本发明属于干细胞领域，涉及一种从乳腺癌细胞株中富集乳腺癌干细胞的试剂、试剂盒。
背景技术：
肿瘤干细胞研究是从干细胞研究中脱颖而出的一个新领域，虽起步晚，但发展势头迅猛，呈现出良好前景。肿瘤干细胞的存在及其作为肿瘤形成、生长和转移基础的观点已得到广泛认同。基本理论为：在肿瘤细胞中有一小部分能够产生新的肿瘤细胞并且能自我复制的细胞，称为肿瘤干细胞。与普通肿瘤细胞不同，肿瘤干细胞对所有的化疗药物都耐药，并在化疗结束后，用类似干细胞的特性分化出新的肿瘤细胞，因此，肿瘤干细胞是肿瘤复发的根源[Cancer stem cells in solid tumors.Curr Opin Biotechnol,2007；18:460-6]。当前肿瘤治疗尤其是化疗的目的是尽可能杀死所有肿瘤细胞，如果肿瘤体积缩小则认为治疗方案有效。但实际上大部分肿瘤经过一段时间缓解期后又复发。这是因为这种传统的治疗方法并没有将肿瘤干细胞完全杀死，肿瘤干细胞仍具有无限增殖能力。因此虽然目前临床上没有针对肿瘤干细胞的药物，但是发现有选择性的杀灭肿瘤干细胞的药物是将来的重要研究方向。越来越多的学者提出肿瘤治疗应该针对肿瘤干细胞，只有研究出能杀灭肿瘤干细胞的药物才能从根源上治愈肿瘤。乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤。流行病学显示，乳腺癌的患病率呈上升趋势，已成为严重影响妇女身心健康甚至危及生命的常见病与多发病，近年来已经超过宫颈癌成为女性发病率最高的恶性肿瘤，是女性健康第一杀手。根据肿瘤干细胞研究显示，研究出能杀灭乳腺癌干细胞的药物才能从根源上治愈乳腺癌。而这些研究的前提是高效富集到乳腺癌干细胞。
但是，肿瘤干细胞在全部肿瘤细胞中占比极低，极难获得数量充足的肿瘤干细胞以进行深入研究。因此，从肿瘤细胞中高效富集肿瘤干细胞是肿瘤干细胞研究首先要解决的难题。
目前富集乳腺癌干细胞等肿瘤干细胞的方法主要有三种：流式细胞分选法、免疫磁珠筛选法和体外无血清悬浮球培养法。其中，流式细胞分选法、免疫磁珠筛选法对设备要求较高、操作复杂且容易损伤细胞，使用者较少。体外无血清悬浮球培养法是目前较为受研究者青睐的方法，其原理是基于肿瘤干细胞具有干细胞的特性，而干细胞在添加生长因子的无血清培养基中仍然具备强大的自我更新和保持未分化状态的能力，并形成“悬浮球”。体外无血清悬浮球培养法富集肿瘤干细胞的研究较多，比如：张波等采用体外无血清悬浮球培养法从PC-3人前列腺癌细胞中分离并富集前列腺癌干细胞[从PC-3细胞中富集前列腺癌干细胞的实验研究，江苏医药2012年9月第38卷第17期]；郭开峰等采用体外无血清悬浮球培养法从结肠癌细胞株CW-2分离结肠癌干细胞[无血清悬浮培养法富集结肠癌干细胞，四川解剖学杂志2012年6月第20卷第2期]；廉芳等采用体外无血清悬浮球培养法从乳腺癌MDA-MB-435细胞筛选和培养乳腺癌干细胞[无血清培养富集乳腺癌干细胞的初步研究，贵阳医学院学报2014年2月第39卷第1期]；尹燕雪等采用体外无血清悬浮球培养法从人乳腺癌MCF-7细胞株富集乳腺癌干细胞[无血清培养有效富集乳腺癌干细胞，临床与实验病理学杂志2015年9月第31卷第9期]。
但是，体外无血清悬浮球培养法效率较低：(1)悬浮细胞球形成效率低下；(2)悬浮球细胞中CD44+CD24-/low细胞比例、SP细胞比例较低。CD44+CD24-/low是区分细胞成瘤能力的很好的分子标记，动物实验证明CD44+CD24-/low分子标记的肿瘤细胞少量即可成瘤，表现出了其具有自我更新和分化能力的干细胞属性[Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.Proc NatlAcad Sci.2003Apr 1；100(7):3983-8]。侧亚群SP细胞用于肿瘤干细胞的筛选，从乳腺癌细胞系MCF-7中分选的侧亚群细胞较非侧亚群细胞具有更高的致瘤性[Side population is enriched in tumorigenic,stem-like cancer cells,whereas ABCG2+and ABCG2-cancer cells are similarly tumorigenic.Cancer Res.2005Jul 15；65(14):6207-19]。以安徽医科大学孙鑫等人的研究为例[人乳腺癌MCF-7细胞系中肿瘤干细胞的富集与鉴定，安徽医科大学学报2012年10月第47卷第10期]：研究者采用无血清悬浮球培养法体外培养人乳腺癌MCF-7细胞，悬浮培养第5天可以开始观察到悬浮细胞球形成，细胞球形成效率为(0.6±0.5)％，第10天时细胞球形成效率为(2.4±1.2)％，比第5天时明显增多，培养第15天时细胞球形成效率达到(3.8±1.8)％，MCF-7悬浮成球细胞中侧群细胞SP细胞含量为(3.9±1.4)％，高于常规培养的MCF-7贴壁细胞(1.1±0.5)％；培养第15天时细胞球形成效率都不足4％。再以朱敬之等人的研究为例[乳腺癌干细胞的有效富集，中华临床医师杂志2011年5月第5卷第10期]：培养第7天的MCF-7微球体细胞中CD44+CD24-/low分子标记的肿瘤细胞比例仅8.10％。
现有技术对体外无血清悬浮球培养法的两种延伸：
1、无血清培养+化疗药物双重筛选富集乳腺癌干细胞。陈炬莹等人发现无血清培养+化疗药物双重筛选比常规无血清培养提前2天出现悬浮细胞球；但该双重筛选方法并未明显提高细胞球中CD44+CD24-/low分子标记的肿瘤细胞的含量(仅仅2.07％)。具体参见陈炬莹等人的研究[乳腺癌干细胞富集方法的初步研究，福建医药杂志2015年4月第37卷第2期]。
2、以化疗药物处理并通过荷瘤小鼠模型体内传代的方法富集乳腺癌干细胞样细胞。王欣荣等人[5-FU对小鼠乳腺癌4T1细胞株中肿瘤干细胞样细胞的富集作用，中国肿瘤生物治疗杂志2012年10月第19卷第5期]以乳腺癌细胞株4T1皮下接种小鼠制备荷瘤模型，以一定剂量5-FU腹腔注射4周；处死小鼠后取肿瘤组织制成细胞悬液，并接种小鼠制备下一代小鼠荷瘤模型，5-FU处理及再次传代方法同上，共传4代；对照组小鼠给予生理盐水注射，其余处理同模型组；流式细胞术检测各代肿瘤组织中CD44+CD24-/low细胞比例，Hoechast33342染色法检测SP细胞的比例，倒置显微镜观察乳腺癌细胞微球体的形成；结果：各代对照组小鼠模型肿瘤组织中CD44+CD24-/low细胞比例为11.5％，SP细胞比例为9.7％，乳腺癌细胞微球体比例为0.5％；5-FU处理组第4代小鼠模型肿瘤组织中CD44+CD24-/low细胞比例为69.0％，SP细胞比例为61.3％，乳腺癌细胞微球体比例为6.1％。该方法对乳腺癌干细胞的富集效率虽然很高，但是小鼠模型体内传代的方法成本高、周期长。
技术实现要素：
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种从乳腺癌细胞株中富集乳腺癌干细胞的试剂并将其开发成试剂盒，用于便捷、高效地为科研工作者富集乳腺癌干细胞，为乳腺癌药物的开发奠定乳腺癌干细胞原料基础。
技术方案公布如下：
一种从乳腺癌细胞株中富集乳腺癌干细胞的试剂，包括筛选剂加兰他敏和石蒜碱；所述乳腺癌细胞株为MCF-7乳腺癌细胞株。
进一步地，试剂中所述筛选剂中加兰他敏和石蒜碱的摩尔比为1:2-2:1。
进一步地，试剂还包括抗氧化剂亚硫酸盐，优选亚硫酸钠。
进一步地，上述试剂具体为一种无血清培养基，包括DMEM/F12培养液、常规生长因子、筛选剂加兰他敏和石蒜碱、抗氧化剂亚硫酸钠。
进一步地，所述常规生长因子包括重组人表皮生长因子EGF、牛血清白蛋白BSA、胰岛素和B27；所述重组人表皮生长因子EGF浓度为15-25g/L；所述牛血清白蛋白BSA浓度为3-5g/L；所述胰岛素浓度为4-6mg/L；所述B27浓度为1.5-2.5％。
进一步地，所述筛选剂加兰他敏和石蒜碱浓度共150nmol/L，二者摩尔比为1:2-2:1。
进一步地，所述抗氧化剂亚硫酸钠的浓度为40-60μg/L。
一种从乳腺癌细胞株中富集乳腺癌干细胞的试剂盒，与DMEM/F12培养液混合使用，包括双抗、筛选剂加兰他敏和石蒜碱、筛选剂溶解助剂、抗氧化剂亚硫酸钠、常规生长因子重组人表皮生长因子EGF、牛血清白蛋白BSA、胰岛素和B27。
进一步地，所述双抗为青霉素和链霉素。
进一步地，所述筛选剂溶解助剂为DMSO。
发明效果：
本发明提供的试剂能有效从人乳腺癌MCF-7细胞系中便捷、高效地富集得到乳腺癌干细胞，细胞球形成周期短、微球体细胞中CD44+CD24-/low分子标记的肿瘤细胞和SP细胞含量高，可以开发成试剂盒提高科研工作者富集乳腺癌干细胞的效率。
具体实施方式
下面结合具体实施例介绍本发明的技术方案。下述实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，无特别要求，都是本领域技术人员容易获得的常规材料。
实施例1：从人乳腺癌MCF-7细胞系中富集乳腺癌干细胞
1、实验材料
常规含血清培养基：DMEM/F12培养液中加入10％的胎牛血清FBS和双抗，1L培养基加入10ml青霉素-链霉素溶液(100×双抗，北京雷根生物技术有限公司)。
常规无血清培养基：DMEM/F12培养液中加入双抗(浓度同上)、重组人表皮生长因子EGF 20g/L、牛血清白蛋白BSA4g/L、胰岛素5mg/L、B272％(1L培养基加20ml 50X B27)。
改进含血清培养基：DMEM/F12培养液中加入10％的胎牛血清FBS和双抗(浓度同上)、加兰他敏和石蒜碱共150nmol/L，二者摩尔比为1:1。
改进无血清培养基：DMEM/F12培养液中加入双抗(浓度同上)、重组人表皮生长因子EGF 20g/L、牛血清白蛋白BSA4g/L、胰岛素5mg/L、B272％(1L培养基加20ml 50X B27)、加兰他敏和石蒜碱共150nmol/L，二者摩尔比为1:1。
2、实验方法
(1)贴壁培养MCF-7细胞系
常规培养法：MCF-7细胞系在常规含血清培养液中于37℃、5％CO2的细胞培养箱内培养，贴壁后当细胞增殖至85％左右时，处于对数生长期，用0.25％胰蛋白酶-EDTA消化、离心、重悬后传代。
改进培养法：MCF-7细胞系在改进含血清培养液中于37℃、5％CO2的细胞培养箱内培养，贴壁后当细胞增殖至85％左右时，处于对数生长期，用0.25％胰蛋白酶-EDTA消化、离心、重悬后传代。
(2)微球体培养
常规培养法：取常规培养法下第2代处于对数生长期的MCF-7细胞用常规无血清培养基重悬细胞以2×104/mL接种至塑料培养瓶中于37℃、5％CO2的细胞培养箱内培养每2-3天更换1次培养液，第3、5、7天计数其中的微球体数目、大小，并计算微球体形成效率。其中，微球体形成效率＝微球体数目/接种细胞数×100％。定义≥60μm的球体为微球体。把25cm2的培养瓶底面分割成25个等面积的小格，随机选取15个小格，计数≥60μm的微球体的数量。
改进培养法：取改进培养法下第2代处于对数生长期的MCF-7细胞用改进无血清培养基重悬细胞以2×104/mL接种至塑料培养瓶中于37℃、5％CO2的细胞培养箱内培养每2-3天更换1次培养液，第3、5、7天计数其中的微球体数目、大小，并计算微球体形成效率。其中，微球体形成效率＝微球体数目/接种细胞数×100％。定义≥60μm的球体为微球体。把25cm2的培养瓶底面分割成25个等面积的小格，随机选取15个小格，计数≥60μm的微球体的数量。
(3)单细胞悬液的制备
常规培养法第7天微球体单细胞悬液的制备：配制0.05％trypsin-0.53mmol/L EDTA-4Na的干细胞消化液；消化微球体并吹打；镜下见大多数单细胞形成时终止消化，1500r/min离心6min，吸弃上清；加入无血清的DMEM-F122ml培养液重悬；加入4℃含2.5％胎牛血清的PBS 2ml重悬，过40μmol/L的细胞筛网，即获得单细胞悬液；细胞计数。
改进培养法第3天微球体单细胞悬液的制备：配制0.05％trypsin-0.53mmol/L EDTA-4Na的干细胞消化液；消化微球体并吹打；镜下见大多数单细胞形成时终止消化，1500r/min离心6min，吸弃上清；加入无血清的DMEM-F122ml培养液重悬；加入4℃含2.5％胎牛血清的PBS 2ml重悬，过40μmol/L的细胞筛网，即获得单细胞悬液；细胞计数。
(4)流式细胞仪检测干细胞表型CD44+CD24-/low细胞比例
常规培养法第7天微球体细胞中CD44+CD24-/low细胞比例测定：取上述单细胞悬液设实验管和对照管，每管调整浓度为3×105/mL单细胞悬液；荧光抗体标记固定：实验管中加入CD24-PE 20μL和CD44-FITC 0.5μL，加入200μL 1％多聚甲醛固定，对照管中不加荧光抗体，直接加入200μL 1％多聚甲醛固定；流式分析：以标准程序检测，一般计数2-3万个细胞，用对检测结果分析，检测细胞系中CD44+CD24-/low细胞比例。
改进培养法第3天微球体细胞中CD44+CD24-/low细胞比例测定：取上述单细胞悬液设实验管和对照管，每管调整浓度为3×105/mL单细胞悬液；荧光抗体标记固定：实验管中加入CD24-PE 20μL和CD44-FITC 0.5μL，加入200μL 1％多聚甲醛固定，对照管中不加荧光抗体，直接加入200μL 1％多聚甲醛固定；流式分析：以标准程序检测，一般计数2-3万个细胞，用对检测结果分析，检测细胞系中CD44+CD24-/low细胞比例。
(5)Hoechast 33342染色法检测SP细胞比例
常规培养法第7天微球体细胞中SP细胞比例测定：取1×106个单细胞加入Hoechast 33342染液至终质量浓度5μg/ml，37℃水浴90min，每15min震荡混匀一次，1000×g离心5min，PBS液洗2次，弃上清，涂片，于荧光显微镜下以蓝色荧光观察并利用Image capture软件拍照，随机计数10个视野中的细胞总数及核无荧光染色细胞(SP细胞)数，计算核无荧光染色细胞百分数，即SP细胞比例。
改进培养法第3天微球体细胞中SP细胞比例测定：取1×106个单细胞加入Hoechast 33342染液至终质量浓度5μg/ml，37℃水浴90min，每15min震荡混匀一次，1000×g离心5min，PBS液洗2次，弃上清，涂片，于荧光显微镜下以蓝色荧光观察并利用Image capture软件拍照，随机计数10个视野中的细胞总数及核无荧光染色细胞(SP细胞)数，计算核无荧光染色细胞百分数，即SP细胞比例。
3、实验结果
(1)MCF-7微球体的形成
常规培养法：悬浮细胞在培养48h后逐渐形成较小的初始细胞团，在倒置相差显微镜下可见细胞团由几个到十几个正在分裂的新生细胞组成，形态不规则，结构松散；第5天出现典型的MCF-7悬浮细胞球，至第7天细胞球形成效率为(1.6±0.7)％。
改进培养法：悬浮细胞在培养12h后逐渐形成较小的初始细胞团，在倒置相差显微镜下可见细胞团由几个到十几个正在分裂的新生细胞组成，形态不规则，结构松散；第3天出现典型的MCF-7悬浮细胞球，细胞球形成效率为(3.4±0.7)％；第5、7天细胞球形成效率分别为(5.7±1.9)％、(9.6±2.2)％。
由此可见，改进培养法可以显著提高MCF-7微球体的形成效率。
(2)CD44+CD24-/low细胞比例
常规培养法：FCM显示，CD44+CD24-/low细胞比例为(8.3±0.5)％。
改进培养法：FCM显示，CD44+CD24-/low细胞比例为(63.6±4.9)％。
由此可见，改进培养法第3天微球体细胞中CD44+CD24-/low细胞比例高达60％以上，而常规培养法第7天微球体细胞中CD44+CD24-/low细胞比例仅(8.3±0.5)％。
(3)SP细胞比例
常规培养法：SP细胞比例比例为(7.4±1.8)％。
改进培养法：SP细胞比例比例为(55.7±5.6)％。
由此可见，改进培养法第3天微球体细胞中SP细胞比例高达50％以上，而常规培养法第7天微球体细胞中SP细胞比例仅(7.4±1.8)％。
实施例2：从人乳腺癌MCF-7细胞系中富集乳腺癌干细胞
1、实验材料
改进含血清培养基：加兰他敏和石蒜碱共150nmol/L，二者摩尔比2:1，其他同实施例1。
改进无血清培养基：加兰他敏和石蒜碱共150nmol/L，二者摩尔比2:1，其他同实施例1。
2、实验方法
同实施例1。
3、实验结果
(1)MCF-7微球体的形成
第3天出现典型的MCF-7悬浮细胞球，细胞球形成效率为(3.1±0.9)％；第5、7天细胞球形成效率分别为(5.3±1.6)％、(9.1±2.4)％。
(2)CD44+CD24-/low细胞比例
FCM显示，改进培养法第3天微球体细胞中CD44+CD24-/low细胞比例为(59.7±5.4)％。
(3)SP细胞比例
改进培养法第3天微球体细胞中SP细胞比例为(52.5±5.1)％。
实施例3：从人乳腺癌MCF-7细胞系中富集乳腺癌干细胞
1、实验材料
改进含血清培养基：加兰他敏和石蒜碱共150nmol/L，二者摩尔比1:2，其他同实施例1。
改进无血清培养基：加兰他敏和石蒜碱共150nmol/L，二者摩尔比1:2，其他同实施例1。
2、实验方法
同实施例1。
3、实验结果
(1)MCF-7微球体的形成
第3天出现典型的MCF-7悬浮细胞球，细胞球形成效率为(3.3±0.5)％；第5、7天细胞球形成效率分别为(5.4±1.7)％、(9.3±2.1)％。
(2)CD44+CD24-/low细胞比例
FCM显示，改进培养法第3天微球体细胞中CD44+CD24-/low细胞比例为(56.5±5.8)％。
(3)SP细胞比例
改进培养法第3天微球体细胞中SP细胞比例为(54.2±4.8)％。
对比实施例1：
1、实验材料
改进含血清培养基：加兰他敏150nmol/L，其他同实施例1。
改进无血清培养基：加兰他敏150nmol/L，其他同实施例1。
2、实验方法
(1)贴壁培养MCF-7细胞系
改进培养法：同实施例1。
(2)微球体培养
改进培养法：同实施例1。
(3)单细胞悬液的制备
改进培养法第7天微球体单细胞悬液的制备：配制0.05％trypsin-0.53mmol/L EDTA-4Na的干细胞消化液；消化微球体并吹打；镜下见大多数单细胞形成时终止消化，1500r/min离心6min，吸弃上清；加入无血清的DMEM-F122ml培养液重悬；加入4℃含2.5％胎牛血清的PBS 2ml重悬，过40μmol/L的细胞筛网，即获得单细胞悬液；细胞计数。
(4)流式细胞仪检测干细胞表型CD44+CD24-/low细胞比例
改进培养法第7天微球体细胞中CD44+CD24-/low细胞比例测定：取上述单细胞悬液设实验管和对照管，每管调整浓度为3×105/mL单细胞悬液；荧光抗体标记固定：实验管中加入CD24-PE 20μL和CD44-FITC 0.5μL，加入200μL 1％多聚甲醛固定，对照管中不加荧光抗体，直接加入200μL 1％多聚甲醛固定；流式分析：以标准程序检测，一般计数2-3万个细胞，用对检测结果分析，检测细胞系中CD44+CD24-/low细胞比例。
(5)Hoechast 33342染色法检测SP细胞比例
改进培养法第7天微球体细胞中SP细胞比例测定：取1×106个单细胞加入Hoechast 33342染液至终质量浓度5μg/ml，37℃水浴90min，每15min震荡混匀一次，1000×g离心5min，PBS液洗2次，弃上清，涂片，于荧光显微镜下以蓝色荧光观察并利用Image capture软件拍照，随机计数10个视野中的细胞总数及核无荧光染色细胞(SP细胞)数，计算核无荧光染色细胞百分数，即SP细胞比例。
3、实验结果
(1)MCF-7微球体的形成
第5天出现典型的MCF-7悬浮细胞球，至第7天细胞球形成效率为(1.5±0.5)％。
(2)CD44+CD24-/low细胞比例
FCM显示，改进培养法第7天微球体细胞中CD44+CD24-/low细胞比例为(7.7±0.8)％。
(3)SP细胞比例
改进培养法第7天微球体细胞中SP细胞比例为(7.6±1.5)％。
对比实施例2：
1、实验材料
改进含血清培养基：石蒜碱150nmol/L，其他同实施例1。
改进无血清培养基：石蒜碱150nmol/L，其他同实施例1。
2、实验方法
(1)贴壁培养MCF-7细胞系
改进培养法：同实施例1。
(2)微球体培养
改进培养法：同实施例1。
(3)单细胞悬液的制备
改进培养法第7天微球体单细胞悬液的制备：配制0.05％trypsin-0.53mmol/L EDTA-4Na的干细胞消化液；消化微球体并吹打；镜下见大多数单细胞形成时终止消化，1500r/min离心6min，吸弃上清；加入无血清的DMEM-F122ml培养液重悬；加入4℃含2.5％胎牛血清的PBS 2ml重悬，过40μmol/L的细胞筛网，即获得单细胞悬液；细胞计数。
(4)流式细胞仪检测干细胞表型CD44+CD24-/low细胞比例
改进培养法第7天微球体细胞中CD44+CD24-/low细胞比例测定：取上述单细胞悬液设实验管和对照管，每管调整浓度为3×105/mL单细胞悬液；荧光抗体标记固定：实验管中加入CD24-PE 20μL和CD44-FITC 0.5μL，加入200μL 1％多聚甲醛固定，对照管中不加荧光抗体，直接加入200μL 1％多聚甲醛固定；流式分析：以标准程序检测，一般计数2-3万个细胞，用对检测结果分析，检测细胞系中CD44+CD24-/low细胞比例。
(5)Hoechast 33342染色法检测SP细胞比例
改进培养法第7天微球体细胞中SP细胞比例测定：取1×106个单细胞加入Hoechast 33342染液至终质量浓度5μg/ml，37℃水浴90min，每15min震荡混匀一次，1000×g离心5min，PBS液洗2次，弃上清，涂片，于荧光显微镜下以蓝色荧光观察并利用Image capture软件拍照，随机计数10个视野中的细胞总数及核无荧光染色细胞(SP细胞)数，计算核无荧光染色细胞百分数，即SP细胞比例。
3、实验结果
(1)MCF-7微球体的形成
第5天出现典型的MCF-7悬浮细胞球，至第7天细胞球形成效率为(1.9±0.8)％。
(2)CD44+CD24-/low细胞比例
FCM显示，改进培养法第7天微球体细胞中CD44+CD24-/low细胞比例为(8.7±1.2)％。
(3)SP细胞比例
改进培养法第7天微球体细胞中SP细胞比例为(7.9±1.6)％。
实施例4：富集乳腺癌干细胞的试剂
提供一种商品化的从MCF-7乳腺癌细胞株中富集富集乳腺癌干细胞的试剂：包括含血清培养基和无血清培养基。
含血清培养基：DMEM/F12培养液中加入10％的胎牛血清FBS和双抗(1L培养基加入10ml的100×青霉素-链霉素溶液)、加兰他敏和石蒜碱共150nmol/L，二者摩尔比为1:1。
无血清培养基：DMEM/F12培养液中加入双抗(1L培养基加入10ml的100×青霉素-链霉素溶液)、重组人表皮生长因子EGF 20g/L、牛血清白蛋白BSA4g/L、胰岛素5mg/L、B272％(1L培养基加20ml 50X B27)、加兰他敏和石蒜碱共150nmol/L，二者摩尔比为1:1。
含血清培养基用于贴壁培养MCF-7细胞系；无血清培养基用于培养微球体。
加兰他敏和石蒜碱摩尔比也可为2:1或1:2。
实施例5：富集乳腺癌干细胞的试剂盒
包括双抗(青霉素和链霉素)、筛选剂加兰他敏和石蒜碱、筛选剂溶解助剂DMSO、抗氧化剂亚硫酸钠、常规生长因子重组人表皮生长因子EGF、牛血清白蛋白BSA、胰岛素和B27。该试剂盒可以与DMEM/F12培养液、胎牛血清配合使用，供研究者自行配制实施例4所述的含血清培养基和无血清培养基。
本发明提供的试剂能有效从人乳腺癌MCF-7细胞系中便捷、高效地富集得到乳腺癌干细胞，细胞球形成周期短(由现有技术的7天缩短至3天且形成效率显著提高)、微球体细胞中CD44+CD24-/low分子标记的肿瘤细胞和SP细胞含量高(均由现有技术的10％以下提高到50％以上)，可以开发成试剂盒提高科研工作者富集乳腺癌干细胞的效率。
上述具体实施例仅用于解释本发明的技术方案，本领域技术人员应当明白，本发明的保护范围并不受限于上述具体实施例。