本发明涉及抗原物质纯化
技术领域：
，进一步涉及用于疫苗的支原体的纯化技术，具体涉及一种纯化猪肺炎支原体的方法。
背景技术：
：猪支原体性肺炎，是一种由猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)所引起的慢性接触性呼吸道传染病，以气喘为主要症状，又称猪气喘病。该病分布范围广、感染率高、死亡率低，患病猪生长减慢、饲料转化率降低、容易引起他细菌或病毒的继发性或混合性感染，如猪繁殖与呼吸综合征病毒、圆环病毒、肺炎链球菌、副猪嗜血杆菌、猪鼻支原体以及多杀性巴氏杆菌等。疫苗是猪支原体性肺炎防治的重要生物制品，而疫苗的开发过程中又以抗原性能最为关键，从使用效果层面来看，无论灭活抗原还是减毒或抗原都应当具有显著的免疫原性，同时对机体刺激小、不良反应率低，为了获得好的免疫原性，抗原的纯化至关重要。目前应用较广的灭活疫苗是辉瑞公司生产的猪肺炎支原体灭活疫苗瑞倍适，其应用的佐剂Amphigen具有较好的免疫刺激能力。国内使用较多的是由江苏农科院研制的Mhp168株弱毒活疫苗，采用肺内注射方式免疫。猪肺炎支原体的培养和保存难度大，传统的培养冻干方法所用血清或其它蛋白注射后会引起严重引起过敏反应，因此制备高纯度抗原、去除培养基中血清等杂蛋白、优化疫苗生产下游工艺迫在眉睫。现有技术的疫苗制备工艺中，猪肺炎支原体抗原的纯化效果有待提升，一方面其抗原回收率较低，同时还存在着杂蛋白去除不完全的现象，此外，现有技术的相关方法流程繁琐，不易于生产规模的放大。技术实现要素：本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种纯化猪肺炎支原体的方法，以解决现有技术的猪肺炎支原体纯化工艺抗原回收率低的技术问题。本发明要解决的另一技术问题是现有技术的猪肺炎支原体纯化工艺难以充分去除杂质。本发明要解决的再一技术问题是现有技术的猪肺炎支原体纯化工艺处理量有限，不利于生产规模的放大。为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：一种纯化猪肺炎支原体的方法，包括以下步骤：1)取猪肺炎支原体抗原培养液，澄清处理，收集产物即为澄清抗原液；2)将步骤1)得到的澄清抗原液进行超滤浓缩：3)将步骤2)所得产物用缓冲液进行3～7倍体积洗滤后，收集产物。作为优选，步骤1)所述猪肺炎支原体抗原培养液中所含有的抗原是猪肺炎支原体活抗原或灭活的猪肺炎支原体抗原。作为优选，步骤1)所述澄清处理是利用滤膜、膜包或中空纤维超滤膜实现的。作为优选，步骤2)所述超滤浓缩是利用中空纤维膜过滤系统实现的。作为优选，所述中空纤维膜过滤系统中中空纤维柱孔径为300～700KD。作为优选，步骤2)超滤浓缩的倍数是2～5倍体积。作为优选，步骤2)所述超滤浓缩过程中，剪切速率为2000～6000sec-1，更优的，是4000sec-1。作为优选，步骤2)所述超滤浓缩过程中，跨膜压为5～10psi，更优的，是7.5psi。作为优选，步骤3)所述的缓冲液是pH值为7.2～7.4的PBS溶液。作为优选，步骤3)所述洗滤是等体积洗滤。作为优选，步骤2)所述的超滤浓缩、步骤3)所述洗滤过程均为收集回流液、弃去透过液。在以上技术方案中，步骤2)所述的超滤浓缩可以对抗原液进行2～20倍、甚至更大体积的浓缩。本发明提供了一种纯化猪肺炎支原体的方法，该技术方案以抗原培养液直接作为原料，先后经澄清处理、超滤浓缩、洗滤三步处理即告完成，在此基础上基于实验手段设计了所采用的工艺装置，利用中空纤维膜剪切力低、容尘量高的特点，并优化了操作条件，通过跨膜压、剪切速率的限定保证了抗原自身稳定，并确保了杂质去除率。应用本方法纯化猪肺炎支原体抗原，不进行浓缩的情况下，抗原回收率达到87.8％以上，抗原液中猪血清去除60.7％；5倍浓缩后杂蛋白去除率达98％，抗原回收率62％，猪血清含量与原抗原液相比降低90.3％。同时，由于本方法处理量大、处理速度快、操作简单、工艺稳定，因此可以实现自动化或半自动化生产。应用本方法纯化的猪肺炎支原体抗原制备的疫苗，对于降低猪肺炎支原体疫苗产品副反应、提升产品质量具有重要意义。具体实施方式以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例1猪肺炎支原体抗原的制备按发酵罐体积70％加入猪肺炎支原体液体培养基，121℃灭菌20min，待培养基自然冷却到37℃时，加入20％猪血清，搅拌均匀；按培养基总量的10％接入生产用猪肺炎支原体种子液，37℃搅拌培养3～7日，待PH值由7.5下降至6.8时收获菌液。实施例2猪肺炎支原体抗原的纯化收获的猪肺炎支原体抗原液应用3～6um滤膜澄清；应用300KD的中空纤维系统对澄清的抗原液进行纯化，剪切力控制在4000s-1，跨膜压TMP控制在5～10psi，将抗原液浓缩至原体积的1/2，弃透过液，保留截留液；用无菌PBS(PH7.2)将上述抗原浓缩液稀释至原体积，剪切力控制在4000s-1，跨膜压TMP控制在5～10psi，将抗原液浓缩至原体积，弃透过液，保留截留液；用无菌PBS(PH7.2)将上述抗原浓缩液稀释至原体积，剪切力控制在4000s-1，跨膜压TMP控制在5～10psi，将抗原液浓缩至原体积，弃透过液，保留截留液；用无菌PBS(PH7.2)将上述抗原浓缩液稀释至原体积，收获的截留液即为纯化的猪肺炎支原体抗原。以下通过BCA法测定纯化前后总蛋白含量，并以此计算蛋白去除率，实验结果如表1所示。通过双抗体夹心Elisa法测定纯化前后抗原回收率，实验结果如表2所示。通过猪血清白蛋白残留试剂盒测定纯化前后猪血清残余量，实验结果如表3所示。表1以BCA法检测的纯化前后总蛋白含量及相对应的蛋白去除率纯化前(mg/ml)纯化后(mg/ml)蛋白去除率16.413.915.2％表2以双抗体夹心Elisa法检测的纯化前后抗原回收率表3以猪血清白蛋白残留试剂盒检测的纯化前后猪血清残余量样品名称浓度ug/ml体积ml质量mg猪血清去除率纯化前315.920063.18-纯化后132.820026.5658％实施例3猪肺炎支原体灭活抗原的纯化收获得猪肺炎支原体抗原液按终浓度0.2％加入甲醛，37℃灭活24h；将灭活的猪肺炎支原体抗原液用3～6um滤膜澄清；应用300KD的中空纤维系统对澄清的抗原液进行纯化，剪切力控制在4000s-1，跨膜压TMP控制在5～10psi，将抗原液浓缩至原体积的1/2，弃透过液，保留截留液；用无菌PBS(PH7.2)将上述抗原浓缩液稀释至原体积，剪切力控制在4000s-1，跨膜压TMP控制在5～10psi，将抗原液浓缩至原体积，弃透过液，保留截留液；用无菌PBS(PH7.2)将上述抗原浓缩液稀释至原体积，剪切力控制在4000s-1，跨膜压TMP控制在5～10psi，将抗原液浓缩至原体积，弃透过液，保留截留液；用无菌PBS(PH7.2)将上述抗原浓缩液稀释至原体积，收获的截留液即为纯化的猪肺炎支原体抗原。以下通过BCA法测定纯化前后总蛋白含量，并以此计算蛋白去除率，实验结果如表4所示。通过双抗体夹心Elisa法测定纯化前后抗原回收率，实验结果如表5所示。通过猪血清白蛋白残留试剂盒测定纯化前后猪血清残余量，实验结果如表6所示。表4以BCA法检测的纯化前后总蛋白含量及相对应的蛋白去除率纯化前(mg/ml)纯化后(mg/ml)蛋白去除率16.414.213.4％表5以双抗体夹心Elisa法检测的纯化前后抗原回收率表6以猪血清白蛋白残留试剂盒检测的纯化前后猪血清残余量样品名称浓度ug/ml体积ml质量mg猪血清去除率纯化前315.920063.18-纯化后124.120024.8260.7％实施例4猪肺炎支原体灭活抗原的浓缩收获的猪肺炎支原体抗原液应用3～6um滤膜澄清；应用300KD的中空纤维系统对澄清的抗原液进行浓缩纯化，剪切力控制在4000s-1，跨膜压TMP控制在5～10psi，将抗原液浓缩至原体积的1/5，弃透过液，保留截留液；用无菌PBS(PH7.2)将上述抗原浓缩液两倍稀释，剪切力控制在4000s-1，跨膜压TMP控制在5～10psi，将抗原液浓缩至原体积，弃透过液，保留截留液；用无菌PBS(PH7.2)将上述抗原浓缩液两倍稀释，剪切力控制在4000s-1，跨膜压TMP控制在5～10psi，将抗原液浓缩至原体积，弃透过液，保留截留液；用无菌PBS(PH7.2)将上述抗原浓缩液两倍稀释，剪切力控制在4000s-1，跨膜压TMP控制在5～10psi，将抗原液浓缩至原体积，弃透过液，收获截留液即为纯化浓缩的猪肺炎支原体灭活抗原。以下通过BCA法测定纯化前后总蛋白含量，并以此计算蛋白去除率，实验结果如表7所示。通过双抗体夹心Elisa法测定纯化前后抗原回收率，实验结果如表8所示。通过猪血清白蛋白残留试剂盒测定纯化前后猪血清残余量，实验结果如表9所示。表7以BCA法检测的纯化前后总蛋白含量及相对应的蛋白去除率表8以双抗体夹心Elisa法检测的纯化前后抗原回收率表9以猪血清白蛋白残留试剂盒检测的纯化前后猪血清残余量样品名称浓度ug/ml体积ml质量mg猪血清去除率原液315.920063.18-浓缩后152.5406.190.3％实施例5纯化前后效力检验体重1.5～2.0kg健康家兔(猪肺炎支原体血清抗体IHA效价不高于1:5)15只，其中5只各后腿肌肉注射实施例4纯化前灭活抗原0.5ml，5只后腿肌肉注射实施例4纯化后灭活抗原0.5ml，注射后14日，相同途径、相同剂量二免。剩余5只不接种作为对照。二免后30日，连同对照组采血，用IHA法检测家兔血清猪肺炎支原体抗体效价。效力检测结果如表10所示：表10猪肺炎支原体抗原纯化前、后对免疫接种后抗体效价的影响实施例6一种纯化猪肺炎支原体的方法，包括以下步骤：1)取猪肺炎支原体抗原培养液，澄清处理，收集产物即为澄清抗原液；2)将步骤1)得到的澄清抗原液进行超滤浓缩：3)将步骤2)所得产物用缓冲液进行3倍体积洗滤后，收集产物。在以上技术方案的基础上，满足以下条件：步骤1)所述猪肺炎支原体抗原培养液中所含有的抗原是猪肺炎支原体活抗原或灭活的猪肺炎支原体抗原。步骤1)所述澄清处理是利用滤膜、膜包或中空纤维超滤膜实现的。步骤2)所述超滤浓缩是利用中空纤维膜过滤系统实现的。所述中空纤维膜过滤系统中中空纤维柱孔径为300KD。步骤2)超滤浓缩的倍数是2倍体积。步骤2)所述超滤浓缩过程中，剪切速率为2000sec-1。步骤2)所述超滤浓缩过程中，跨膜压为5psi。步骤3)所述的缓冲液是pH值为7.2的PBS溶液。步骤3)所述洗滤是等体积洗滤。实施例7一种纯化猪肺炎支原体的方法，包括以下步骤：1)取猪肺炎支原体抗原培养液，澄清处理，收集产物即为澄清抗原液；2)将步骤1)得到的澄清抗原液进行超滤浓缩：3)将步骤2)所得产物用缓冲液进行7倍体积洗滤后，收集产物。在以上技术方案的基础上，满足以下条件：所述中空纤维膜过滤系统中中空纤维柱孔径为700KD。步骤2)超滤浓缩的倍数是5倍体积。步骤2)所述超滤浓缩过程中，剪切速率为6000sec-1。步骤2)所述超滤浓缩过程中，跨膜压为10psi。步骤3)所述的缓冲液是pH值为7.4的PBS溶液。实施例7一种纯化猪肺炎支原体的方法，包括以下步骤：1)取猪肺炎支原体抗原培养液，澄清处理，收集产物即为澄清抗原液；2)将步骤1)得到的澄清抗原液进行超滤浓缩：3)将步骤2)所得产物用缓冲液进行5倍体积洗滤后，收集产物。以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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