一种发酵洋葱皮功能性产品及其制备方法与流程

本发明涉及一种发酵洋葱皮功能性产品及其制备方法，特别涉及一种减肥功能产品等。
背景技术：
：近年来，随着经济社会的发展、生活水平的提高、工作方式的转变，人们过上了更加安逸、静态的生活，轿车、电梯取代了人们少有的消耗能量的方式，繁密的工作把人们牢牢地锁在电脑旁，劳累一天回到家就会躺在沙发上看电视，因此，做运动和锻炼身体的时间微乎其微。与此同时，快节奏生活下的饮食既缺乏营养也不健康，人们往往在加班到很晚以后还吃夜宵，日常生活中经常无节制地食用高热量食品，人际场合上过量饮酒，类似不良的饮食方式在快速发展的今天已是司空见惯。人们却不知在享受的背后，无数隐藏的疾病在伺机而来，其中肥胖症也在慢慢靠近。尤其，儿童期单纯性肥胖(以下简称儿童肥胖)是指排除机体各器官自身患有的疾病，因长时间能量吸收过多、消耗较少而导致体内脂肪蓄积的一种营养失衡性疾病。WHO报道，儿童肥胖检出率近年来在全球呈明显上升趋势。目前在全球范围内，5岁以下的儿童大约有4千万超重或者肥胖，学龄儿童体重超标的有1.55亿。我国儿童肥胖的患病率同样不容乐观，在杨淑香等人2012年对城区儿童健康水平的抽样调查中显示，山东潍坊男、女儿童的肥胖率分别为9.9％和4.6％；王钦以3～6岁在园儿童为目标对象调查了义乌市的肥胖症现状，发现该年龄段儿童肥胖检出率为0.89％，男孩为0.53％，女孩为0.36％，并且儿童的肥胖症检出率逐年上升趋势。众所周知，洋葱中含有丰富的生物活性物质，这些成分具有显著的抑菌、降血脂、降血糖、抗血栓、抗肿瘤和抗氧化等保健功效。关于洋葱的多种保健功能及有效成分提取的研究，前人已经有了一定的研究基础。目前，关于洋葱可食部分黄酮的研究较多，而加工生产中的废弃物—洋葱皮却没有得到很好的利用。大量研究证明洋葱黄酮含量从外鳞茎到内鳞茎是依次递减的，洋葱外表皮中的黄酮类物质的含量显著高于可食部分。但事实上，洋葱皮并没有受到人们的重视，也没有得到充分的加工利用，大部分洋葱皮被丢弃，是对资源的极大浪费。如果能够将洋葱皮中富含的黄酮利用起来，不但可以解决加工生产所带来的污染，又可以研究开发洋葱皮深加工产品，这不仅可以促进洋葱加工业的快速发展，对生活、对社会也具有深远的意义。从消费者角度讲，慢性疾病的发病率日益增加，功能保健食品的开发为人们的健康做出了重要保障；依经济角度看，提取洋葱皮中的黄酮类物质，是将洋葱皮变废为宝的有效途径，是科技转化生产力的具体体现；从农民的角度来说，功能产品的研究开发，提高了洋葱皮的综合利用，提高了洋葱产业的整体效益，增加了农民的经济收入。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种洋葱皮中黄酮类化合物的提取方法，其特征在于，包括洋葱皮的发酵步骤和洋葱皮中黄酮类化合物的提取步骤。本发明所述的黄酮类化合物的提取方法，其特征在于，所述发酵步骤中，采用朝鲜族大酱中筛选出来的产纤维素酶酵母菌和产纤维素酶乳酸菌(cy2-2/cy2-4)。本发明所述的黄酮类化合物的提取方法，其特征在于，所述洋葱皮中黄酮类化合物的提取步骤中，还包括乙醇提取步骤。本发明所述的黄酮类化合物的提取方法，其特征在于，所述乙醇提取中，洋葱皮与乙醇的固液比选自1:20～1:40。本发明所述的黄酮类化合物的提取方法，其特征在于，所述乙醇提取中，乙醇浓度选自40％～60％的范围。本发明所述的黄酮类化合物的提取方法，其特征在于，所述乙醇提取中，提取温度选自80℃～90℃的范围。本发明所述的黄酮类化合物的提取方法，其特征在于，所述乙醇提取中，提取时间选自1～2小时的范围。本发明所述的黄酮类化合物的提取方法，其特征在于，还包括精制步骤。本发明所述的黄酮类化合物的提取方法，其特征在于，所述精制步骤为大孔树脂处理步骤。本发明还提供一种减肥保健产品，其包含所述洋葱皮中提出黄酮类化合物。本发明所述的减肥保健产品，其适用于儿童、成人、老人。通过本发明，1.洋葱皮中黄酮类化合物芦丁、槲皮素和山奈酚的含量分别为0.2785mg/g、70.85mg/g、0.7mg/g，槲皮素是洋葱皮中主要的黄酮类物质；2.OPE能够减轻小鼠因摄食高脂饲料导致的营养性肥胖，对摄食量没有显著影响，说明OPE不是通过降低食欲达到减肥的作用，小鼠粪便形态正常，不会引起腹泻；3.OPE能够有效改善小鼠的血脂水平，加快体内脂质的代谢，并提高机体的抗氧化能力，降低患动脉粥样硬化的风险；4.OPE能有效抑制脂肪细胞的膨大，减小脂肪细胞体积，并可清除脂肪在肝脏上的沉积，加快脂肪细胞的动员与代谢，预防脂肪肝的发生；5.OPE降脂减肥的作用与剂量有关，存在剂量效应，中、高剂量效果最为明显，没有显著性差异，而低剂量的效果不很明显，说明一定剂量的OPE具有预防肥胖的作用。除此之外，通过本发明提取得到的黄酮类化合物，具有优异的抗氧化效果，可以期待更多功能性产品的开发。附图说明图1示出本发明的洋葱皮中黄酮类化合物的提取方法的示意图；图2示出产纤维素酶酵母菌生长曲线；图3示出周期内小鼠体重变化趋势；图4示出OPE对小鼠脂肪系数、摄食量、食物利用率的影响；图5示出OPE对小鼠脏器指数的影响；图6示出小鼠血清中TC含量；图7示出小鼠血清中TG含量；图8示出小鼠血清中HDL-C水平；图9示出小鼠血清中LDL-C水平；图10示出小鼠血清中FFA含量；图11示出小鼠肝匀浆中GSH-Px的活力；图12示出小鼠肝匀浆中MDA含量；图13示出小鼠肝匀浆中T-SOD活力；图14示出小鼠肝匀浆中T-AOC活力；图15示出小鼠肝脏对比图；图16示出小鼠肝组织细胞HE染色(400倍)；图17示出小鼠脂肪组织细胞HE染色(100倍)。具体实施方式下面，将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。图1示出本发明的洋葱皮中黄酮类化合物的提取方法的示意图；图2示出产纤维素酶酵母菌生长曲线；图3示出周期内小鼠体重变化趋势；图4示出OPE对小鼠脂肪系数、摄食量、食物利用率的影响；图5示出OPE对小鼠脏器指数的影响；图6示出小鼠血清中TC含量；图7示出小鼠血清中TG含量；图8示出小鼠血清中HDL-C水平；图9示出小鼠血清中LDL-C水平；图10示出小鼠血清中FFA含量；图11示出小鼠肝匀浆中GSH-Px的活力；图12示出小鼠肝匀浆中MDA含量；图13示出小鼠肝匀浆中T-SOD活力；图14示出小鼠肝匀浆中T-AOC活力；图15示出小鼠肝脏对比图；图16示出小鼠肝组织细胞HE染色(400倍)；图17示出小鼠脂肪组织细胞HE染色(100倍)。在本发明中，洋葱皮采集于延吉市某农贸市场，用于发酵的酵母菌由延边大学农学院提供的从大酱中分离提取，实验试剂分别为无水乙醇(分析纯)、甲醇、磷酸、乙腈(色谱纯)、芦丁、槲皮素、山奈酚标准品，作为种子培养基采用牛肉浸膏3.0g、蛋白陈10g、NaC15.0g、葡萄糖1.0g、蒸馏水1000mI。作为发酵培养基：CMC-Nal0g、(NH4)SO44g、KH2PO42g、MgSO4·7H2O0.5g、蛋白陈10g、牛肉膏5g、加水至1000mI。在本发明中，仪器设备分别采用电子天平：FA1104N型，上海精密科学有限公司；旋转蒸发仪:FYFLAN-1001型，东京理化器械株式会社；糖度计:WY032'T型，重庆蜀江科技贸易有限公司；高速粉碎机:FW-200型，北京中兴伟业仪器有限公司；旋转蒸发仪:EYELAN-1001型，东京理化器械株式会社；冷冻干燥机:LGH-18型，北京松源华兴科技发展有限公司；高效液相色谱仪:LC-2010型：日本岛津DPN-9082BS-III电热恒温培养箱：上海新苗医疗设备有限公司。实施例1～9一、<洋葱皮提取物的制备>按照表1，将洋葱皮粉碎后加入到浓度分别为40％、50％、60％的乙醇水溶液中，固液比分别为1:20、1:30、1:40，在80-90℃萃取1-2小时。趁热过滤，滤渣中加一定量的醇水溶液，在相同温度下萃取30min后过滤，方法再进行一次，将三次滤液合并，浓缩至原体积的五分之一，冷冻干燥，计算提取率。表1发酵洋葱皮提取异黄酮按照表1的极差分析结果可以得出，影响洋葱皮异黄酮提取效果各因素的主次顺序为B(提取温度)、D(乙醇浓度)、A(固液比)和C(提取时间)。二、<产纤维素酵母菌的制备>从朝鲜族大酱提取分离出来的产纤维素酵母菌的生长曲线。由图2可以看出，酵母菌在培养基上生长良好，生长停滞期较短，在接种8h后进入对数生长期，60h后生长速率有所下降，80-100h进入稳定期时菌体数量最大，根据生长曲线结果可以确定产纤维素酵母菌的稳定生长期为80-100h。经活化培养后接种于种子培养基中，37℃、120r/min条件下培养24h后作为种子液。按4％接种量接种于产酶培养基中，37℃、120r/min条件下培养，每4h测量培养液吸光度(600nm)，以时间为横坐标，吸光度做纵坐标绘制生长曲线。将种子液接种于产酶培养基中，一定条件下培养制成粗酶液，将粗酶液4℃、3000r/min下离心15min，取上清液测定纤维素酶活力。采用滤滤、纸酶活和CMC酶活测定纤维素酶活。将细菌在一定条件下培养，分别讨论产酶时间、产酶pH及产酶温度对纤维素酶活力的影响，以确定最佳产酶条件。表2异黄酮发酵前后含量变化样品名发酵前含量发酵后含量增长比率芦丁0.000765mg/g0.009173mg/g92％槲皮素0.0084255mg/g0.040636mg/g79％山奈酚0.008424mg/g0.005696mg/g-49％由表2可以看出，洋葱皮最佳条件发酵，最优提取工艺提取以后，异黄酮的总含量有所增长，芦丁和槲皮素的含量在经过发酵之后分别增长了92％和79％，而山奈酚的含量却降低了48％。三、洋葱皮提取物在减肥产品中的应用准确称量芦丁、槲皮素、山奈酚标准品2mg，分别投入到10mL容量瓶容器中，用甲醇(HPLC级)溶解并定容至刻度，放在超声波中20min使溶解完全，得到0.2mg/mL的标准品溶液。再分别精密量取1mL芦丁、槲皮素和山奈酚单体溶液至10mL容量瓶中，定容至刻度，混合均匀，即得到三种标准品的混合溶液。准确称量OPE的粉末2mg，装入到10mL容量瓶容器中，先倒入一半的甲醇将黄酮类物质溶解，放入超声波中20min后，继续用甲醇定容至10mL刻度，然后超声30min，将溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，继而根据准备好的程序和流动相进行检测。色谱柱：DiamonsilC18(250×4.6mm5μm)，选择乙腈-0.4％磷酸溶液作为流动相，流速0.8mL/min，每次以10μL量进样，在360nm波长下进行梯度洗脱(表3)。表3洗脱程序以60只4～5周龄SPF级C57BL-6J雄性小鼠为试验对象，饲养期间自由采食和饮水，按动物实验中心标准进行饲养，温度保持在20～23℃左右，湿度控制在40～60％，自然通风，照明按12/12h自动控制，定期更换垫料，保持生长环境清洁，清洗鼠笼。小鼠适应性饲养1周后，开始预防性抗肥胖试验，周期为10周。不同处理的动物分笼饲养，每周称1次体重，并观察整个过程中小鼠活动程度、体毛色泽、进食情况及粪便形状等。试验10周后，各组小鼠禁食12h，称量终体重后眼球取血，解剖后取小鼠的脏器和脂肪。喂养适应1周后，按体重随机取10只继续喂食基础饲料，列为普通对照组；其余小鼠按体重随机分为五组，通过饲喂高脂饲料进行膳食诱导，分别设置为高脂对照组、实验组(高、中、低)和阳性茶多酚对照。具体喂养方式见表4：表4试验动物分组情况每天对小鼠的生理状况进行记录，如体毛色泽、活泼程度、进食饮水及粪便性状等，称取小鼠的给食量、剩食量和撒食量，单位为g，精确到0.1，统计摄食量(1)。每周称小鼠体重1次，实验结束前，小鼠禁食12h，测定小鼠终体重，并用游标卡尺记录体长(鼻子到肛门的长度)，计算体重增长量(2)和Lee’s指数(3)；计算食物利用率(4)。摄食量＝给食量-剩食量-撒食量(1)体重增长量＝终体重-初体重(2)食物利用率＝体重增长量/摄食量×100(4)小鼠摘眼球取血后，解剖摘取小鼠腹腔脂肪和睾丸附近脂肪，以及小鼠的心、肝、脾、肾，用滤纸吸干脏器上的血液后称量其重量，保留到0.001g，计算脂肪系数(5)和脏器指数(6)。脂肪系数＝体内脂肪总重/体重×100％(5)脏器指数＝脏器重/体重×100％(6)实验结束时，将小鼠解剖摘取肝脏和脂肪，肉眼下观察小鼠肝脏脂肪变性情况，并立即选取左叶肝组织及附睾同一部位脂肪组织(约0.5×0.5×0.8cm)于10％福尔马林溶液中固定，并不时摇动，使组织固定充分、完全，减少淤血对细胞观察的干扰。组织块固定好后，用不同浓度的无水乙醇和二甲苯进行脱水透明，然后将组织用软蜡和硬蜡包埋。蜡凝固后，从包埋盒中取下组织块，根据冷冻切片机的刀片进行必要的修型，然后调节厚度开始切片，摊片的时候要尽量注意避免褶皱，防止细胞在显微镜下展示不完全，烘干后按HE染色程序进行染色，在光学显微镜下观察并拍照。肝脏脂肪组织变性情况，按照《非酒精性脂肪肝诊断标准》进行判定。肝脏相关指标的测定要先制成组织匀浆，在右叶肝组织同一位置取0.3g，将其放在玻璃匀浆管口用剪子剪碎，加入9倍体积(mL)提前放入冰箱中的0.86％生理盐水。为了保持组织匀浆的低温状态，将匀浆管下端插入盛有冰水混合物的三角瓶中，用左手稳住保持平衡。右手将捣杵慢慢地垂直插入套管中，上下研磨使组织匀浆化，为了充分研碎重复10次左右，看不到肝纤维为止。组织匀浆在4℃下2500r/min离心10min取上清液，按照试剂盒指导过程测定肝组织中蛋白含量、MDA、T-SOD、T-AOC、和GSH-Px活力。试验期结束后，摘除小鼠眼球用5ml离心管采集血样，按小鼠编号顺序对离心管标号，置于水浴锅中，37℃水浴30min。取出于高速冷冻离心机上3000r/min条件下离心10min，分离采集小鼠血清，每份分装两管，于-80℃冰箱中保存。根据试剂盒操作具体步骤说明测定血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C和FFA含量。实验数据用Excel办公软件进行统计整理，脂肪细胞用ImageJ软件进行测量，结果采用SPSS17.0统计分析软件进行单因素方差分析，并通过LED法进行差异显著性检验。P>0.05表示差异不显著，P<0.05表示差异显著，数值用(平均值±标准差)的形式表示。在整个实验过程中各组小鼠摄食饮水正常，排泄的粪便呈正常状态，小鼠精神状态较佳，反应敏捷，各组间无撕咬现象。表5OPE对小鼠体重、Lee's指数的影响注：同一列不同小写字母表示同一指标不同处理组间存在显著性差异(p＜0.05)。小鼠身体重量的增量及每周的增长幅度从表5、图3可见。各组小鼠在饲养初期体重无统计学差异(P>0.05)，处于同一水平。随着饲养时间的增加，各组小鼠体重正常生理反应都会逐渐增长，但从折线图中可以看出，高脂组小鼠体重增加的速率最快，高于实验组和普通组，说明小鼠摄食高脂饲料起到了增长体重的作用。到末期称量终体重时，高脂对照组小鼠体重增长了55.42％，普通对照组体重增长32.82％，两组小鼠体重增长有显著的差距，参照保健食品功能学评价程序与检验方法规范，说明小鼠肥胖模型成功。高脂组体重与OPE中剂量组和高剂量组差异显著，表明一定剂量的OPE起到了抑制肥胖的作用；而低剂量组与高脂组的小鼠体重差异不显著，说明低剂量提取物没有起到明显的作用。洋葱皮提取物高剂量组体重增长量与饲喂基础饲料的普通组差异不显著，说明高剂量洋葱皮提取物抑制肥胖作用效果最明显。Lee's指数与人的体重指数(BMI)类似，主要反映机体肥胖程度。从表3可以观察到，其中只有洋低组与高脂组Lee's指数不存在显著性差异，其他组与高脂组比较都看出显著性差异，而除了洋低外的其他组组间无显著差异，说明洋高、洋中和阳性对照组小鼠的肥胖程度与正常组接近。机体的脂肪含量及脂肪系数是反映小鼠肥胖程度的一个重要指标，实验结果从表6、图4可见。OPE中、高剂量组与高脂组相比，脂肪总重、脂肪系数均显示出显著差异(P<0.05)，洋低组的脂肪重和脂肪系数相对高脂对照组比无统计学差异(P>0.05)，效果不是很明显，说明一定剂量的洋葱皮提取物具有良好的抑制体内脂肪堆积的作用。实验组、阳性对照组和高脂对照组之间小鼠的摄食水平基本接近，这说明饲养期间灌胃OPE并没有给小鼠的食欲带来不良影响。喂食高脂饲料的小鼠食物利用率较高，说明肥胖与体内的激素水平有关。饲喂高脂饲料实验组的食物利用率比高脂对照组的食物利用率低，说明OPE可能是通过降低体内食物利用率，而实现控制体重平衡的功效，预示着OPE对体重的影响与摄食量无关。表6OPE对小鼠脂肪系数、摄食量、食物利用率的影响注：同一列不同小写字母表示同一指标不同处理组间存在显著性差异(p＜0.05)。从表7的数据可以看出，各实验组间心脏指数、肾脏指数和脾脏指数均无显著差异(P>0.05)，表明OPE对心、肾、脾脏功能没有明显影响。而高脂组的肝脏指数显著(P<0.05)高于普通组，可能是由于长期摄食高能量的食物，使脂肪在肝脏上的积聚变多所致。灌胃OPE实验组的肝脏指数较高脂组显著(P<0.05)降低，分别降低了6.91％、1.73％、5.19％，与普通对照组差异不明显，这可能是因为洋葱皮中丰富的黄酮类物质起到了抑制脂肪在动物体内堆聚的作用，加速脂肪分解，避免了脂肪在脏器上的沉积。表7OPE对小鼠脏器指数的影响注：同一列不同小写字母表示同一指标不同处理组间存在显著性差异(p＜0.05)。OPE对小鼠血清中的TC、TG、HDL-C、LDL-C和FFA含量的影响如表8、图6～10所示，高脂组TC、TG的水平提升较多，与普通组相比具有显著性差异，说明高能量的膳食诱导会使小鼠血清TC、TG含量升高。对于血清TC、TG的含量与高脂组相比，实验组和阳性对照组均有所降低，中、高剂量组、阳性对照组降低的幅度具有显著性(p<0.05)，而洋低组的降低幅度不显著(P>0.05)；中、高剂量组TG和高剂量组TC含量与正常组无显著差异，说明一定剂量的OPE对于降低小鼠血清TC、TG含量具有一定作用，洋高组比高脂组TC含量降低了11.96％。试验各组间小鼠血清HDL-C水平并无显著性差异(p>0.05)，和高脂组比较，试验组血清HDL-C均有所升高，但无统计学意义。实验组和阳性组血清中LDL-C水平和高脂对照组比较，均有所降低，且除了洋低以外差异都显著(p<0.05)；和普通组比较，实验组和阳性组血清LDL-C水平均有一定程度的升高，但差异不显著。由表6数据可知，高脂组FFA偏大，中、高剂量组和阳性组相比高脂组FFA值平均降低了16.22％，水平接近正常组，但各组间差异不显著。表8OPE对小鼠血脂指标及游离氨基酸的影响注：同一列不同小写字母表示同一指标不同处理组间存在显著性差异(p＜0.05)。综上可知，高脂组小鼠血清TC、TG、LDL-C和FFA含量高于普通组小鼠，血清中HDL-C低于普通组小鼠，说明长久的高能量膳食能够在一定程度上引起小鼠血脂升高，实验组小鼠的血脂水平有所改善，说明添加洋葱皮提取物对于降低小鼠血脂起到一定作用。小鼠灌胃OPE后抗氧化指标的变化见表9和图11～14。高脂组的GSH-Px活力显著(P<0.05)低于普通组，实验组和阳性对照组都能将小鼠肝组织中GSH-Px活力提高，其中中、高剂量组提高的效果比较显著，优于普通组。与普通组相比，高脂组肝组织匀浆MDA含量升高较显著(P<0.05)，己经超出正常对照组的42.2％，反应出高脂膳食诱导小鼠出现高血脂症，以致机体抗氧化能力减弱。洋低组和阳性组能够小幅度地降低MDA含量，但是对比高脂组呈现不显著性差异；洋高和洋中组的肝组织匀浆中MDA含量相对高脂组降低比较显著，与普通组接近，说明OPE能够控制MDA含量，从而加强机体抗氧化能力。测定小鼠的T-AOC水平，高脂组显著(P<0.05)低于普通组，实验组和阳性组T-AOC水平较高脂组相比有所提升，其中洋高组和洋中组提高最为显著，洋低组、阳性组与高脂组比较无统计学意义(P>0.05)。对于T-SOD活力来看，实验组、阳性组、普通组间差异均不显著(P>0.05)，但相对高脂组活力都有所提升，洋中组差异最为显著(P<0.05)，提高了14.45％，说明中剂量的OPE对提升肝T-SOD活力效果最好。表9OPE对小鼠肝脏中GSH-Px,MDA,T-AOC,T-SOD的影响注：同一列不同小写字母表示同一指标不同处理组间存在显著性差异(p＜0.05)。综合对比分析普通组和高脂组小鼠肝匀浆中MDA、T-AOC和相关氧化酶，显示出高能量膳食诱导使得小鼠肝脏中MDA含量升高，T-AOC降低，GSH-Px和T-SOD活力下降，机体抗氧化能力减弱，OPE和茶多酚都能够增强机体抗氧化能力，OPE的作用成效要优于茶多酚。用肉眼观察图15解剖后肝脏图片可知，普通组、洋高组和洋中组的肝脏外观颜色呈红褐色，表面光滑且有光泽，边缘锐利，质软有弹性；肥胖组和洋低组小鼠的肝脏则呈土黄色，没有光泽，肿大易碎，肝表面比普通组粗糙，边缘圆顿，切面有油腻感；阳性组小鼠情况介于二种之间，优于肥胖组和洋低组，但不及中、高剂量效果好。从图16病理学观察中可以看出，高剂量组和中剂量组的肝细胞形态、大小正常，肝索排列相对整齐，肝小叶结构无损坏，与普通组无太大差异。高脂组的肝细胞可见炎性细胞浸润，小泡性脂肪浸润增多，肝细胞发生脂肪变性。阳性组肝细胞脂肪化程度比高脂组和洋低组有改善，但效果不及洋中组，说明OPE一定剂量能有效改善小鼠肝细胞脂肪变性的症状，脂肪化肝细胞的修复作用明显。脂肪细胞的超微显微镜的观察结果见图17。与普通组相比，高脂组的脂肪细胞在形态上明显膨大，显微镜同视野内脂肪细胞数量减少。阳性对照组和实验低剂量组脂肪细胞大小不一，能够在一定程度上减少脂肪细胞的大小。洋高组及洋中组的脂肪细胞形态较为均一，且细胞直径明显小于高脂组，同一视野范围内脂肪细胞数量增加，且效果优于阳性组，可以看出OPE比茶多酚更能够减少脂肪细胞的累积，抑制脂肪细胞膨大。表10小鼠脂肪细胞的直径及面积注：同一列不同字母表示同一指标不同处理组间显著性差异(p＜0.05)。脂肪细胞的直径长短和面积大小从表10可以看出，高脂组脂肪细胞的直径和面积均显著(P<0.05)高于普通对照组，实验组和阳性组与高脂组相比，脂肪的细胞直径及细胞面积均有显著(P<0.05)降低，中、高剂量组起到调节脂肪细胞大小的作用最优，效果优于阳性组。脂肪细胞大小表现出与脂肪组织累积的程度以及体重呈正相关，研究表明肥胖过程伴随着体内脂肪细胞增大增多，脂肪细胞在体内累积增加，从而引起肥胖现象。推测OPE可能是通过加速体内脂肪动员，阻碍脂肪在细胞内累计过多，从而减小脂肪系数，达到减肥的效果。随着物质生活对品质需求的提升以及个人保健意识的逐渐加强，人们对保持健康且形态美的身体显得格外的重视，且肥胖给人们带来的影响不言而喻，于是更多有发展有前景的抗肥胖产品的研发被提上日程。动物模型是研究抗肥胖药物效果、吸收途径以及作用机理的主要工具，选用正确合适的动物对象是实验成功的前提。国内外很多专家将C57BL/6J小鼠应用于肥胖领域的研究，因为C57BL/6J小鼠已经完成全基因组的测序，遗传背景相对明确，个体间的差异较小，对高能量饲料敏感，C57BL/6J小鼠通过饮食诱导形成肥胖模型周期较短，易形成肥胖模型。刘芳等利用C57BL/6J、ICR和KM三种品系的小鼠建立肥胖模型，通过研究对比每个品系小鼠的体重、脂肪重量、机体酶活性及脂肪细胞形态，发现C57BL/6J小鼠比其它两种小鼠更容易形成肥胖模型，相关指标的波动幅度更具有代表性。C57BL/6J小鼠在肥胖领域的应用有很多，为人们寻求健康和美做出了非常多的贡献。如Stewart等以C57BL/6J小鼠为实验对象，研究了槲皮素对高能量饮食后的能量消耗及抗炎水平的影响；顾芹等以C57BL/6J雄性肥胖小鼠为试验对象，研究了不同干预治疗对脂肪组织中TNF-α的影响；曹玉珍等用高脂饲料诱发C57BL/6J小鼠形成脂肪肝，对建模后小鼠的血脂、肝脂质及相关转氨酶进行了研究，结果表明C57BL/6J小鼠是建立脂肪肝模型非常匹配的品系；朱婷婷以C57BL/6J小鼠为研究对象，探讨了高脂高胆固醇饮食是否会引发脂质在肺组织和肺泡上皮细胞上的沉积。综合以上报道表明，C57BL/6J小鼠非常适合作为试验对象用于肥胖领域的研究，除此之外，C57BL/6J小鼠还可以广泛用于遗传学、免疫学、肿瘤学及老年病学研究中。体重、腹腔脂肪重量、Lee’s指数是判断肥胖程度的主要标准。肥胖是指机体内脂肪存积过多，使体重增加而引发的病症，过多的脂肪蓄积常会伴随血脂异常。体重和脂肪量是最直观、简便评判肥胖与否的指标，本实验中高脂组小鼠体重显著高于普通组，体重增长率高于20％，说明高脂小鼠成功造模。OPE试验组的小鼠体重较高脂组相比有不同程度的降低，其中洋高组体重相对降低9.95％，洋中组相对降低了8.61％，两组体重差异不显著(P>0.05)。阳性组体重相对降低了4.73％，效果没有中、高剂量OPE的好，但是高于洋低组，说明一定剂量的OPE比茶多酚能发挥更好的抑制体重增长的作用。小鼠摄食量没有显著差异，表明OPE没有影响小鼠的食欲。实验组小鼠的脂肪重量和脂肪系数低于高脂对照组，说明OPE可能是通过促进脂肪分解达到了抑制体重增长的作用，这可能与小鼠血浆和垂体中的生长激素(GH)水平有关。当小鼠通过高脂膳食诱导形成肥胖后，血浆和垂体中GH含量会降低，从而使促进脂解的能力下降，脂肪细胞会变得膨大或聚积的越来越多，但这些激素的分泌和脂肪的变化都会受到OPE的影响。小鼠喂食高脂饲料易形成肥胖模型，可能因为小鼠的机体不能将摄入的脂肪及时地氧化，而且脂肪在渐渐向体内脏器沉积的过程中会伴随着碳水化合物的氧化，还有消耗能量的能力减弱。所以饲食高能量膳食的小鼠，比食用普通基础饲料小鼠体重增加的快。本实验中，各组小鼠对食物的摄入量没有统计学差异，这说明在饲养过程中没有因为灌胃操作而使小鼠生病、厌食，也说明小鼠对洋葱特有的辛辣味没有产生抵抗行为，日常生活中的摄食饮水都表现正常。食物利用率指小鼠对相同重量食物的吸收利用程度，与体重、摄食量有密不可分的关系。本实验中，高脂对照组小鼠体重增长最显著，同时食物的利用率也显著(P<0.05)高于普通对照组；实验组小鼠体重相对高脂组比有不同程度的降低，食物利用率的水平也呈现不同程度的下降趋势，说明OPE可能是通过抑制机体对食物的吸收利用率而达到控制体重的目的。动物的Lee’s指数相当于人体评判肥胖的指标BMI，数值越大，说明机体越肥胖。本实验中高脂组的Lee’s指数显著(P<0.05)高于普通组，再次证明了肥胖建模的成功。实验组和阳性组的Lee’s指数与普通组不存在显著性差异，说明OPE和茶多酚都有控制肥胖的作用。不过洋低组Lee’s指数降低较少，与高脂组没有统计学差异，说明OPE的减肥效果有量效关系。机体的肥胖与否和生长发育情况，一定程度上会在动物的脏器上体现，脏器指标能够从基础上反映出机体的健康状况及生长状态。本实验结果表明，各组小鼠的心脏、脾脏和肾脏的影响较小，没有显著性差异，说明OPE没有损害心脏、脾脏和肾脏的功能，没有明显的副作用。在同等的饲养环境下，高脂对照组肝脏指数显著(P<0.05)高于其他组，这可能是过多的能量摄入以脂肪的形式沉积在肝脏上，使肝脏发生肿大。同时肝脏是机体新陈代谢和消化吸收的重要器官，是最大的消化腺，自身很容易受到进入体内的食物和周围环境的影响。实验组和阳性组的肝脏指数与高脂组比有显著性差异(P<0.05)，肝脏指数降低，说明食用高脂饲料的同时灌胃OPE能减少脂肪在肝脏中的沉积，降低脂肪肝发生的几率。KyeWonPark等的研究显示，黄酮类物质能很好的保护肝脏，减少肝脏脂肪的沉积，降低肝脏指数。TG是脂肪在人体内主要的贮存方式，是脂类代谢的重要指标，胆固醇也是脂质代谢的重要指标之一，是许多疾病的影响因子。血浆中TG和TC的浓度超过正常限定值，一般会被诊断为高脂血症。肥胖的人一般都带有高脂血症，使血液的粘滞程度增加，加大患心血管疾病的危险。HDL-C是逆向转运胆固醇的载体，作用是将周围组织中的胆固醇吸收起来，然后运送至肝脏使其分解，以清除因LDL摄入过多造成的胆固醇及胆固醇酯在血管壁上的沉积。体态肥胖者基本都会出现脂肪代谢异常，主要的特征就是TG、TC和LDL-C的浓度较正常人高，HDL-C含量相反地会降低。本实验中，高脂组小鼠的血液生化指标与此现象一致，脂肪代谢出现紊乱，这可能与肥胖者胰岛素水平较高密切相关，高胰岛素会加速脂肪的合成，同时也会减慢TG自身的降解速度。本实验采用高脂膳食诱导的方法，通过高脂饲料诱导小鼠形成高脂血症，使脂肪代谢紊乱，这与人类的单纯营养性肥胖有一定的相似性。对血清生化指标进行测定，结果表明，高脂组小鼠的TC、TG、LDL含量明显高于普通组，HDL含量却显示降低，说明小鼠高脂血症模型成功。实验组和阳性组均能不同程度的降低TC、TG、LDL含量，说明OPE和茶多酚都能够抑制高血脂小鼠血清中TC、TG和LDL-C水平的升高，缓解HDL-C的降低，且OPE的效果更好。高脂组是由高脂膳食诱导的肥胖模型，肥胖易导致代谢综合征，使血清中FFA升高，因此会降低肝细胞胰岛素受体对胰岛素的结合能力，并会加速受体胰岛素的降解，抑制肝脏对葡萄糖的摄取，引起脂毒性作用。FFA是TG被脂肪细胞分解后的产物，往往肥胖程度越大，脂肪堆积的量会越多，分泌FFA也会越多，中心型肥胖严重的危害性就是归因于此。过量的FFA分泌，会损害胰岛β-细胞，引发糖尿病，还会造成脂肪肝和高血压等疾病。本实验中，实验组和阳性组都能减少FFA的分泌，中、高剂量组和阳性组的FFA含量与普通组无显著差异，但洋低组降低的不明显。有研究表明，黄酮类物质主要是通过抗氧化作用来实现降血脂的作用，大量动物试验及临床研究证实，机体抗氧化能力的衰弱与肥胖有密切联系。肥胖减弱机体抗氧化能力的途径可能是通过降低抗氧化酶、过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶的活性而达到的，而过多的脂质过氧化物和ROS可消耗细胞内谷胱甘肽和维生素E，导致机体酶促及非酶促防御体系的抗氧化能力减弱。黄酮类化合物中某些成分可鳌合金属离子，使其失去催化脂质氧化的能力，阻碍氧化反应的发生，从而促进抗氧化能力提高。SOD是保护机体不受抗氧化损伤最重要的一类抗氧化酶，T-AOC则是反映机体总抗氧化水平高低的指标，GSH是“抗氧化剂复合链”主要成员之一，是机体内分解过氧化物的一类抗氧化剂。实验结果发现高能量饮食使高脂组小鼠肝匀浆中T-SOD、T-AOC、GSH-Px水平明显下降，增加了脂质过氧化终产物MDA的含量，表明机体抵抗氧化损伤的体系被破坏，不能正常发挥清除自由基的作用。而实验组可以使小鼠肝脏中MDA含量下降，T-AOC活力增强，提升机体防御体系，说明OPE可以有效提高SOD和GSH-Px的活性，降低MDA带来的损害，并且能力的大小与剂量的多少呈相关性。单纯性脂肪肝主要是脂肪、脂肪酸和TG在肝脏上聚积形成负荷，肝脏动态平衡被破坏，FFA含量增多被陆续运送至肝组织，而肝脏对FFA的氧化能力下降，加重TG血症。用400倍显微镜观察肝脏切片，饲喂基础饲料的普通组肝组织的结构完整，肝细胞呈放射状规则地排列在中央静脉周围，并且肝小叶的结构非常清晰。但是高脂组的肝组织切片呈现出片状模糊，肝细胞发生肿胀，细胞中含有大小不等的脂肪滴空泡，出现脂肪细胞浸润。阳性组的肝细胞脂肪浸润数量少于高脂组，能一定程度的减少肝脏上脂肪的堆聚，经大量报道证实，茶多酚起到减肥作用的主要途径就是抑制胆固醇在体内的吸收，以及加速机体内不必要的脂肪分解。从染色后的肝组织显微图片看，中、高剂量组的肝细胞出现脂肪滴的数量比阳性组更少，说明一定剂量的OPE会比茶多酚更能抑制脂肪沉积，OPE的效果更佳。肥胖患者一般对外界的应激反应不是很敏感，能量消耗的较少，多余的能量就会以中性脂肪的形式储存起来，形成白色脂肪组织，这也是为什么肥胖的人不容易瘦下来的原因。脂肪细胞是评价能量代谢平衡的关键指标，可以通过分泌细胞因子，调节和控制机体的行为和功能，还可通过自身的氧化能力调节脂类的数量。有研究表明，大多数成人体内脂肪细胞的数量不会发生显著变化，肥胖者一般不是脂肪细胞的个数增多，而是体积的膨大，越来越多大型的脂肪细胞堆积在一起，就导致了脂肪细胞的变性而形成肥胖。通过对各组小鼠脂肪细胞直径及面积的测定，我们可以看出实验组和阳性对照组能够显著抑制脂肪细胞体积的膨大。OPE对饮食诱导的营养性肥胖小鼠有明显的抑制肥胖效果，并且减肥的作用程度与剂量大小呈正相关。OPE浓度过低不能发挥出理想的减肥效果，中、高剂量的作用效果比较可观，效果比同等剂量的茶多酚突出，说明OPE能够发挥出良好的抑制脂肪细胞膨大、缓解脂肪细胞堆积的作用。通过本发明，1.洋葱皮中黄酮类化合物芦丁、槲皮素和山奈酚的含量分别为0.2785mg/g、70.85mg/g、0.7mg/g，槲皮素是洋葱皮中主要的黄酮类物质；2.OPE能够减轻小鼠因摄食高脂饲料导致的营养性肥胖，对摄食量没有显著影响，说明OPE不是通过降低食欲达到减肥的作用，小鼠粪便形态正常，不会引起腹泻；3.OPE能够有效改善小鼠的血脂水平，加快体内脂质的代谢，并提高机体的抗氧化能力，降低患动脉粥样硬化的风险；4.OPE能有效抑制脂肪细胞的膨大，减小脂肪细胞体积，并可清除脂肪在肝脏上的沉积，加快脂肪细胞的动员与代谢，预防脂肪肝的发生；5.OPE降脂减肥的作用与剂量有关，存在剂量效应，中、高剂量效果最为明显，没有显著性差异，而低剂量的效果不很明显，说明一定剂量的OPE具有预防肥胖的作用。通过本发明的制备方法得到的产品，其粗提产品适用于制备各种功能性保健食品，精提产品既可适用于功能性保健食品的制备，也可适用于抗氧化药品及减肥药品的制备。当前第1页1 2 3