。3个探针检测结果不一致时,也可使用现有其它技术(比如elisa方法)进一步检测验证。检测结果如表2所示。
表2 样本检测结果
结果显示为阳性质控对照均为阳性(+),阴性质控对照均为阴性(-),说明检测结果可信。其中5份样本中均检测到糖肽类抗生素耐药基因感染,样本1被糖肽类抗生素耐药基因VanA感染,样本2被糖肽类抗生素耐药基因VanR感染,样本3被糖肽类抗生素耐药基因VanX感染,样本4被糖肽类抗生素耐药基因VanX感染,样本5被糖肽类抗生素耐药基因VanR感染;对照样本均未检测到糖肽类抗生素耐药基因,与实际临床样本信息情况相符。
本发明公开的探针、基因芯片、试剂盒,特异性高、结果非常准确,检测快速、工作效率高,操作简单,满足医院等的现场检测需求,为诊断糖肽类抗生素耐药细菌感染提供可靠的实验依据。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司
<120> 一种糖肽类抗生素耐药基因检测试剂盒
<130> 2017
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