一种具有保肝护肝功能的促肝细胞生长素制备方法与流程

本发明涉及一种具有保肝护肝功能的低分子量猪胎肝促肝细胞生长素制备方法，属于功能肽提取加工领域。

背景技术：

目前我国乙肝病毒携带者高达1.2亿，慢性乙型肝炎患者约3000万例，其中10-20％可发展为肝硬化，1-5％可演变为肝癌。我国每年因肝癌死亡的人数约12万，肝炎导致的死亡高达50万。

肝硬化患者常伴有蛋白质-能量营养不良，与患者的预后和肝移植术后并发症密切相关，因此对肝硬化患者进行精准的营养治疗具有重要的临床意义。临床研究表明，哺乳动物肝脏提取物可与其它药物联合治疗重症肝炎、攀发性肝炎，有效减轻患者肝脏损伤，促进重症病人血液中肿瘤坏死因子活性的增加。

促肝细胞生长素(Hepatocyte Growth-promoting Factors，HGF)是从健康哺乳动物的新鲜肝脏中提取的具有生物活性的多肽物质。研究证明，HGF具有刺激DNA合成、肝细胞再生和保护肝脏等功能。作为提取物的主要活性物质，用于各种肝病的营养补充和联合治疗。HGF作为注射剂应用于临床，尽管其在不同物种之间具有高度的同源性，但也偶见过敏反应，同时高分子量蛋白跨膜障碍较大，因此目前临床使用的多为酶解的肽片段。目前报道的具备活性的HGF肽片段的分子量包括40kDa、20kDa、13kDa等说法不一。经过酶解后的低分子量HGF(HPN)片段具有免疫原性低、稳定性高、存储要求低、存储时间长等优点，且不易与其它蛋白质、多糖、氨基酸等物质发生反应，更适合作为肝病营养的功能组件。

技术实现要素：

本发明提供了一种具有保肝护肝功能的低分子量猪胎肝促肝细胞生长素制备方法，采用传统的热变性后酶解方法，结合色谱层析技术，从月龄乳猪新鲜肝脏中分离纯化获得高纯度的分子量分别约为14kDa，8kDa，6kDa的HPN，在细胞水平上的促肝细胞生长的活性表明，8kDa的促肝细胞生长素小肽在1.5μg/mL和15μg/mL下，可有效促进HpG2肝癌细胞的增殖，当浓度达到150μg/mL时，可抑制肝癌细胞的生长。

一种具有保肝护肝功能的低分子量猪胎肝促肝细胞生长素制备方法，将健康乳猪肝筋膜去除，剪碎至1-1.5cm³；以猪胎肝∶生理盐水＝2∶3比例加入0.85％生理盐水，充分破碎、匀浆；将匀浆液于95℃热变性20～60min；高速离心后，收集上清液，测蛋白浓度，加入总蛋白1/40～1/60的胰蛋白酶，37℃水解0.5～2h，离心收集上清液；以10kD超滤膜过滤，收集超滤液，75％终浓度丙酮沉淀，去离子水复溶后Sephadex G-50凝胶柱分离纯化，收集蛋白峰；真空冷冻干燥(3)，获得低分子量猪胎肝促肝细胞生长素。

其中，胰蛋白酶最佳使用比例为1/50，最佳水解时间为1h，洗脱液采用去离子水。

经分离纯化，获得3种低分子量猪胎肝促肝细胞生长素，分子量分别约为14kDa，8kDa，6kDa，在细胞水平上的促肝细胞生长的活性表明，8kDa的促肝细胞生长素小肽活性最佳，对肝细胞生长具有双向调节功能，在1.5μg/mL和15μg/mL下，可有效促进HpG2肝癌细胞的增殖，当浓度达到150μg/mL时，可抑制肝癌细胞的生长。

本发明方案的实施，至少具有以下优势：

根据本发明方法，可有效分离获得高活性的猪胎肝促肝细胞生长素，与目前报道的分子量大小显著不同；该小肽对肝细胞生长具有双向调节功能，低浓度时可促进肝细胞增殖，高浓度是可抑制肿瘤细胞生长，具有保肝护肝功效。

附图说明

图1是分离纯化曲线；

图2是促肝细胞生长素小肽细胞活性实验，*代表具备显著性差异。

具体实施方式

下面将结合具体实施例来进一步对本发明作详细描述，以使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚。以下实施例仅用于举例说明，并不对本发明构成任何限制。

实施例1

将新鲜猪肝200g，以0.85％(v/w)NaCl清洗并去除筋膜，剪碎至约1cm×1cm小块，加入300mL 0.85％(v/w)NaCl，置于高速匀浆机中13，000rpm匀浆3min，收集匀浆液，于-20℃反复冻融3次，融化后95℃水浴变性20min，4，500rpm离心20min，取上清，以BCA法测定蛋白浓度，tricine-SDS-PAGE凝胶分析；随后加入1/50蛋白总量的胰蛋白酶，调pH至8.2，37℃消化60min后，以10kDa的超滤膜(millipore，德国)超滤，收集滤出液，以75％丙酮沉淀，复溶后以Sephadex G-50凝胶柱进行分离，以去离子水为洗脱液，收集并合并洗脱峰，测定蛋白浓度，并进行真空冷冻干燥。获得3个分子量促肝细胞生长素小肽，134mg、22.9mg、16.2mg；蛋白的收率分别为58.2％、9.9％、7.0％；对应分子量分别约为14kDa，8kDa，6kDa。

实施例2

将复苏的HpG2肝癌细胞于含10％FBS的DMEM培养基中，37℃5％CO₂下培养24h，胰酶消化后以含10％FBS的DMEM培养基稀释至10⁴cell/mL，加入96孔细胞培养板，每孔0.1mL，37℃5％CO2培养至细胞完全贴壁，更换以培养基稀释的待检样品(1.5、15和150μg/mL)，37℃5％CO2培养24h，经PBS充分洗涤后，使用MTT细胞增殖与细胞毒性检测试剂盒测定活细胞数(n＝4)。14kDa小肽对HpG2细胞无显著影响，8kDa小肽和6kDa小肽在1.5和15μg/mL时可促进HpG2细胞的生长，其中8kDa小肽的促生长活性高于6kDa小肽，在15μg/mL时8kDa小肽对细胞的促生长作用可达10％(p＜0.05)以上；同时，8kDa小肽和6kDa小肽在150μg/mL时，均可表现出一定的抑制HpG2细胞增殖活性。