本发明公开了一种采用氧化酶拆分α-羟酸酯的方法，属于工业微生物领域。
背景技术：
α-羟酸酯(alpha-hydroxy esters)是α-羟酸与醇酯化脱水后得到产物，在医药领域有着广泛的应用，如丹参素与异丙醇脂化后生成的丹参素异丙酯等。
化学合成的外消旋α-羟酸酯常用的酶拆分的方法是采用脂肪酶或酯酶水解方案，如一种酯酶拆分(±)-扁桃酸甲酯的方法(中国专利201510212293.4)、猪胰脂肪酶作水解拆分甘油丁酸酯(缩水甘油丁酸酯的对映选择性酶促水解.华南理工大学学报，1999，25(2)：209～212)、Novozym 435对羟基苯甘氨酸甲酯的不对称水解(脂肪酶催化外消旋对羟基苯甘氨酸甲酯水解制备对映体纯D-对羟基苯甘氨酸的新方法.催化学报，2005，26(2)：106～110)等。但脂肪酶的立体选择性不高，很难在高回收率下得到99％以上的光学纯产品。
本发明采用α-羟酸氧化酶进行α-羟酸酯的手性拆分，α-羟酸氧化酶家族已知成员有：乳酸氧化酶、乙醇酸氧化酶、扁桃酸氧化酶和长链α-羟酸氧化酶等。这些酶通常被用于外消旋α-羟酸的手性拆分(中国专利201210109290.4)。
技术实现要素：
α-羟酸氧化酶拆分外消旋α-羟酸酯的步骤为：称取外消旋α-羟酸酯加入到反应器中使外消旋α-羟酸酯的初始反应浓度为1-40mM，再加入pH为4-10的反应缓冲液和α-羟酸氧化酶形成反应体系，α-羟酸氧化酶用量为1-100μg/ml，在20-50℃下水浴摇床150r/min振荡，反应时间为1-24小时，α-羟酸氧化酶氧化其对应的α-羟酸酯。按照此方法进行拆分，对映体过量高达到99.9％，产率最高接近50％。
产物(R)-α-羟酸酯的光学纯度通过对映体过量值(％e.e)来评价。
当采用L-α-羟酸氧化酶拆分时，得到光学纯的(R)-α-羟酸酯(D-α-羟酸酯)
对映体过量值％e.e＝[(SR-SS)/(SR+SS)]×100％
(R)-α-羟酸酯得率(％)＝(SR/S0)×100％
当采用D-α-羟酸氧化酶拆分时，得到光学纯的(S)-α-羟酸酯(L-α-羟酸酯)
对映体过量值％e.e＝[(SS-SR)/(SR+SS)]×100％
(S)-α-羟酸酯得率(％)＝(SR/S0)×100％
式中SS为反应后(S)-对映体的峰面积，SR为反应后(R)-对映体的液相色谱峰面积，S0为反应前(S)-和(R)-对映体的液相色谱峰面积总和。
产物测定的液相色谱条件为：Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流动相体积比为正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝80:20:0.1，流速为0.5mL/min，柱温25℃，检测波长210nm，进样量20μL。
所述的α-羟酸酯为下列之一：丹参素冰片酯、丹参素异丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸异丙酯、对羟基苯乳酸冰片酯、对羟基苯乳酸异丙酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸异丙酯、丹参素细辛醇酯、乳酸冰片酯、苯乳酸细辛醇酯、对羟基苯乳酸细辛醇酯、乳酸乙醇酯、α-羟基丁酸丙醇酯。所述的α-羟酸酯，可以根据中国专利200610042787.3、201410180490.8、201410175950.8和20140699506.6公布的方法合成。
本发明所用的α-羟酸氧化酶有：L型和D型两类。
L型α-羟酸氧化酶有：鼠肝α-羟酸氧化酶(根据文献制备得到：Aliphatic l-α-hydroxyacid oxidase from rat livers purification and properties.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)–Enzymology,1968,167:9-22)，鸡肝α-羟酸氧化酶(根据文献制备得到：Purification and some characteristics of chicken liver L-2-hydroxyacid oxidase A.FEBS Lett.1990,266:183-6)，Pediococcus sp.乳酸氧化酶(购自sigma),Aerococcus viridans乳酸氧化酶(购自日本Asahi Kasei Pharma Corporation)，Lactococcus lacti乳酸氧化酶(根据文献制备得到：Gene cloning,purification,and characterization of a lactate oxidase from Lactococcus lactis subsp.cremoris IFO3427，Journal of Fermentation and Bioengineering，1998,85(5),507-510)。
D型α-羟酸氧化酶有：Archaeoglobus fulgidus乳酸氧化酶(根据文献制备得到：Cellular localization of D-lactate dehydrogenase and NADH oxidase from Archaeoglobus fulgidus，Archaea.2002；1(2):95-104),Sulfolobus tokodaii乳酸氧化酶(根据文献制备得到：A novel flavin adenine dinucleotide(FAD)containing d-lactate dehydrogenase from the thermoacidophilic crenarchaeota Sulfolobus tokodaii strain 7:purification,characterization and expression in Escherichia coli.J Biosci Bioeng.2008，106(1):16-21)，
本发明的有益之处：本专利所指的氧化酶均以FAD或FMN为辅酶，与以NAD或NADP为辅酶的羟酸脱氢酶或乳酸脱氢酶相比，逆反应极微弱，无论提取的酶液或α-羟酸氧化酶的基因工程菌全细胞均适用于规模化制备手性纯α-羟酸酯。同时该方法解决了脂肪酶水解拆分法光学选择性差的缺点，具有重要的工业应用价值。
具体实施方式
实施例1
配制5ml反应体系，外消旋丹参素异丙酯浓度为40mM，L型鼠肝α-羟酸氧化酶浓度为100μg/ml，pH6，30℃水浴摇床150r/min振荡24小时，测定(R)-丹参素异丙酯的对映体过量为99.9％，产率为49.9％。
实施例2
配制5ml反应体系，外消旋丹参素冰片酯浓度为1mM，L型鸡肝α-羟酸氧化酶浓度为1μg/ml，pH7，35℃水浴摇床150r/min振荡1小时，测定(R)-丹参素冰片酯的对映体过量为85.2％，产率为36.2％。
实施例3
配制10ml反应体系，外消旋丹参素细辛醇酯浓度为5mM，L型Pediococcus sp.乳酸氧化酶浓度为50μg/ml，pH 8，40℃水浴摇床150r/min振荡12小时，测定(R)-丹参素细辛醇酯的对映体过量为99.7％，产率为49.8％。
实施例4
配制10ml反应体系，外消旋乳酸冰片酯浓度为10mM，L型Aerococcus viridans乳酸氧化酶浓度为5μg/ml，pH 4，40℃水浴摇床150r/min振荡8小时，测定(R)-乳酸冰片酯的对映体过量为73.1％，产率为38.5％。
实施例5
配制5ml反应体系，外消旋苯乳酸冰片酯浓度为20mM，L型Lactococcus lacti乳酸氧化酶浓度为10μg/ml，pH 5，45℃水浴摇床150r/min振荡8小时，测定(R)-苯乳酸冰片酯的对映体过量为95.2％，产率为44.4％。
实施例6
配制5ml反应体系，外消旋苯乳酸异丙酯浓度为30mM，D型Archaeoglobus fulgidus乳酸氧化酶浓度为20μg/ml，pH 6，50℃水浴摇床150r/min振荡4小时，测定(S)-苯乳酸异丙酯的对映体过量为91.9％，产率为40.5％。
实施例7
配制5ml反应体系，外消旋对羟基苯乳酸冰片酯浓度为1mM，D型Sulfolobus tokodaii乳酸氧化酶浓度为30μg/ml，pH 7，20℃水浴摇床150r/min振荡2小时，测定(S)-对羟基苯乳酸冰片酯的对映体过量为99.9％，产率为49.9％。
实施例8
配制5ml反应体系，外消旋对羟基苯乳酸异丙酯浓度为5mM，L型鼠肝α-羟酸氧化酶浓度为40μg/ml，pH 8，25℃水浴摇床150r/min振荡4小时，测定(R)-对羟基苯乳酸异丙酯的对映体过量为79.6％，产率为38.9％。
实施例9
配制5ml反应体系，外消旋扁桃酸冰片酯浓度为10mM，L型鸡肝α-羟酸氧化酶浓度为50μg/ml，pH 9，30℃水浴摇床150r/min振荡6小时，测定(R)-扁桃酸冰片酯的对映体过量为99.9％，产率为49.9％。
实施例10
配制5ml反应体系，外消旋扁桃酸异丙酯浓度为20mM，L型Pediococcus sp.乳酸氧化酶浓度为60μg/ml，pH 6，35℃水浴摇床150r/min振荡8小时，测定(R)-扁桃酸异丙酯的对映体过量为99.9％，产率为49.9％。
实施例11
配制5ml反应体系，外消旋苯乳酸细辛醇酯浓度为30mM，L型Aerococcus viridans乳酸氧化酶浓度为100μg/ml，pH 7，40℃水浴摇床150r/min振荡10小时，测定(R)-苯乳酸细辛醇酯的对映体过量为95.9％，产率为46.9％。
实施例12
配制5ml反应体系，外消旋乳酸对羟基苯乳酸细辛醇酯浓度为1mM，L型Lactococcus lacti乳酸氧化酶浓度为30μg/ml，pH 8，45℃水浴摇床150r/min振荡12小时，测定(R)-对羟基苯乳酸细辛醇酯的对映体过量为99.9％，产率为49.9％。
实施例13
配制5ml反应体系，外消旋乳酸乙醇酯浓度为40mM，D型Archaeoglobus fulgidus乳酸氧化酶浓度为30μg/ml，pH 9，50℃水浴摇床150r/min振荡14小时，测定(S)-乳酸乙醇酯的对映体过量为99.9％，产率为49.9％。本实施例中液相测定所用的检测器为视差检测器。
实施例14
配制5ml反应体系，外消旋α-羟基丁酸丙醇酯浓度为1mM，D型Sulfolobus tokodaii乳酸氧化酶浓度为20μg/ml，pH 7，30℃水浴摇床150r/min振荡20小时，测定(S)-α-羟基丁酸丙醇酯的对映体过量为99.9％，产率为49.9％。本实施例中液相测定所用的检测器为视差检测器。