本发明属于生物技术领域，涉及利用复杂的体系提取获取金银花中绿原酸粗品的方法。具体的，涉及离子液体超声酶解提取金银花中绿原酸的方法。
背景技术：
金银花是忍冬科植物的花蕾，性味甘寒，具有清热解毒、 抗菌消炎、 消痈散肿和保肝利胆之功效。金银花在我国分布较广，药用历史悠久，是国家卫生部首批颁布的既是食品又是药品的60种中药材之一。
金银花中含有绿原酸、黄酮化合物和芳樟醇等活性成分，其中，绿原酸是金银花中的主要活性成分，被国际公认为“植物黄金”。而且，绿原酸因具有抗菌消炎、保肝利胆、延缓衰老等多种作用，被广泛应用到食品、医药、化妆品等行业，所以从植物中提取分离绿原酸具有重大意义。
离子液体是由无机酸根阴离子和体积较大的有机阳离子组成的液体。其具有优良的化学性质，如蒸汽压低，在较宽的温度范围内热稳定性好，可调的物理化学性质等，因为在室温或接近室温下呈现液态，又称室温离子液体，是近年来兴起的一类绿色溶剂。
绿原酸的分子结构中有酯键、不饱和双键及多元酚3个不稳定部分。在现有提取技术中，通常采用的提取技术手段为水提法与有机溶剂提取法。王茜等[王茜, 李智, 何琦, 等. 杜仲叶中绿原酸提取分离工艺条件的研究[J]. 离子交换与吸附, 2008, 24(1): 73-80.]将水作为提取溶剂，并对水提取条件进行了优化，结果表明，绿原酸的提取率为1.48%。肖文平等[肖文平, 李娟. 金银花中绿原酸的提取和含量测定[J]. 安徽农业科学, 2011, 39(35): 21675-21676.]采用乙醇回流法考察影响金银花中绿原酸提取率的因素，并优化了提取工艺参数，结果表明，绿原酸的提取率为3.81%。传统的绿原酸提取法表现出了提取率较低的问题，另外，长时间相对较高的温度有可能会导致绿原酸的分解，从而造成分离纯化成本的增加。因此，新的提取分离方法也亟需出现，近年来新兴起了各种新型的提取方法。例如，梅林等[梅林. 金银花中绿原酸的酶法提取工艺优化[J]. 广州化学, 2007, 32(4): 30-34.]采用酶法优化金银花中的绿原酸的提取工艺并得出了最佳提取条件，结果显示，绿原酸提取率为3.57%。刘亚敏等人[刘亚敏, 刘玉民, 李琼, 等. 超声波辅助提取山银花绿原酸工艺及其抗氧化性研究[J]. Xu Wenjing等人[Xu W J, Zhai J W, Cui Q, et al. Ultra-turrax based ultrasound-assisted extraction of five organic acids from honeysuckle (Lonicera japonica Thunb.) and optimization of extraction process[J]. Separation and Purification Technology, 2016, 166: 73-82.]采用超声辅助提取金银花中的绿原酸，优化了提取提取工艺，并得出了最优参数，结果表明，绿原酸的提取率达到了5.26%。Zhang Lijin等人[Zhang L J, Liu J F, Zhang P P, et al. Ionic liquid-based ultrasound-assisted extraction of chlorogenic acid from Lonicera japonica Thunb[J]. Chromatographia, 2011, 73(1-2): 129-133.]利用亲水性离子液体[BMIM][BF4]超声提取金银花中的绿原酸，考察了粒径，[BMIM][BF4]浓度，pH，提取温度，超声功率，超声时间等6个因素并得出最优工艺参数，结果表明：该方法下的绿原酸提取率为5.29%，较单一超声法提高了37.9%，较乙醇回流法提高了18.8%。强极性的离子液体对天然产物具有较强的溶解和提取能力，而且很多种类的离子液体对酶具有稳定和活化作用，本发明将离子液体、酶与超声三者结合，用于金银花中绿原酸的提取，发展一种更加高效的提取新方法。
技术实现要素：
本发明需要解决的技术问题在于提升现有技术中金银花提取绿原酸的提取率，降低提取的成本，降低提取过程中的污染。
为了解决该技术问题，本发明的技术方案为：
一种从金银花中提取绿原酸的方法，其中，该方法的具体步骤为：
（1）将金银花粉粹，加入离子液体中，混匀得到混合物；
（2）在混合物中加入乙醇、0.5-2%（占金银花的比重）的酶，并调节混合物的pH值为3-5；
（3）超声至提取结束；
（4）过滤获取滤液；
（5）先减压浓缩并回收乙醇，再用乙酸乙酯反萃取绿原酸并回收离子液体，浓缩得到绿原酸粗提物。
本发明所述的方法，其中，所述离子液体为甲基咪唑氯盐，1-丁基-3-乙基咪唑氯盐，1-丁基-3-乙基咪唑甲酸盐，1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐中的一种。
本发明所述的方法，其中，所述离子液体在萃取体系中的浓度为0.1-1.5mol/L。
本发明所述的方法，其中，所述乙醇浓度为70%。
本发明所述的方法，其中，所述酶用量为金银花干重的0.5%-2%。
本发明所述的方法，其中，所述的超声温度为45℃，超声时间为30-60min，超声功率为60-100W。
本发明所述的方法，其中，步骤（5）中，先减压浓缩回收乙醇，再将乙酸乙酯加入滤液中，待体系分层之后分别回收处理，取下层减压浓缩回收离子液体，取上层减压浓缩得绿原酸粗提物。
本发明所述的方法，其中，所述酶为果胶酶或者纤维素酶。
本发明所述的方法，其中，所述金银花干重与乙醇体积的比为1:30-50。
在本发明的一个优选实施方案中：
采用离子液体超声提取金银花中绿原酸的方法，包括如下步骤：将金银花粉碎成粉末放置平底烧瓶，加入料液比为1:30-1:50的体积浓度为70%的乙醇，质量浓度为0.5-2%（金银花干重）的果胶酶或者纤维素酶，并加入离子液体，使得离子液体在最终的萃取体系中的浓度为0.1-1.5mol/L，调节体系pH为3-5；超声温度45℃，超声功率为60-100 W的设备中超声时间30min-60min，过滤提取液，浓缩回收乙醇，将乙酸乙酯加入滤液中，待体系分层之后分别回收处理，取下层减压浓缩回收离子液体，取上层减压浓缩即得绿原酸粗提物。
本发明的有益效果在于
（1）本发明采用离子液体辅助超声酶法提取金银花中的绿原酸，提取时间较短，提取效率较已报道文献有所提高。
（2）本发明工艺简单、条件温和、节能环保、溶剂可回收利用。
具体实施方式
实施例1：超声法提取绿原酸
金银花经粉碎机粉碎后，过筛，烘干，称取金银花粉末2g，在料液比为1:50，乙醇浓度为70%，体系pH为5，超声温度为45℃，超声功率为180W，超声时间为60min的条件下提取绿原酸。然后过滤，滤渣为提取后的金银花粉末，滤液经减压蒸馏回收乙醇后，将乙酸乙酯加入滤液中，待体系分层后分别处理，取下层减压浓缩回收离子液体，取上层减压浓缩即为绿原酸粗提物，用0.45μm的微孔滤膜过滤绿原酸粗提物，在HPLC下进行检测，结果显示该条件下绿原酸提取率可以达到4.73%。
实施例2：果胶酶法提取绿原酸
金银花经粉碎机粉碎后，过筛，烘干，精密称取金银花粉末2g，在料液比为1:50，乙醇浓度为70%，果胶酶用量为1%，体系pH为5，加热温度为50℃的条件下回流60min提取绿原酸。然后过滤，滤渣为提取后的金银花粉末，滤液经减压蒸馏回收乙醇后，将乙酸乙酯加入滤液中，待体系分层后分别处理，取下层减压浓缩回收离子液体，取上层减压浓缩即为绿原酸粗提物，用0.45μm的微孔滤膜过滤后，在HPLC下进行检测，结果显示该条件下绿原酸提取率可以达到4.20%。
实施例3超声-纤维素酶法提取绿原酸
金银花经粉碎机粉碎后，过筛，烘干，精密称取金银花粉末2g，控制乙醇浓度为70%，超声温度为45℃，在料液比为1:50，纤维素酶用量为0.8%，体系pH为5，超声功率为150W，超声时间为50min的条件下提取绿原酸。然后过滤，滤渣为提取后的金银花粉末，滤液经减压蒸馏回收乙醇后，将乙酸乙酯加入滤液中，待体系分层后分别处理，取下层减压浓缩回收离子液体，取上层减压浓缩即为绿原酸粗提物，用0.45μm的微孔滤膜过滤后，在HPLC下进行检测，结果显示该条件下绿原酸提取率可以达到5.73%。
实施例4 超声-果胶酶酶法提取绿原酸
金银花经粉碎机粉碎后，过筛，烘干，精密称取金银花粉末2g，控制乙醇浓度为70%，超声温度为45℃，在料液比为1:50，果胶酶用量为1.2%，体系pH为4，超声功率为120W，超声时间为40min的条件下提取绿原酸。然后过滤，滤渣为提取后的金银花粉末，滤液经减压蒸馏回收乙醇后，将乙酸乙酯加入滤液中，待体系分层后分别处理，取下层减压浓缩回收离子液体，取上层减压浓缩即为绿原酸粗提物，用0.45μm的微孔滤膜过滤绿原酸粗提物，在HPLC下进行检测，结果显示该条件下绿原酸提取率可以达到6.01%。
实施例5 超声-果胶酶法提取绿原酸（甲基咪唑氯盐）
金银花经粉碎机粉碎后，过筛，烘干，精密称取金银花粉末2g，控制乙醇浓度为70%，超声温度为45℃，在离子液体甲基咪唑氯盐为0.6mol/L，料液比为1:40，果胶酶用量为0.5%，体系pH为4，超声功率为90W的条件下，超声50min。然后过滤，滤渣为提取后的金银花粉末，滤液经减压蒸馏回收乙醇后，将乙酸乙酯加入滤液中，待体系分层后分别处理，取下层减压浓缩回收离子液体，取上层减压浓缩即为绿原酸粗提物，用0.45μm的微孔滤膜过滤绿原酸粗提物，在HPLC下进行检测，结果显示，该条件下绿原酸提取率可以达到6.51%。重复使用离子液体3次，绿原酸提取率均值为6.23%。
实施例6 超声-果胶酶法提取绿原酸（1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐）
金银花经粉碎机粉碎后，过筛，烘干，精密称取金银花粉末2g，控制乙醇浓度为70%，超声温度为45℃，在离子液体1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐为0.5mol/L，料液比为1:50，果胶酶用量为0.8%，体系pH为4，超声功率为80W的条件下，超声40min。然后过滤，滤渣为提取后的金银花粉末，滤液经减压蒸馏回收乙醇后，将乙酸乙酯加入滤液中，待体系分层后分别处理，取下层减压浓缩回收离子液体，取上层减压浓缩即为绿原酸粗提物，用0.45μm的微孔滤膜过滤后，在HPLC下进行检测，结果显示，在该条件下，绿原酸提取率可以达到6.42%。重复使用离子液体3次，绿原酸提取率均值为6.39%。
实施例7 超声-果胶酶法提取绿原酸（1-丁基-3-乙基咪唑甲酸盐）
金银花经粉碎机粉碎后，过筛，烘干，精密称取金银花粉末2g，控制乙醇浓度为70%，超声温度为45℃，在离子液体1-丁基-3-乙基咪唑甲酸盐为0.6mol/L，料液比为1:40，果胶酶用量为0.5%，体系pH为4，超声功率为90W的条件下，超声40min。然后过滤，滤渣为提取后的金银花粉末，滤液经减压蒸馏回收乙醇后，将乙酸乙酯加入滤液中，待体系分层后分别处理，取下层减压浓缩回收离子液体，取上层减压浓缩即为绿原酸粗提物，用0.45μm的微孔滤膜过滤绿原酸粗提物，在HPLC下进行检测，结果显示，在该条件下绿原酸提取率可以达到6.50%。重复使用离子液体3次，绿原酸提取率均值为6.48%。
实施例8 超声-果胶酶法提取绿原酸（1-丁基-3-乙基咪唑氯盐）
金银花经粉碎机粉碎后，过筛，烘干，精密称取金银花粉末2g，控制乙醇浓度为70%，超声温度为45℃，在离子液体1-丁基-3-乙基咪唑氯盐为0.9mol/L，料液比为1:30，果胶酶用量为1.0%，体系pH为4，超声功率为70W的条件下，超声30min。然后过滤，滤渣为提取后的金银花粉末，滤液经减压蒸馏回收乙醇后，将乙酸乙酯加入滤液中，待体系分层后分别处理，取下层减压浓缩回收离子液体，取上层减压浓缩即为绿原酸粗提物，用0.45μm的微孔滤膜过滤绿原酸粗提物，在HPLC下进行检测，结果显示，该条件下原酸提取率可以达到6.83%。重复使用离子液体3次，绿原酸提取率均值为6.82%。