一种红豆杉细胞长期培养生产紫杉烷的调控方法与流程

本发明属于生物制药中的植物细胞培养生产技术，具体涉及一种红豆杉细胞长期培养稳定生产紫杉烷的继代与调控方法。

背景技术：

红豆杉人工种植，周期长，产量低；在红豆杉植物细胞培养方面，由于次级代谢产物的对自身的毒性，细胞株长期继代过程中不稳定，次级代谢产物产量越来越低，大规模商业化生产面临极大困难。目前红豆杉植物细胞培养生产紫杉烷的传统工艺是两阶段法。第一个阶段是无调控剂下，细胞在生长培养基下较快速的放大生长，主要目的是获得大量可用的植物细胞团生物量。第二个阶段是取一部分植物细胞团，以高接种量放入生产培养基中，在调控剂刺激下，生物合成次级代谢产物，比如表达各种紫杉烷，但同时这批细胞也走向死亡。两阶段培养法在植物细胞长期继代过程中发挥了重大作用，尤其是继代代次的前期和中期，但继代次数超过50代后，植物细胞越来越适应生长培养基，生长越来越快，比生长率越来越高，倍增越来越大，而同时对调控剂的响应却越来越低，而且对调控剂响应低或者敏感而凋亡。

两阶段调控工艺只能解决植物细胞长期继代中的前中期产能问题，考虑到规模培养的植物细胞都是高代次的，都是位于长期继代中的后期，我们需要一种继代和调控方法，应付长期继代的植物细胞产能下降的问题。

技术实现要素：

本发明采取了并发调控的策略，在传统的生长阶段也引入一定较低程度的弱调控方式，保持植物细胞系的生产能力，但也不影响比生长率的维持。在调控生产阶段，加入的是中强度调控策略，从而更稳定而高产的表达紫杉烷。与现有方案所不同的关键点在于：

在植物细胞继代阶段，加入弱调控剂，维持次级代谢基因的低水平表达；而在终端的调控生产阶段，使用中强度的调控剂，在生长的初级代谢与次级代谢中达到了相对平衡，提高了生产系统的长期稳定性。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术方案：

（1）在红豆杉细胞液体悬浮培养50代之后，第一阶段采用加广泛性弱调控剂硝酸银水溶液，使用浓度为1-40 mM（毫摩尔每升）的弱调控方式继代，第二阶段采用强调控剂中强度调控方式进行紫杉醇及紫杉烷的生产；

（2）第二阶段所述的强调控剂指的是：冠菌素、甲基茉莉酸一种或两种的混合物；

当使用冠菌素水溶液时浓度为10-2000 nM（纳摩尔每升），冠菌素水溶液加入的天数是1到8天；当使用甲基茉莉酸乙醇溶液式浓度为10-200 mM，甲基茉莉酸乙醇溶液加入的天数是1到8天；当联合使用冠菌素与甲基茉莉酸，其摩尔份数比为1:5000到1:10000。

本发明所述的调控方法，其中的红豆杉细胞系为南方红豆杉细胞，经过50次的液体悬浮继代；接种的培养基为B5类型植物基础培养基，其配方：蔗糖起始浓度为20-35g/L ，选优为25g/L；含6-BA为1-10mg/L，优选为2mg/L，含NAA为1到10mg/L ，优选为4mg/L；接种量为100目筛网上的15-30g鲜活细胞，优选为20g鲜活细胞；培养避光，振荡培养，2cm旋距，100rpm。培养周期为14天；所述的鲜活细胞指的是：红豆杉液体悬浮培养的湿活细胞团。

本发明第一阶段采用加广泛性调控剂硝酸银水溶液，优选使用浓度为5-20mM ，特别优选为10mM。第二阶段采用调控剂冠菌素水溶液，优选使用浓度为100-1000 nM，特别优选为500 nM，冠菌素加入的天数优选2到6天，特别优选为第4天；调控剂甲基茉莉酸类乙醇溶液，使用浓度优选为100-100mM，特别优选为50mM。甲基茉莉酸加入的天数优选是2到6天，特别优选为第4天。强调控剂的使用有三种情况：单独使用冠菌素，单独使用甲基茉莉酸，联合使用这两者。原因是目前冠菌素太贵，虽然效果好，但考虑到经济原因，所以可以选择联合使用。

本发明公开的第二阶段采用的培养基是MS基础盐，加入蔗糖起始浓度为35-70g/L，优选是50g/L；含6-BA为1mg/L，2,4-D为0.5mg/L。接种量是20-100g/L，优选是30-60g新鲜细胞/L（新鲜细胞指的是红豆杉液体悬浮培养的湿活细胞团）。

本发明进一步公开了采用红豆杉细胞长期培养生产紫杉烷的调控方法在提高紫杉醇、紫杉烷中间体10DAB和BAT III产量方面的应用。试验结果显示（具体见实施例）：

常规的两阶段（无调控-强调控）技术路线，紫杉醇的产量为54到0mg/L，10DAB 和 BAT III的产量未检出（小于3mg/L），细胞容易褐化死亡。采用本发明的方法（弱调控-中调控）后，紫杉醇产量为30-100mg/L，同时紫杉烷中间体10DAB和BAT III的产量为30-200mg/L，生产体系比较稳定。

本发明公开的红豆杉细胞长期培养生产紫杉烷的调控方法与现有技术相比其关键点在于：

（1）红豆杉植物细胞长期继代的第50代之后，若还采用强调控生产方式，紫杉醇产量会跌落到0-50mg/L，其他紫杉醇中间体产量接近0；若还采用弱强度继代方式与中强度调控生产方式，紫杉醇产量升到30-100mg/L，同时紫杉烷中间体10DAB和BAT III的产量为30-200mg/L。

（2）在继代阶段也加入弱调控剂，而生产阶段却降为中强度调控剂，如此长期培养中植物细胞培养达到了两个阶段的和谐衔接，最终获得了高产和稳产的兼顾。

附图说明

图1为传统不平衡两阶段（无调控-强调控）技术路线；

图2为本专利相对平衡（弱调控-中调控）技术路线。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。红豆杉植物细胞见专利CN201410726199.6，使用的是一种具有高产紫杉醇特性的红豆杉细胞株（Taxus wallichiana var. mairei），命名为：南方红豆杉植物细胞系NO51-3，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.10002。 实施例1

红豆杉植物细胞新线在摇瓶初期阶段的无调控继代方式一：

红豆杉细胞南方红豆杉固体O38-2-2线转为悬浮第25代摇瓶线悬浮培养物，编号为81#线的种子线，使用500mL容量的摇瓶，装液量为100mL新鲜的B5培养基，蔗糖起始浓度为15g/L，含6-BA为1mg/L，2,4-D为0.5mg/L，接种量为100目筛网上的10g鲜活细胞，避光，振荡培养，2cm旋距，100rpm。培养14天后，进行继代，鲜活细胞倍增比例为2.68。

实施例2

红豆杉植物细胞在摇瓶中期阶段的无调控继代方式二：

红豆杉细胞南方红豆杉固体O38-2-2线转为悬浮第48代摇瓶线悬浮培养物，编号为81#线的种子线，采用实施例1的培养方式。在培养14天后，进行继代，鲜活细胞倍增比例增加到2.92。

实施例3

红豆杉植物细胞在摇瓶后长期阶段的弱调控继代方式三：

红豆杉细胞南方红豆杉固体O38-2-2线转为悬浮第85代摇瓶线悬浮培养物，编号为81#线的种子线。使用500mL容量的摇瓶，装液量为100mL新鲜的B5培养基，蔗糖起始浓度为20g/L，含6-BA为1.5 mg/L，接种量为100目筛网上的16g鲜活细胞，避光，振荡培养，2cm旋距，100rpm。在继代第2-7天，加入使用浓度为10 mMol/L的硝酸银水溶液。培养14天后，进行继代，鲜活细胞倍增比例为2.95。

实施例4

红豆杉植物细胞在摇瓶中期阶段的强调控生产方式：

红豆杉细胞南方红豆杉固体O38-2-2线转为悬浮第56代摇瓶线悬浮培养物，编号为81#线的种子线，使用100mL容量的摇瓶，装液量为20mL新鲜的MS培养基，蔗糖起始浓度为45g/L，含6-BA为1mg/L，2,4-D为0.5mg/L，接种量为100目筛网上的6g鲜活细胞，避光，振荡培养，2cm旋距，100rpm；在接种第2天加入使用浓度为100 mMol/L的甲基茉莉酸的乙醇溶液，在接种第7天加入使用浓度为10m Mol/L的硝酸银水溶液，在第28天进行收获。经过HPLC的紫杉烷定量分析，紫杉醇的产量为54至0mg/L，10DAB 和 BAT III的产量未检出（小于3mg/L）。

实施例5

红豆杉植物细胞在摇瓶中长期阶段的中调控生产方式一：

红豆杉细胞南方红豆杉固体O38-2-2线转为悬浮第80-90代摇瓶线悬浮培养物，编号为81#线的种子线。红豆杉植物细胞的中调控生产方式与强调控生产方式类似，但蔗糖起始浓度为45 g/L，接种量为9g，在接种第5天加入使用浓度为50 mMol/L的甲基茉莉酸的乙醇溶液。经过21天到35天的培养，收获后进行HPLC的紫杉烷定量分析，紫杉醇产量为42.2 mg/L，同时紫杉烷中间体10DAB和BAT III的产量为分别为92.6和100.2mg/L，还存在其他紫杉烷，如C14位修饰的云南紫杉烷Tc。

实施例6

红豆杉植物细胞在摇瓶中长期阶段的中调控生产方式二：

红豆杉细胞种子与实施例5相同的种子，第91代种子。在接种第7天加入使500 nMol/L的冠菌素水溶液。第28天，紫杉醇产量为66.4mg/L，同时紫杉烷中间体10DAB和BAT III的产量为分别为108.2和71.2 mg/L，其他紫杉烷产量很少。

实施例7

红豆杉植物细胞在摇瓶中长期阶段的的中调控生产方式三：

红豆杉细胞种子与实施例5相同的种子和相同的代次阶段。但在接种第5天联合使用50 mMol/L的甲基茉莉酸的乙醇溶液，10 nMol/L的冠菌素，第28天，紫杉醇产量为46.7mg/L，同时紫杉烷中间体10DAB和BAT III的产量为分别为95.7和81.8 mg/L，其他紫杉烷产量很少。

实施例8

红豆杉植物细胞在摇瓶中长期阶段的的中调控生产方式四：

红豆杉细胞种子与实施例5相同的种子和相同的代次阶段。但在接种第5天联合使用10 mMol/L的甲基茉莉酸的乙醇溶液，第28天，紫杉醇产量为5.1mg/L，其他紫杉烷产量很少。

实施例9

红豆杉植物细胞在摇瓶中长期阶段的的中调控生产方式五：

红豆杉细胞种子与实施例5相同的种子和相同的代次阶段。但在接种第7天联合使用200 mMol/L的甲基茉莉酸的乙醇溶液，第21到28天，紫杉醇及其他紫杉烷产量很少，小于3 mg/L。

实施例10

红豆杉植物细胞在摇瓶中长期阶段的的中调控生产方式六：

红豆杉细胞种子与实施例5相同的种子和相同的代次阶段。但在接种第6天联合使用10 nMol/L的冠菌素水溶液，第28天，紫杉醇产量为32.1mg/L，同时紫杉烷中间体10DAB和BAT III的产量为分别为65.7和59.7 mg/L，其他紫杉烷产量很少。

实施例11

红豆杉植物细胞在摇瓶中长期阶段的的中调控生产方式七：

红豆杉细胞种子与实施例5相同的种子和相同的代次阶段。但在接种第6天联合使用2000 nMol/L的冠菌素水溶液，第28天，紫杉醇产量为72.1mg/L，同时紫杉烷中间体10DAB和BAT III的产量为分别为115.5和125.2 mg/L，其他紫杉烷产量很少。

实施例12

红豆杉植物细胞在5L反应器培养阶段的中调控生产方式八：

红豆杉细胞南方红豆杉固体O38-2-2线转为悬浮第88代摇瓶线悬浮培养物，编号为81#线的种子线。在接种到5L 反应器内后，进行14天的弱调控继代方式继代到新的5L 反应器中，继代3次后进行调控生产，此阶段，5L反应器提高接种量达30 g/L，在接种第7天，联合使用浓度为50m Mol/L的甲基茉莉酸的乙醇溶液和使用浓度为10 nMol/L（纳摩尔每升）的冠菌素水溶液。在接种第28天收获。进行HPLC的紫杉烷定量分析，紫杉醇产量为54.4 mg/L，同时紫杉烷中间体10DAB和BAT III的产量100.1和153.9mg/L。