用于制备优化的治疗分子的方法与流程

发明领域本发明涉及基于第一前导(lead)免疫球蛋白设计针对靶标优化的免疫球蛋白文库、优选抗体文库的方法。本发明的多个方面进一步涉及通过该方法设计的免疫球蛋白文库，并且涉及选自该文库的免疫球蛋白。发明背景通常通过优化初始前导抗体来设计抗体治疗剂，从而选择所需特征，如结合亲和力、kd、或缺乏免疫原性。通常在动物如表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠中生成人抗体。在前导候选抗体的生成和分离之后，可以以多种方式优化抗体。通常，对前导抗体进行测序，并且序列用于生成变体的抗体文库以用于进一步筛选。可以使用寡核苷酸构建变体以向编码区(例如，针对cdr中的一个或多个进行编码的区域)中引入简并性(degeneracy)。寡核苷酸可以用于针对抗体进行编码的核酸的区域的pcr扩增。这通常将会生成包含许多变体的大文库，其中利用许多潜在置换来替换在前导中的每个氨基酸残基。之后可以将文库克隆至表达载体中，从而生成抗体本身。可以使用展示系统如核糖体、噬菌体或酵母展示系统。之后可以将由此制备的抗体过滤以用于所需性质的改善。关于这些已知方法的缺点是，生成可能远比将会显示出理想性质的多的变体。这增加了生成文库和选择用所需特征的变体抗体所需的时间和资源。此外，优化完整人抗体的重链和轻链二者增加了所需的工作量，并且对于抗体的性质来说引入了另外的不确定性，尤其是对于当组装时具有重和轻免疫球蛋白链二者的抗体来说。本发明意在解决这些缺点中的至少一些，并且提供用于生成免疫球蛋白文库的另外的方法。这通过借助因体细胞超突变(somatichypermutation)过程而得到的免疫动物本身的某些变体的有效预选择而部分实现。在天然抗体生成期间，b细胞的增殖伴随着在b细胞受体基因座(locus)中极高的体细胞突变率，这产生了所需的抗体多样性。突变主要集中在某些体细胞超突变热点处。本发明利用这种多样性的天然产生，从而告知了免疫球蛋白文库的设计。发明概述本发明提供一种设计用于优化第一前导免疫球蛋白的生物学性质的免疫球蛋白文库的方法，所述方法包括：a)鉴别一种或多种相关免疫球蛋白，所述一种或多种相关免疫球蛋白与第一前导免疫球蛋白相关，各免疫球蛋白针对靶抗原通过用靶抗原使包含人免疫球蛋白基因的转基因非人哺乳动物免疫而产生；b)比较第一前导免疫球蛋白和一种或多种相关免疫球蛋白的氨基酸序列；c)基于序列比较鉴别(i)第一前导免疫球蛋白和一种或多种相关免疫球蛋白之间，和/或(ii)在一种或多种相关免疫球蛋白是多种免疫球蛋白的情况下，多种免疫球蛋白之间，存在变体氨基酸残基的一个或多个位点，其中存在变体氨基酸残基的一个或多个位点包括用于修饰第一前导免疫球蛋白的潜在位点；d)基于序列比较选择用于修饰以用相关免疫球蛋白中的一种或多种的相应变体氨基酸替换第一前导免疫球蛋白的氨基酸的一个或多个位点；并且e)基于在选择的用于修饰的位点中的一个或多个处修饰的第一前导免疫球蛋白的序列生成用于文库的免疫球蛋白序列。优选地，免疫球蛋白包含cdr3。免疫球蛋白可以包含一组cdr：cdr1、cdr2和cdr3，优选一组重链cdr：hcdr1、hcdr2、和hcdr3。免疫球蛋白可以由仅有重链抗体的组成或者包含仅有重链的抗体。免疫球蛋白可以由vh结构域组成或者包含vh结构域。优选地，一种或多种相关免疫球蛋白是常见谱系(lineage)的并且结合与第一前导免疫球蛋白相同的靶抗原，优选地相比于前导免疫球蛋白在至少一个cdr区中具有至少70％、80％、85％、90％、或至少95％的同源性。常见谱系意指免疫球蛋白来源于相同种系(germline)序列，例如免疫球蛋白可以通过在非人哺乳动物中的种系序列的体细胞超突变而获得，尤其是在用靶抗原使非人哺乳动物免疫之后。通过将前导免疫球蛋白序列、例如前导vh序列与相同谱系的其他免疫球蛋白序列、例如vh序列进行比对，可以鉴别在免疫应答期间靶向的体细胞超突变热点。一种或多种相关免疫球蛋白通常在cdr3中与前导免疫球蛋白具有至少70％的同源性，优选在cdr3中与前导免疫球蛋白具有至少70％、80％、85％、90％、或至少95％的同源性。一种或多种相关免疫球蛋白通常在cdr1和/或cdr2中与前导免疫球蛋白具有至少70％的同源性，优选在cdr1和/或cdr2中与前导免疫球蛋白具有至少70％、80％、85％、90％、或至少95％的同源性。一种或多种相关免疫球蛋白通常在构架区中与前导免疫球蛋白具有至少70％的同源性，优选种系构架区中与前导免疫球蛋白具有至少70％、80％、85％、90％、或至少95％的同源性。一种或多种相关免疫球蛋白可以包括多种相关免疫球蛋白，包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、或25种免疫球蛋白。步骤c)可以包括鉴别在免疫球蛋白序列的cdr内的用于修饰的位点，其中如果在相关免疫球蛋白中的至少一个、两个、三个、四个、或五个中存在变体氨基酸残基，则在cdr内的位点被认为是用于修饰的位点。步骤c)还可以包括鉴别在免疫球蛋白序列的cdr外的用于修饰的位点，其中如果在相关免疫球蛋白中的至少20％中存在变体氨基酸残基，则在cdr外的位点被认为是用于修饰的位点。如果修饰本将被鉴定为是用于修饰的位点的潜在的用于修饰的位点(尤其是cdr外的潜在的用于修饰的位点)将会导致向修饰的免疫球蛋白中引入以下特征中的一个或多个，则所述位点不被鉴别为是用于修饰的位点：(i)未配对的半胱氨酸，(ii)氧化位点(游离甲硫氨酸)，(iii)糖基化位点，(iv)脱酰胺位点，和(v)异构化位点。在步骤d)中选择的序列可以包括反映在用于修饰的位点处的修饰的每种可能的组合的变体序列。在选择的用于修饰的位点处的修饰可以仅包括保守性氨基酸置换。变体免疫球蛋白可以不包含在选择的用于修饰的位点外的修饰。步骤e)还可以包括生成另外的变体免疫球蛋白的序列，其中所述序列在选择的用于修饰的位点中的一个或多个处被进一步修饰，以利用针对相应变体氨基酸的保守性氨基酸替换来替换第一前导免疫球蛋白的氨基酸。步骤e)还可以包括生成另外的变体免疫球蛋白的序列，其中所述序列在选择的用于修饰的位点中的一个或多个处被进一步修饰，以用未在相关免疫球蛋白的相应残基处发现的氨基酸来替换第一前导免疫球蛋白的氨基酸。在本文中所述的方法还可以包括步骤f)生成包含具有在步骤e)中生成的序列的免疫球蛋白的免疫球蛋白文库。可以使用多种在本领域中常规的方法生成文库。本发明的方法还可以包括步骤g)筛选免疫球蛋白文库以鉴别一种或多种具有所需生物学性质的免疫球蛋白。所需的生物学性质包括但不限于结合亲和力、ic50、良好的表达特征、溶解性、稳定性、缺乏免疫原性/抗药物抗体(ada)生成的潜力。本发明的方法可以包括在步骤a)之前，生成并且测序包括第一前导免疫球蛋白和一种或多种相关免疫球蛋白在内的多种免疫球蛋白的步骤α)。所述多种免疫球蛋白可以通过用靶抗原使非人哺乳动物、优选小鼠或大鼠、优选表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或大鼠免疫而生成。本发明的方法可以包括在步骤a)之前，鉴别第一前导免疫球蛋白的步骤β)。可以基于一种或多种所需生物学性质选择第一前导免疫球蛋白，包括但不限于对靶抗原的适宜地高的结合亲和力、对靶抗原的特异性、对靶抗原的选择性、中和靶抗原的作用的能力、与来自其他物种的相应靶抗原的所需的交叉反应性、ic50、良好的表达特征、溶解性、稳定性、缺乏免疫原性/ada的潜力。在本发明的方法中，免疫球蛋白可以是抗体或抗体的抗原结合片段。免疫球蛋白可以包含仅有重链的抗体或者由仅有重链的抗体组成。免疫球蛋白可以包含抗体的vh结构域或者由vh结构域组成。本发明提供一种优化前导免疫球蛋白的方法，所述方法包括：a)进行上述本发明的方法；并且b)基于所述优化的免疫球蛋白的所需生物学性质从所述文库中选择一种或多种优化的免疫球蛋白。本发明提供一种编码多种免疫球蛋白的多核苷酸的文库，其中根据上述本发明的方法设计所述多种免疫球蛋白的序列。本发明提供一种包含多种免疫球蛋白的文库，其中根据上述本发明的方法设计所述多种免疫球蛋白的序列。本发明提供一种根据上述本发明的方法设计或选择的分离免疫球蛋白。本发明提供一种包含编码本发明的免疫球蛋白的核苷酸序列的分离核酸分子。本发明提供一种包含本发明的免疫球蛋白的氨基酸序列的分离多肽。本发明提供一种载体，其包含本发明的核酸分子。本发明提供多种载体，其包含本发明的多核苷酸文库。本发明提供一种包含本发明的一种载体或多种载体的宿主细胞。宿主细胞可以是细菌，例如大肠杆菌(e.coli)；酵母、分离的哺乳动物细胞或细胞系，例如cho或ns0细胞系。本发明提供一种获得本发明的免疫球蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：提供根据本发明的宿主细胞；允许宿主细胞表达由在载体中包含的核酸分子编码的免疫球蛋白；并且将免疫球蛋白纯化。所述方法还可以包括制备组合物，如包含所得到的免疫球蛋白的药物制剂。本发明提供一种包含本发明的免疫球蛋白的嵌合或融合多肽。本发明提供一种缀合物，其包含与额外部分缀合或融合的本发明的免疫球蛋白或本发明的嵌合或融合多肽。额外部分可以包括对相同或不同靶抗原特异性的一种或多种vh结构域，优选人vh结构域，细胞毒素，放射性核素，延长半衰期的部分，例如hsa或其变体、fc、peg或抗hsa结合分子，例如包含抗hsavh结构域。本发明提供组合物，如包含本发明的免疫球蛋白、本发明的嵌合多肽或本发明的缀合物的药物制剂。附图简述图1示出了抗il-17a克隆1.1vh家族以及仅有重链的前导抗体候选物克隆1.1(顶部行)的vh结构域的序列以及相关抗体的那些。cdr部分以阴影表示。图2示出了biacore数据，其显示了分别针对靶标人il-17a和il-17ra产生的(a)克隆1.1和(b)克隆2.1vh的结合动力学。图3示出了基于针对标记物(m)fermentas1k+梯运行的克隆1.1的用于构建变体文库的核酸区段的pcr产物的琼脂糖凝胶分析。图4示出了仅有重链的前导抗体候选物克隆2.1(顶部行)的vh结构域的序列连同相关抗体的那些。cdr部分以阴影表示。图5示出了基于针对标记物(m)generuler100bp梯(thermosm0243)运行的克隆2.1的用于构建变体文库的核酸区段的pcr产物的琼脂糖凝胶分析。图6示出了biacore数据，其显示了克隆1.1和克隆2.1vh的优化的变体的结合动力学：(a)亲本vh1.1，优化的vh克隆1.10和1.6；(b)亲本vh2.1和优化的vh2.2。发明详述现在将参照具体的实施方案进一步描述本发明。应理解的是，这些实施方案仅是说明本发明，并且本发明是如权利要求所限定的。此外，技术人员将会想到所描述的实施方案的改变和变化。通常，与在本文中所述的细胞和组织培养、病理学、肿瘤学、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交结合使用的命名以及它们的技术是在本领域中公知和常用的那些。除非另外指出，本公开的方法和技术通常根据在本领域中公知的和如在整个说明书中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中描述的常规方法进行。参见，例如，sambrook等人，分子克隆：实验室手册(molecularcloning:alaboratorymanual)(第2版，冷泉港实验室出版社(coldspringharborlaboratorypress)，冷泉港(coldspringharbor)，纽约(1989))。如在本领域中通常完成的或如在本文中所描述的，酶反应和纯化技术根据制造商说明书进行。在本文中所述的与分析化学、合成有机化学、以及药物和制药化学结合使用的命名以及它们的实验室操作和技术是在本领域中公知和常用的那些。标准技术用于化学合成，化学分析，药物制备、配制、和运输，以及患者的治疗。术语“抗体”广义上是指由四个多肽链(两个重(h)链和两个轻(l)链)组成的任何免疫球蛋白(ig)分子或其抗原结合部分，或保持ig分子的必需的表位结合特征的任何功能片段、突变体、变体、或其衍生物。这样的突变体、变体、或衍生物抗体形式是在本领域中已知的。在全长抗体中，每个重链由重链可变区(在本文中缩写为hcvr或vh)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域ch1、ch2和ch3组成。每个轻链由轻链可变区(在本文中缩写为lcvr或vl)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。vh和vl区可以进一步分为被称为互补决定区(cdr)的超变区，夹杂有被称为构架区(fr)的更保守的区域。每个vh和vl由三个cdr和四个fr组成，其从氨基端到羧基端以下列顺序设置：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，igg、ige、igm、igd、iga和igy)、种类(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或子类的。如在本文中所描述的抗体也可以包含单一结构域抗体或者由其组成，其中所述结构域是vh免疫球蛋白结构域。因此，抗体可以包含具有一个或多个vh结构域但是没有vl结构域的免疫球蛋白单一可变结构域抗体(svd、sdab或isv)或者由其组成。已经在本领域中描述了单一结构域抗体；它们是其互补决定区是单一结构域多肽的一部分的抗体。优选地，一个或多个vh结构域是人vh结构域。如在本文中所使用的，术语vh或“可变重链结构域”是指如由kabat等人，免疫学目的序列(sequencesofimmunologicalinterest)，第5版，美国卫生与公众服务部(u.s.dept.health&humanservices)，华盛顿特区(1991)所定义的免疫球蛋白可变重链结构域。在可变结构域内的cdr氨基酸残基的编号和定位是根据公知的kabat编号习惯。在本文中所述的抗体包含氨基酸序列，并且其优选的序列和/或部分如cdr是在本文中限定的。术语“cdr”是指在抗体可变序列内的互补决定区。在重链(和轻链，当存在时)的可变区中的每一个中存在三个cdr，其对于可变区中的每一个来说表示为cdr1、cdr2和cdr3。术语“cdr组”是指在能够结合抗原的单一可变区中出现的一组三个cdr。已经根据不同的系统不同地限定了这些cdr的确切边界。由kabat描述的系统是优选的。术语“kabat编号”、“kabat定义”和“kabat标记”在本文中可互换使用。在本领域中接受的这些术语是指对与抗体或其抗原结合部分的重和轻链可变区中的其他氨基酸残基相比更可变(即高变)的氨基酸残基进行编号的系统(kabat等人，(1971)ann.nyacad.sci.190:382-391和kabat等人，(1991)免疫学目的蛋白的序列(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest)，第五版，美国卫生与公众服务部(u.s.departmentofhealthandhumanservices)，nih出版号91-3242)。关于多肽或多核苷酸的比较的“同源性”通常是指，在对序列进行比对并且在一些实施方案中引入空位(如果需要)以实现最大百分同源性并且不认为任何保守性置换是序列同一性的一部分之后，在第一序列中与相应第二多肽(或多核苷酸)的残基相同的氨基酸(或核苷酸)残基的百分比。无论是n端或c端延伸还是插入，都不应被解释为降低同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序是在本领域内公知的。“保守性氨基酸置换”是在以下表中指出的那些：残基保守性置换残基保守性置换alaserleuile；valarglyslysarg；glnasngln；hismetleu；ileaspgluphemet；leu；tyrglnasnserthr；glycysserthrser；valgluasptrptyrglyprotyrtrp；phehisasn；glnvalile；leuileleu；val表1.保守性氨基酸置换术语“kd”是指“平衡解离常数”并且是指在滴定测量中在平衡时得到的值，或通过解离速率常数(koff)除以结合速率常数(kon)得到的值。“ka”是指亲和性常数。结合速率常数、解离速率常数和平衡解离常数用于表示抗体与抗原的结合亲和力。用于确定结合和解离速率常数的方法是在本领域内公知的。使用基于荧光的技术提供高灵敏度和在平衡时检查生理缓冲液中的样品的能力。可以使用其他实验方法和仪器如(生物分子相互作用分析)。用于制备免疫球蛋白(假定是氨基酸序列或编码氨基酸序列的核苷酸序列)的方法将会是对于技术人员来说已知的。某些技术可以用于促进所制备的免疫球蛋白或免疫球蛋白文库的筛选；例如，可以在噬菌体、噬菌粒、核糖体或适合的微生物(如酵母)上展示氨基酸序列的文库，如促进筛选。用于展示和筛选氨基酸序列(的组、集合或文库)的适合的方法、技术和宿主生物将会是对于本领域技术人员来说清楚的(参见例如，肽和蛋白质的噬菌体展示：实验室手册(phagedisplayofpeptidesandproteins:alaboratorymanual)，学术出版社(academicpress)；第1版(1996年10月28日)briank.kay,jillwinter,johnmccafferty)。可以在转基因啮齿类动物中表达在本文中提及的免疫球蛋白。转基因啮齿类动物，例如小鼠，具有降低的表达内源性抗体基因的能力。在一个实施方案中，啮齿类动物具有降低的表达内源性轻和/或重链抗体基因的能力。因此啮齿类动物可以包含额外修饰以干扰内源性轻和/或重链抗体基因的表达，从而不制备功能性内源性轻和/或重链。啮齿类动物可以是小鼠。小鼠可以包含非功能性λ轻链基因座。因此，小鼠不产生功能性内源性λ轻链。λ轻链基因座可以部分或完全缺失或者通过插入使其成为非功能性的。例如，至少恒定区基因c1、c2和c3可以缺失或者通过插入使其成为非功能性的。可以将基因座功能上沉默从而小鼠不产生功能性λ轻链。此外，小鼠可以包含非功能性κ轻链基因座。因此，小鼠不产生功能性内源性κ轻链。κ轻链基因座可以部分或完全缺失或者通过插入使其成为非功能性的。例如，具有功能上沉默的内源性λ和κl链基因座的小鼠可以根据在wo2003/000737中公开的做出，其通过整体引用结合于此。此外，小鼠可以包含非功能性重链基因座。因此，小鼠不产生功能性内源性重链。例如，如在wo2004/076618(通过整体引用结合于此)中描述的，所有8个内源性重链恒定区免疫球蛋白基因(μ、δ、γ3、γ1、γ2a、γ2b、ε和α)均不存于小鼠中或者部分不存在达到它们为非功能性的程度，或者基因δ、γ3、γ1、γ2a、γ2b和ε不存在并且侧翼基因(flankinggene)μ和α部分不存在达到使它们成为非功能性的程度，或者基因μ、δ、γ3、γ1、γ2a、γ2b和ε不存在并且α部分不存在达到使其成为非功能性的程度，或者δ、γ3、γ1、γ2a、γ2b、ε和α不存在并且μ部分不存在达到使其成为非功能性的程度。部分缺失意指，例如通过插入，内源性基因座基因序列已经缺失或破坏至没有由基因座编码功能性内源性基因产物的程度，即没有由基因座表达功能性产物。在另一个实施方案中，基因座是功能上沉默的。在一个实施方案中，小鼠包含非功能性重链基因座、非功能性λ轻链基因座和非功能性κ轻链基因座。因此小鼠不产生任何功能性内源性轻或重链。因此，小鼠是三敲除(tripleknockout,tko)小鼠。转基因小鼠包含编码并且表达异源重链基因座的载体。yac是可以用于酵母中非常大的dna插入物的克隆的载体。除了包含具有与天然酵母染色体一样的行为所必需的所有三个顺式作用结构元件(自主复制序列(ars)、着丝粒(cen)和两个端粒(tel))之外，它们接受大dna插入物的能力使得它们能够达到类似染色体的稳定性和在酵母细胞中的运输的保真性(fidelity)所需的最小尺寸(150kb)。yac的构建和使用是在本领域内公知的(例如，bruschi,c.v.和gjuracic,k.酵母人工染色体(yeastartificialchromosomes)，生命科学百科(encyclopediaoflifesciences)2002macmillanpublishersltd,naturepublishinggroup)。可以根据标准技术构建转基因小鼠。用于构建转基因小鼠的两个最具有特点的途径是通过遗传物质向新受精的卵母细胞中的原核显微注射或者通过稳定转染的胚胎干细胞向桑葚胚(morula)或胚泡(blastocyst)阶段胚胎中的引入。无论如何引入遗传物质，都将被处理的胚胎转移至其中怀孕继续并且候选转基因幼崽出生的假怀孕的雌性接受者。这些广泛方法之间的主要差异是可以在它们用于构建转基因动物之前对es克隆进行大规模筛选。相比之下，原核显微注射依赖于在其引入之后整合至宿主基因组的遗传物质，并且一般来说，直到幼崽出生之后才能确认转基因的成功结合。在本领域中已知存在许多既辅助又确定转基因的成功整合是否发生的方法。可以通过多种手段产生转基因动物，包括构建体向基因组中的随机整合、位点特异性整合、或同源重组。存在多种可以用于既驱动又选择转基因整合和后续修饰的工具和技术，包括抗药性标记物的使用(阳性选择)、重组酶、重组介导的表达盒(cassette)交换、阴性选择技术、和提高重组效率的核酸酶。这些方法中的大多数常用于es细胞的修饰中。然而，这些技术中的一些可以具有增强通过原核注射介导的转基因的效用。进一步的改进可以用于得到在所需背景中转基因品系的更有效的产生。如上所述，在优选实施方案中，将内源性小鼠免疫球蛋白表达沉默以允许将引入的转基因仅用于表达可以用于药物发现的仅有重链的组成成分。可以如上所述使用基因处理的小鼠，例如针对所有内源性免疫球蛋白基因座(小鼠重链、小鼠κ链和小鼠λ链)沉默的tko小鼠。可以通过繁殖实现任何引入的转基因向这种tko背景的转移(常规的或者包括ivf步骤以给出该过程的有效测量)。然而，也可以在转基因操作期间包括tko背景。例如，对于显微注射来说，卵母细胞可以来源于tko供体。类似地，可以得到来自tko胚胎的es细胞以用于转基因。本文所述的免疫球蛋白可以与另一个部分缀合。该部分可以选自毒素、酶或放射性同位素；或延长半衰期的部分如hsa或peg或抗hsaig，例如抗hsavh。该部分可以选自细胞毒性分子如化疗药物、细菌和植物毒素以及放射性核素。在结合分子与肿瘤细胞结合以及药物部分的细胞毒活性的释放和/或活化时发生肿瘤细胞杀伤。通过药物缀合物得到的选择性使对正常细胞的毒性最小化，从而增强患者中药物疗法的耐受性。在本文中所述的是组合物，例如包含免疫球蛋白的药物组合物。药物组合物通常包含一种或多种活性剂(在这种情况下，是免疫球蛋白)和药用载体。组合物可以根据所需的施用途径来配制。施用途径的实例包括但不限于局部施用，包括向或通过皮肤的皮肤施用，皮下或静脉内施用，口服、局部、肠胃外、舌下、直肠、阴道、眼部、和鼻内施用。肠胃外施用包括皮下注射、静脉内、肌内、胸骨内注射或输注技术。组合物可以采取一个或多个剂量单位的形式。技术人员将会知晓用于制备药物制剂的适合的方法。药用载体可以是微粒，从而组合物是例如片剂或粉剂形式的，例如是冻干的，以用于在使用之前重构。一种或多种载体可以是液态的，并且组合物是，例如可注射液体。此外，一种或多种载体可以是气态的，从而提供可用于例如吸入施用的气雾剂组合物。术语“载体”是指稀释剂、佐剂或赋形剂，组合物的活性剂与其一起施用。这样的药物载体可以是液体，当静脉内施用在本文中所述的药物组合物时，水或生理盐水是优选的载体。也可以使用盐水溶液和葡萄糖和甘油水溶液作为液体载体，尤其是对于可注射溶液来说。如果需要，组合物还可以含有少量的润湿或乳化剂、ph缓冲剂、或提高配制物的稳定性和溶解性的试剂。组合物可以是液体的形式的，例如溶液、乳液或悬浮液。液体可以用于通过注射或静脉内输注来递送。在用于局部向皮肤施用或通过注射或输注施用的组合物中，还可以包含表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲液、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。在本文中所描述的液体组合物，无论它们是溶液、悬浮液还是其他类似形式，还可以包含以下中的一种或多种：无菌稀释剂如注射用水，盐水溶液优选生理盐水、林格氏溶液(ringer'ssolution)、等渗氯化钠，非发挥性油如合成的甘油单酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、或其他溶剂；抗菌剂如苄醇或对羟苯甲酸甲酯；和用于调节张力的试剂如氯化钠或葡萄糖。可以将肠胃外组合物封装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃、塑料或其他材料制成的多剂量小药瓶中。在本文中所述的免疫球蛋白的在特定病症或病况的治疗中有效/活性的量将会取决于病症或病况的性质，并且可以通过标准临床技术确定。此外，可以任选采用体外或体内测定以帮助鉴别最佳的剂量范围。在组合物中采用的精确剂量还将会取决于给药途径和疾病或病症的严重性，并且应当根据从业人员的判断和每位患者的情况确定。正确的剂量还将会根据特定的配制物、应用方式、以及其特定的位置、宿主和被治疗的疾病而变化。应当考虑其他因素，比如年龄、体重、性别、饮食、施用时间、排泄率、宿主的情况、药物组合、反应灵敏度和疾病的严重程度。可以在最大耐受剂量内连续地或周期地进行施用。实施例在针对内源性重链和轻链产生沉默但是表达外源性人重链的转基因三敲除小鼠中针对抗原il-17a和il-17ra产生包含vh的仅有重链的抗体。得到两个前导抗体，克隆1.1和克隆2.1，并且在后续优化步骤中使用。以下材料和方法部分提供了所使用的小鼠平台和前导抗体的生成的简要情况。优化步骤和分析在实施例中描述。材料和方法用于免疫的tg/tko小鼠根据之前描述的(wo2004/076618和wo2003/000737,ren等genomics,84,686,2004；zou等,j.immunol.,170,1354,2003)，构建携带在针对内源性重链和轻链抗体表达沉默的背景下的种系构型中的重链抗体转基因基因座的小鼠(三敲除，或tko)。在具有包含与缺少ch1结构域的小鼠免疫球蛋白恒定区基因、小鼠增强子和调节区结合的多种人vh、d和j基因的酵母人工染色体(yac)的新受精卵母细胞的原核显微注射之后，得到转基因(tg)小鼠。酵母人工染色体(yac)是可以用于酵母中非常大的dna插入物的克隆的载体。除了包含具有与天然酵母染色体一样的行为所必需的所有三个顺式作用结构元件(自主复制序列(ars)、着丝粒(cen)和两个端粒(tel))之外，它们接受大dna插入物的能力使得它们能够达到类似染色体的稳定性和在酵母细胞中的运输的保真性所需的最小尺寸(150kb)。yac的构建和使用是在本领域内公知的(例如，bruschi,c.v.和gjuracic,k.酵母人工染色体(yeastartificialchromosomes)，生命科学百科(encyclopediaoflifesciences)2002macmillanpublishersltd,naturepublishinggroup/www.els.net)。所使用的yac为约340kb或572kb，包含其天然构型中的10个人或23个重链v基因、人重链d和j基因、鼠cγ1基因和鼠3’增强子基因。其缺乏ch1外显子。将转基因祖先小鼠与缺少内源性免疫球蛋白表达的动物回交以构建在所描述的免疫研究中使用的tg/tko品系。用于免疫的抗原免疫使用重组的纯化蛋白。重组人il-17a购自peprotech(peprotech,目录号af-200-17)。还使用重组人il-17a。也可以使用其他免疫原并且包括如dna、粗蛋白和转染细胞之类的材料。免疫方案向tg/tko施用重组蛋白。简而言之，8-12周龄的小鼠各自接受在完全弗氏佐剂(completefreund’sadjuvant)中乳化并且皮下递送的总计10μg的重组蛋白，接着进行在不完全弗氏佐剂中乳化、也皮下施用、在初始启动以各种间隔提供的1-10μg的重组蛋白的强化免疫。在磷酸盐缓冲盐水中，在不存在佐剂的情况下，腹膜内施用最后剂量的抗原。也可以采用备选的免疫途径和操作。例如，可以使用不同的佐剂或免疫增强操作代替弗氏佐剂。dna免疫通常肌内递送或通过基因枪递送。尽管并非专门地，通常腹膜内施用转染细胞或来自这样的细胞的膜制剂。来自免疫小鼠的文库的生成和抗体vh的克隆a)处理组织、rna提取和cdna制造将脾、腹股沟和肱淋巴结从免疫的动物中收集至rnalatertm中。对于每只动物，单独处理1/3的脾和4个淋巴结。首先，将组织均化；在将组织转移至裂解基质d珠管(lysingmatrixdbeadtube)(mpbio目录号116913100)之后，加入600μl的含有β-巯基乙醇的rlt缓冲液(来自qiagenrneasy试剂盒，目录号74104)，之后使用6m/s40秒的周期在mpbiofastprep均化器(目录号116004500)中均化。将含有均化组织的管转移至冰上，并且通过以10g微量离心5分钟将碎片沉淀。将上清液的400μl的样品移除并且用于rt-pcr。首先，遵循制造商规程使用qiagenrneasy试剂盒目录号74104提取rna。之后将每个rna样品用于使用superscriptiiirt-pcr高保真试剂盒(invitrogen目录号12574-035)制备cdna。对于每个脾和lnrna样品来说，进行5次rt-pcr反应，各自使用与用于vh1、vh2、vh3、vh4或vh6家族的引物结合的vh_j/f(长)引物。引物的详情如下。表2.引物。加粗的残基与pucg3具有同源性。基于以下管反应组分，为rt-pcr反应制备主混合物(mastermix)。12.5μl2x反应混合物0.5μl正向引物(10μm)0.5μl反向引物(10μm)0.5μl酶混合物500ng-1μgrna用水达到25μl在热循环器中使用以下条件进行rt-pcr反应：通过凝胶电泳确认在370bp范围内的产物。对于每个小鼠，针对来自1/3脾的给定家族和4个淋巴结中的每一个对vh产物进行扩增，并且之后集中以利用根据厂商说明书使用的thermo/fermentasgenejetpcr纯化试剂盒(目录号k0702)纯化，并且将产物在50ul的水中洗脱。b.克隆至噬菌粒载体中在这些研究中采用噬菌粒载体pucg3。如所指出的，可以使用包括用ncoi和xhoi进行限制性酶消化、连接和转化的常规方法将vh克隆至pucg3中。备选地，可以使用基于pcr的方法构建vh噬菌粒文库。这两种操作都用于由扩增的vh序列生成文库。在本领域中广泛使用前一种方法并且可以找到详情。对于基于pcr的方法来说，使用以下操作：使用pcr构建pucg3的线性化形式；引物：pucg3-f3ctcgagggtggcggtagccatcaccaccatc(seqidno:65)pucg3-r3tccatggccatcgccggctgggccgcgag(seqidno:66)将具有gc缓冲液的phusion高保真pcr主混合物(目录号f532l，neb)用于包含以下试剂的pcr反应；所使用的循环条件是使用fermentasgenejet凝胶纯化试剂盒(目录号k0691)，根据厂商说明书，利用在40μl的洗脱缓冲液中的最终洗脱，将pcr产物(3152bp)凝胶纯化。基于以下反应，采用纯化的vhrt-pcr产物作为具有线性化pucg3的大引物(megaprimer)，得到噬菌粒产物以用于转化和文库创建：pcr如下进行；在1％琼脂糖凝胶上分析pcr的产物。使用fermentaspcr纯化试剂盒(目录号k0702)，根据厂商说明书，并且最终洗脱在25μlh2o中的情况下，将各种家族vh/噬菌粒产物纯化，并且用于使用biorad10×1mm比色杯(biorad目录号165-2089)、eppendorfeporator和预热的恢复培养基(lucigen，专用混合物)通过电穿孔将tg1大肠杆菌(lucigen，目录号：60502-2)转化。将2μl的纯化产物加入至25μl的细胞中以用于电穿孔，并且以1800v对每个vh/噬菌粒产物进行高达10次电穿孔。在以150rpm振荡的情况下在37℃温育1小时的50mlfalcon管中，集中并且回收电穿孔的细胞。进行10倍稀释系列的试样量的转化，并且接种在含有补充有2％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素(ampicillin)的2xty琼脂的佩特里培养皿(petridish)中。使用在这些培养皿上的所得克隆估算文库大小。将其余部分的转化接种在含有补充有2％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的2xty琼脂的大号生物测定培养皿上。将所有琼脂平板在30℃下温育过夜。将10ml的2xty培养基加入至大号生物测定培养皿中，并且刮取菌落，并且测量od600(1.0的od＝5×108个细胞/ml)。将试样在加入50％v/v甘油溶液(50％)之后在-80℃下储存在冷冻小瓶(cryovial)中或者直接在噬菌体选择过程中使用。抗体的选择从免疫的小鼠中获得多种仅有重链的抗体，并且通过结合elisa、生物化学抑制测定、基于细胞的抑制测定、和测定的组合，使用标准技术，筛选对免疫原(il-17a或il-17ra)的结合亲和力、抑制il-17a/il-17ra相互作用的能力、和结合动力学。从这些筛选中，选择两种抗体作为前导抗体——针对il-17a产生的克隆1.1和针对il-17ra产生的克隆2.1。biacore测定在biacoret200仪器上测量vh抗体的结合动力学。将靶标(重组il-17a或il-17ra)在ph5.5的乙酸盐缓冲液(biacore，目录号br-100-52)中稀释至1μg/ml并且使用胺偶联化学(nhs-edc胺偶联试剂盒，目录号br-1000-50)和biacore固定wizard软件与cm5系列s芯片(目录号br-1006-68)偶联。以这种方式，将100ru的靶标固定，并且还制备空白表面(无靶标)以用于参比差减(referencesubtraction)。通过单循环动力学确定vh抗体的结合动力学。在稀释系列(通常为以在最高浓度的100nmvh开始的1:3稀释系列)中制备vh抗体，并且之后在涂布有抗原的表面以及空白表面上注射，以vh的最低浓度开始并且之后逐步工作多至最高浓度。之后根据(减去空白的)传感图描记图使用1:1结合模型和biaevaluation软件确定vh结合动力学。实施例1.含有体细胞超突变的组合的诱变的vh的生成a.含有体细胞超突变的组合的克隆1.1vh(抗il-17avh)变体的生成使用新型优化策略以增加从免疫的小鼠分离的vh的结合亲和力。将前导vh与相同谱系的其他成员进行比对以鉴别在免疫应答期间靶向的体细胞超突变热点(图1)。在这些位置处的氨基酸的选择构成了新的重组文库方法的基础，并且导致了以选择在每个突变热点处具有最佳氨基酸的较高亲和力的vh为目标的新的文库的设计。作为il-17a的实例，将克隆1.1直接从如上所述的免疫的tg/tko小鼠中分离。显示这种vh以高亲和力与il-17a结合(图2)。vh克隆1.1与相同谱系的其他成员的比对鉴别了许多在免疫应答期间突变的氨基酸位置，并且vh-cdr和vh构架区二者均受影响(图1)。之后使用该信息设计旨在鉴别vh克隆1.1的较高亲和力的变体的新的克隆1.1重组文库。表3.引物将具有hf缓冲液的phusion高保真pcr主混合物(目录号f531l，thermo)用于针对每个引物配对如下设置的pcr反应：pcr如下进行；在1％琼脂糖凝胶上分析每个pcr的产物(图3(a))。之后使用fermentaspcr纯化试剂盒(k0701)将每个产物纯化至40μl洗脱缓冲液中。之后设置装配(assembly)pcr以重建完整vh序列：pcr如下进行；将0.5μl的引物v3/pelb(长)和vh_j/f(长)(二者均为10μm)加入至反应中，并且之后在以上条件下继续额外10个pcr循环。将pcr产物在1％琼脂糖凝胶上分析(图3(b))并且使用fermentaspcr纯化试剂盒纯化至40μl洗脱缓冲液中。之后使用pcr产物作为大引物以用于如在实施例2中描述的文库构建。b.含有体细胞超突变的组合的克隆2.1vh(抗il-17ra)变体的生成也将相似的重组文库方法用于以vh克隆2.1为名的抗il-17ra谱系。显示这种vh以高亲和力与il-17ra结合(图2)。克隆2.1与相同谱系的其他成员的比对鉴别了许多在免疫应答期间突变的氨基酸位置(图4)。之后使用该信息设计旨在鉴别克隆2.1的较高亲和力的变体的新的克隆2.1重组文库。表4.引物将phusion高保真dna聚合酶(目录号f518，thermo)用于针对每个引物配对如下设置的pcr反应：pcr如下进行；在1％琼脂糖凝胶上分析每个pcr的产物(图5(a))。之后使用fermentaspcr纯化试剂盒(k0701)将每个产物纯化。之后设置装配(assembly)pcr以重建完整vh序列：将pcr产物在1％琼脂糖凝胶上分析(图5(b))并且使用fermentaspcr纯化试剂盒纯化至40μl洗脱缓冲液中。之后使用pcr产物作为大引物以用于如在实施例2中描述的文库构建。实施例2.诱变的克隆1.1和克隆2.1vh的噬菌体展示文库的生成使用基于pcr的方法构建含有克隆1.1和克隆2.1诱变序列的vh噬菌粒文库。基于以下反应，采用纯化的vh装配pcr产物(来自实施例1)作为具有线性化pucg3噬菌粒载体的大引物，得到产物以用于转化和文库创建；pcr如下进行；使用fermentaspcr纯化试剂盒(目录号k0702)，根据厂商说明书，并且最终洗脱在25μlh2o中的情况下，将vh/噬菌粒pcr产物纯化。将纯化的vh/噬菌粒pcr产物用于使用biorad10×1mm比色杯(biorad目录号165-2089)、eppendorfeporator和预热的恢复培养基(lucigen，专用混合物)通过电穿孔将tg1大肠杆菌(lucigen，目录号：60502-2)转化。将2μl的纯化产物加入至25μl的细胞中以用于电穿孔，并且以1800v对每个vh/噬菌粒产物进行高达10次电穿孔。在以150rpm振荡的情况下在37℃温育1小时的50mlfalcon管中，集中并且回收电穿孔的细胞。进行10倍稀释系列的试样量的转化，并且接种在含有补充有2％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素(ampicillin)的2xty琼脂的佩特里培养皿(petridish)中。使用在这些培养皿上的所得克隆估算文库大小。将其余部分的转化接种在含有补充有2％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的2xty琼脂的大号生物测定培养皿上。将所有琼脂平板在30℃下温育过夜。将10ml的2xty培养基加入至大号生物测定培养皿中，刮取菌落，并且测量od600(1.0的od＝5×108个细胞/ml)。将试样在加入50％v/v甘油溶液(50％)之后在-80℃下储存在冷冻小瓶(cryovial)中或者直接在噬菌体展示选择中使用。在一些实例中，直接挑取克隆并且确定序列，得到文库的多样性的预估。对于克隆1.1和克隆2.1二者，构建具有大于1e8(1x108)的重组体的噬菌体展示文库以完全捕获通过诱变pcr反应产生的vh多样性。实施例3.诱变的克隆1.1和克隆2.1vh文库的噬菌体展示选择根据公开的方法(抗体改造(antibodyengineering)，bennylo编，第8章，161-176页，2004年)进行文库噬菌体储备物的制备和噬菌体展示选择。在大多数情况中，使用与淘选(panning)方法组合的噬菌体展示将结合vh结构域分离。然而，在本领域中充分描述了各种不同的选择方法，包括可溶性选择、在应力(例如，热)下进行的选择和竞争性选择，其中作为竞争加入过量的抗原或抗原反应性vh结构域以促进高亲和力vh结构域的恢复或者使选择偏离特定的表位。对于克隆1.1和克隆2.1重组文库二者来说，进行一轮淘选选择(将50μl体积在pbs中10ug/ml的抗原固定在maxisorb平板(nunc443404)上)，接着使用在后续几轮选择时降低量的抗原进行2-3轮的可溶性选择(1nm到低至100pm的生物素化抗原)。实施例4.具有改善的结合亲和力的vh的鉴别使用biacoret200仪器筛选来自不同选择的vh以鉴别具有改善的结合亲和力的vh。将重组il-17a(peprotechaf-200-17)在ph5.5的乙酸盐缓冲液(biacore，目录号br-100-52)中稀释至1μg/ml并且与cm5系列s芯片(目录号br-1006-68)偶联，使用胺偶联化学(nhs-edc胺偶联试剂盒，目录号br-1000-50)和biacore固定wizard软件。以这种方式，将100ru的il-17a固定，并且还制备空白表面(无il-17a)以用于参比差减(referencesubtraction)。对于il-17ra来说，首先通过在ph4的乙酸盐缓冲液(biacore，目录号br-100-49)中将蛋白质g稀释至20μg/ml来制备蛋白质g芯片，并且之后使用胺偶联化学将1200ru与cm5系列s芯片偶联。之后使用该表面从溶液中捕获il-17rafc融合蛋白：以30μl/分钟流量注射10秒的在hbs中的10μg/ml的il-17ra将会将大约100-150ru的il-17ra捕获至蛋白质g表面上。通过单循环动力学确定优化的克隆1.1(抗il-17a)和克隆2.1(抗il-17ra)vh的结合动力学。在稀释系列(通常为以在最高浓度的100nmvh开始的1:3稀释系列)中制备vh，并且之后在涂布有抗原的表面以及空白表面上注射，以vh的最低浓度开始并且之后逐步工作多至最高浓度。之后根据(减去空白的)传感图描记图使用1:1结合模型和biaevaluation软件确定vh结合动力学。在biacore分析之后，从重组文库中分离对il-17a具有高达10倍提高的亲和力的克隆1.1的变体(例如，克隆1.10和克隆1.6，图6(a))。类似地，对于克隆2.1来说，分离新型变体(克隆2.2)，其对il-17ra的亲和力提高了5倍(图6(b))。序列表信息vh核酸序列1.1gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagtagttattcgatgtactgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtggccaacataaagcaagatggaagtgagaaatactatgtggactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtttctgcaaatgaatagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgaaaggggaaatactacccctccactttgactactggggccagggaaccctggtcactgtctcctca(seqidno:9)1.6gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagtagttatagcatgtactgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtggccgagataaagcaagatggaagtgagcaatactatgtggactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaatagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgaaaggggaaatactacccctctactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca(seqidno:10)1.10gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagtagttatcgcatgtactgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtggccagcatagaacaagatggaagtgaggaatactatgtggactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaagtcactgtttctgcaaatgaatagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgaaaggggaaatactacccctctactttgactactggggccagggaaccctggtcactgtctcttca(seqidno:11)2.1caggtccagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggataccccttcaccagttatgatatcaattgggtgcgacaggccacaggacaaagccttgagtggatgggatggatgaaccctaacagtggtgacacagtctatgcacagaaattccagggcagagtcaccatgaccaggaatacctccataagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtatttttgtgcgagaggcagaagggatgactggaagaacaattattggggccagggaaccctggtcactgtctcctca(seqidno:12)2.2caggtccagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggataccccttcaccagttatgatatcaattgggtgcgacaggccacaggacgaagccttgagtggatgggatggatgaaccctaccaatggtaacacagtctatgcacagaaattccaggacagagtcaccatgaccaggaatacctccataagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtatttttgtgcgagaggcagaagggatgactggaagaacaattattggggccagggaaccctggtcactgtctcctca(seqidno:13)表5.vh氨基酸序列序列表<110>克雷森多生物制剂有限公司<120>用于制备优化的治疗分子的方法<130>pc927560wo<150>gb1500464.1<151>2015-01-12<160>66<170>bissap1.3<210>1<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>1ggattgttattactcgcggcccag24<210>2<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<220><221>misc_feature<222>11<223>/note="n=a,c,t或g"<400>2ctggtgaaggngtatccagaagccttgc28<210>3<211>93<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<220><221>misc_feature<222>18<223>/note="n=a,c,t或g"<220><221>misc_feature<222>28<223>/note="g或c"<220><221>misc_feature<222>31<223>/note="a或t"<220><221>misc_feature<222>64<223>/note="a或g"<400>3gcaaggcttctggatacnccttcaccanttntgatatcaattgggtgcgacaggccacag60gacnaagccttgagtggatgggatggatgaacc93<210>4<211>70<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<220><221>misc_feature<222>20<223>/note="c或t"<220><221>misc_feature<222>41<223>/note="a或c或t"<220><221>misc_feature<222>44<223>/note="c或t"<220><221>misc_feature<222>46<223>/note="c或g或t"<220><221>misc_feature<222>47<223>/note="c或g或t"<220><221>misc_feature<222>48<223>/note="c或t"<400>4cctggtcatggtgactctgncctggaatttctgtgcatagncantnnnagggttcatcca60tcccatccac70<210>5<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>5ggcagagtcaccatgaccaggaa23<210>6<211>32<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<220><221>misc_feature<222>12<223>/note="c或t"<220><221>misc_feature<222>20<223>/note="a或c"<400>6gttcttccagtnatcccttntgcctctcgcac32<210>7<211>32<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<220><221>misc_feature<222>13<223>/note="g或t"<220><221>misc_feature<222>21<223>/note="a或g"<400>7gtgcgagaggcanaagggatnactggaagaac32<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>8ccgtggtgatggtggtgatg20<210>9<211>357<212>dna<213>智人<400>9gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactc60tcctgtgcagcctctggattcacctttagtagttattcgatgtactgggtccgccaggct120ccagggaaggggctggagtgggtggccaacataaagcaagatggaagtgagaaatactat180gtggactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgttt240ctgcaaatgaatagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgaaaggggaa300atactacccctccactttgactactggggccagggaaccctggtcactgtctcctca357<210>10<211>357<212>dna<213>智人<400>10gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactc60tcctgtgcagcctctggattcacctttagtagttatagcatgtactgggtccgccaggct120ccagggaaggggctggagtgggtggccgagataaagcaagatggaagtgagcaatactat180gtggactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtat240ctgcaaatgaatagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgaaaggggaa300atactacccctctactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca357<210>11<211>357<212>dna<213>智人<400>11gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactc60tcctgtgcagcctctggattcacctttagtagttatcgcatgtactgggtccgccaggct120ccagggaaggggctggagtgggtggccagcatagaacaagatggaagtgaggaatactat180gtggactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaagtcactgttt240ctgcaaatgaatagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgaaaggggaa300atactacccctctactttgactactggggccagggaaccctggtcactgtctcttca357<210>12<211>357<212>dna<213>智人<400>12caggtccagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtc60tcctgcaaggcttctggataccccttcaccagttatgatatcaattgggtgcgacaggcc120acaggacaaagccttgagtggatgggatggatgaaccctaacagtggtgacacagtctat180gcacagaaattccagggcagagtcaccatgaccaggaatacctccataagcacagcctac240atggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtatttttgtgcgagaggcaga300agggatgactggaagaacaattattggggccagggaaccctggtcactgtctcctca357<210>13<211>357<212>dna<213>智人<400>13caggtccagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtc60tcctgcaaggcttctggataccccttcaccagttatgatatcaattgggtgcgacaggcc120acaggacgaagccttgagtggatgggatggatgaaccctaccaatggtaacacagtctat180gcacagaaattccaggacagagtcaccatgaccaggaatacctccataagcacagcctac240atggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtatttttgtgcgagaggcaga300agggatgactggaagaacaattattggggccagggaaccctggtcactgtctcctca357<210>14<211>73<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>14gccgctggattgttattactcgcggcccagccggccatggcccaggtbcagctggtgcag60tctggggctgagg73<210>15<211>65<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>15gccgctggattgttattactcgcggcccagccggccatggcccagatcaccttgaaggag60tctgg65<210>16<211>71<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>16gccgctggattgttattactcgcggcccagccggccatggccsaggtgcagctggtggag60tctgggggagg71<210>17<211>65<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>17gccgctggattgttattactcgcggcccagccggccatggcccaggtgcagctgcaggag60tcggg65<210>18<211>65<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>18gccgctggattgttattactcgcggcccagccggccatggcccaggtacagctgcagcag60tcagg65<210>19<211>54<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>19ccgtggtgatggtggtgatggctaccgccaccctcgagtgargagacrgtgacc54<210>20<211>71<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>20gccgctggattgttattactcgcggcccagccggccatggccsaggtgcagctggtggag60tctgggggagg71<210>21<211>36<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<220><221>misc_feature<222>18<223>/note="任何碱基"<220><221>misc_feature<222>19<223>/note="c或t"<220><221>misc_feature<222>20<223>/note="c或g或t"<400>21tggcggacccagtacatnnnataactactaaaggtg36<210>22<211>36<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<220><221>misc_feature<222>17<223>/note="a或c或g"<220><221>misc_feature<222>18<223>/note="a或g"<220><221>misc_feature<222>19<223>/note="任何碱基"<400>22cacctttagtagttatnnnatgtactgggtccgcca36<210>23<211>51<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<220><221>misc_feature<222>12<223>/note="c或g或t"<220><221>misc_feature<222>28<223>/note="任何碱基"<220><221>misc_feature<222>30<223>/note="c或t"<220><221>misc_feature<222>34<223>/note="g或c"<220><221>misc_feature<222>35<223>/note="c或t"<220><221>misc_feature<222>36<223>/note="c或t"<400>23cacatagtattnctcacttccatcttgntntatnnnggccacccactccag51<210>24<211>37<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<220><221>misc_feature<222>16<223>/note="a或c或g"<400>24caagatggaagtgagnaatactatgtggactctgtga37<210>25<211>45<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<220><221>misc_feature<222>19<223>/note="a或t"<220><221>misc_feature<222>27<223>/note="g或c"<400>25aggctattcatttgcaganacagtganttcttggcgttgtctctg45<210>26<211>45<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<220><221>misc_feature<222>19<223>/note="g或c"<220><221>misc_feature<222>27<223>/note="a或t"<400>26cagagacaacgccaagaantcactgtntctgcaaatgaatagcct45<210>27<211>36<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>27agtatttcccctttcgcacagtaatacacagccgtg36<210>28<211>67<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<220><221>misc_feature<222>44<223>/note="c或t"<220><221>misc_feature<222>46<223>/note="g或c"<220><221>misc_feature<222>53<223>/note="c或t"<400>28cacggctgtgtattactgtgcgaaaggggaaatactacccctcnantttgacnactgggg60ccaggga67<210>29<211>54<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<220><221>misc_feature<222>42<223>/note="a或g"<220><221>misc_feature<222>48<223>/note="a或g"<400>29ccgtggtgatggtggtgatggctaccgccaccctcgagtgangagacngtgacc54<210>30<211>30<212>prt<213>智人<400>30gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheser202530<210>31<211>5<212>prt<213>智人<400>31sertyrsermettyr15<210>32<211>14<212>prt<213>智人<400>32trpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalala1510<210>33<211>17<212>prt<213>智人<400>33asnilelysglnaspglyserglulystyrtyrvalaspservallys151015gly<210>34<211>32<212>prt<213>智人<400>34argphethrileserargaspasnalalysasnserleupheleugln151015metasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcysalalys202530<210>35<211>10<212>prt<213>智人<400>35glygluileleuproleuhispheasptyr1510<210>36<211>11<212>prt<213>智人<400>36trpglyglnglythrleuvalthrvalserser1510<210>37<211>30<212>prt<213>智人<400>37gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheser202530<210>38<211>5<212>prt<213>智人<400>38sertyrsermettyr15<210>39<211>14<212>prt<213>智人<400>39trpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalala1510<210>40<211>17<212>prt<213>智人<400>40gluilelysglnaspglysergluglntyrtyrvalaspservallys151015gly<210>41<211>32<212>prt<213>智人<400>41argphethrileserargaspasnalalysasnserleutyrleugln151015metasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcysalalys202530<210>42<211>10<212>prt<213>智人<400>42glygluileleuproleutyrpheasptyr1510<210>43<211>11<212>prt<213>智人<400>43trpglyglnglythrleuvalthrvalserser1510<210>44<211>29<212>prt<213>智人<400>44valglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglyglyser151015leuargleusercysalaalaserglyphethrpheser2025<210>45<211>5<212>prt<213>智人<400>45sertyrargmettyr15<210>46<211>14<212>prt<213>智人<400>46trpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalala1510<210>47<211>17<212>prt<213>智人<400>47serilegluglnaspglysergluglutyrtyrvalaspservallys151015gly<210>48<211>32<212>prt<213>智人<400>48argphethrileserargaspasnalalyslysserleupheleugln151015metasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcysalalys202530<210>49<211>10<212>prt<213>智人<400>49glygluileleuproleutyrpheasptyr1510<210>50<211>11<212>prt<213>智人<400>50trpglyglnglythrleuvalthrvalserser1510<210>51<211>30<212>prt<213>智人<400>51glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala151015servallysvalsercyslysalaserglytyrprophethr202530<210>52<211>5<212>prt<213>智人<400>52sertyraspileasn15<210>53<211>14<212>prt<213>智人<400>53trpvalargglnalathrglyglnserleuglutrpmetgly1510<210>54<211>17<212>prt<213>智人<400>54trpmetasnproasnserglyaspthrvaltyralaglnlysphegln151015gly<210>55<211>32<212>prt<213>智人<400>55argvalthrmetthrargasnthrserileserthralatyrmetglu151015leuserserleuargsergluaspthralavaltyrphecysalaarg202530<210>56<211>10<212>prt<213>智人<400>56glyargargaspasptrplysasnasntyr1510<210>57<211>11<212>prt<213>智人<400>57trpglyglnglythrleuvalthrvalserser1510<210>58<211>30<212>prt<213>智人<400>58glnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala151015servallysvalsercyslysalaserglytyrprophethr202530<210>59<211>5<212>prt<213>智人<400>59sertyraspileasn15<210>60<211>14<212>prt<213>智人<400>60trpvalargglnalathrglyargserleuglutrpmetgly1510<210>61<211>17<212>prt<213>智人<400>61trpmetasnprothrasnglyasnthrvaltyralaglnlysphegln151015asp<210>62<211>32<212>prt<213>智人<400>62argvalthrmetthrargasnthrserileserthralatyrmetglu151015leuserserleuargsergluaspthralavaltyrphecysalaarg202530<210>63<211>10<212>prt<213>智人<400>63glyargargaspasptrplysasnasntyr1510<210>64<211>11<212>prt<213>智人<400>64trpglyglnglythrleuvalthrvalserser1510<210>65<211>31<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>65ctcgagggtggcggtagccatcaccaccatc31<210>66<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>66tccatggccatcgccggctgggccgcgag29当前第1页12