一株环形泰勒虫裂殖体细胞及裂殖体的培养方法与流程

本发明涉及一种动物寄生虫细胞及这种动物寄生虫细胞的培养方法，确切地说本发明涉及一种环形泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞，以及这种细胞的培养方法。

技术背景

环形泰勒虫属于泰勒虫科泰勒虫属的一种血液原虫，是牛热带泰勒虫病的病原。该病在我国北方地区广泛流行，多呈急性经过，能导致牛的致死性白细胞增殖紊乱，具有较高的发病率和死亡率，给养牛业造成了巨大的经济损失。

研究表明，牛环形泰勒虫裂殖体胶冻细胞疫苗对控制该病的流行发挥了重要作用。现有技术中生产疫苗采用的细胞培养方法为静置或转瓶培养，这种培养方法所得到的细胞结团严重，呈岛屿状、边缘不整齐、透光性差、密度及活力低，而且需要大量的犊牛血清，增加了疫苗的生产成本，进而影响了该病免疫预防的大面积推广应用。

技术实现要素：

本发明提供了一种可克服现有技术不足，能实现环形泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞高质量、高密度的增殖环形泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞，同时提供一种环形泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞的培养方法。

本发明的一株环形泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞株已经于2016年11月2日保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No.C2016187，名称为：“环形泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞”。

本发明的一种环形泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞的培养方法是：

(1)显微镜下肉眼观察，挑选生长状态良好的环形泰勒虫裂殖体细胞的种细胞，将种细胞单层铺满于无菌的培养器皿内。

(2)在无菌条件下，将步骤⑴中的细胞沿培养器皿的细胞生长面轻轻吹打并混匀，静置培养96小时后，吸取细胞悬液并补加细胞营养液RPMI-1640至另一个培养器皿内批式传代培养，其中吸取的细胞悬液与细胞营养液的体积比为1:1.6～1:3.5，培养至细胞倍增率、细胞密度和活率等指标趋于稳定，细胞形态正常时，表明细胞已经适应在悬浮培养条件下生长，细胞驯化成功。

优选地，本发明所述的环形泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞的培养方法是：悬浮传代培养至11代，得到细胞驯化成功的悬浮细胞，所用的培养基为购自Hyclone公司的RPMI-1640，培养时在恒温、旋转振荡条件下进行，其培养温度为37.5℃，每代的培养时间为72～96h。

优选地，本发明所述的环形泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞的培养方法，其悬浮培养的参数为：培养温度37.5℃、培养器皿的转速为80～120rpm、每代的培养时间为72～96h，细胞量与培养基间的的体积比为1:2—1:3。

采用本发明制备的环形泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞，形态良好、增殖速度快，与传统的静置培养或转瓶培养方法相比，其在降低生产成本的同时，很大程度地提高了生产效率，而且还可大幅度地提高后期培养细胞的收获密度和活率。本发明提供的环形泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞悬浮培养方法，不仅提升了细胞质量和产量，而且降低了培养成本、操作方便、劳动强度低和便于生产，为该病的免疫预防提供了有力的技术支持。

附图说明

图1为环形泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞悬浮培养驯化过程中F14、F20、F25细胞形态照片。

图2为环形泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞培养参数优化过程中F30、F35、F41细胞形态照片。

图3为环形泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞适应悬浮培养至F41后的细胞培养生长曲线。

图4为根据细胞分析仪CASY TT对细胞的生长情况，如存活细胞、死亡细胞及细胞碎片的数量进行统计、分析，最终绘制出的细胞大小分布图。本图所示的细胞密度为3.59×10⁶cells/mL，活率为92.83％。

具体实施方式

以下结合具体实施过程对本发明进行详细说明。

一、基本方法

1.材料和方法

1.1所用的细胞为中国农业科学院兰州兽医研究所惠赠的第14代环形泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞。

营养液为购自Hyclone公司的RPMI-1640。

新生牛血清购自合格供应商。

1.2仪器和设备恒温培养振荡器(上海苏坤实业有限公司)；细胞分析仪(德国INNOVATIS公司)；移液器(Eppendorf)；倒置显微镜(宁波舜宇仪器有限公司)；生物洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)。

1.3方法

1.3.1静置培养种细胞及筛选

显微镜下肉眼观察，挑选生长状态良好，形态一致的第14代环形泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞，单层铺满于无菌方瓶，得到作为悬浮培养的种细胞。

1.3.2环形泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞的悬浮培养驯化

将中国农业科学院兰州兽医研究所惠赠的F14代细胞静置培养96小时后，细胞铺满T25方瓶。挑选出生长状态良好、形态一致，无污染的F14代T25方瓶细胞为悬浮培养的种细胞，将细胞轻轻吹打并混匀，吸取适量细胞悬液，补加适量细胞营养液RPMI-1640至灭菌处理的250mL锥形细胞培养瓶恒温振荡培养，其中1份体积的细胞悬液加入1.6～3.5倍体积的培养基，相关试验表明最佳的比例为1：2～1：3。细胞批式传代培养后，取样观察并检测细胞密度及活率。当细胞倍增率、细胞密度和活率等指标趋于稳定，细胞形态正常(圆形、边缘整齐、饱满透亮、大小均匀、不结团)时，表明细胞已经适应在悬浮培养条件下生长，即细胞驯化成功。

2.结果

细胞由静置培养转为悬浮培养后，F14-F15细胞结团较多，团块大小不一，多呈10个细胞粘连的小团块，单个细胞形态不均匀、不透亮，细胞悬液中可见裂解的细胞碎片；F15-F17细胞结团较少，多呈3个细胞松散粘连的小团块，单个细胞呈圆形、透亮；F17-F20细胞多呈单个，2-4个串状，团块明显减少，细胞悬液变得透亮；F20-F25细胞边缘整齐，饱满透亮，大小均匀，细胞悬液变得透亮。细胞从F14-F25悬浮培养驯化过程中，细胞团块明显减少，单个细胞形态逐渐趋于圆形，饱满透亮，细胞悬液变得透亮，表明该细胞已经适应在悬浮培养条件下生长，参见表1。

表1细胞悬浮培养驯化过程中密度与活率检测结果

所述驯化过程中F14、F20、F25细胞形态参见附图1。附图1中，左图为T25方瓶静置培养环形泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞F14。镜下观察：细胞呈岛屿状分布、分散不均匀、大小不一、透光性差及死细胞多；中图为悬浮培养驯化细胞F20。镜下观察：细胞圆润、透亮、分散均匀，细胞间营养液清亮。与静置培养相比，结团严重的现象有所改善，但密度不高，表明细胞增殖仍较慢；右图悬浮培养驯化细胞F25。镜下观察：细胞结团明显减少，细胞饱满透亮，边缘整齐。

二、最佳培养条件

为了摸索细胞生长过程中的关键参数(如培养温度、培养转速及培养时间)对细胞密度及活力的影响，本发明利用正交试验进行数据的统计分析，最终确定了环形泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞悬浮培养的最佳培养条件。试验中所用材料、培养基及所用仪器设备同上。

试验方法

1.试验设计

选用L9(3⁴)正交表进行试验设计，试验因素及水平分别为培养温度(36.5℃、37.0℃、37.5℃)、培养转速(40rpm、80rpm、120rpm)、培养时间(72h、96h、120h)，最后一列为空白列。

2.细胞培养方法

将驯化的细胞转移至250mL锥形细胞培养瓶，并补加适量细胞营养液至初始培养密度为0.5×10⁶cells/ml后，恒温振荡培养箱悬浮培养，随后每隔24h取悬浮培养细胞，观察其形态及生长情况，以活细胞最大密度及活率为指标，从而确定环形泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞悬浮培养的最佳温度、转速及培养时间。

3.结果及分析

3.1结果

表2试验结果(一)

表3试验结果(二)

3.2分析

由试验结果(一)、(二)可知，环形泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞悬浮培养试验中发现，培养温度、培养转速及培养时间在其悬浮培养过程中起着关键的作用。正交试验结果表明，培养温度、培养转速及培养时间分别为37.5℃、120rpm、96h时，细胞密度较高，但活率呈下降趋势；当培养参数变为37.5℃、80rpm、72h时细胞密度虽不是最高水平，但活率呈上升趋势，从而确定出三个关键参数的最优组合为温度37.5℃、转速80-120rpm、培养时间72-96h。

对经上述试验所得到的F27代产物，送交位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，进行保藏，其保藏号为：CCTCC NO:C2016187，其名称为：“环形泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞”。

三、驯化细胞的传代培养

试验中所用材料、培养基及所用仪器设备同上。

1方法

吸取适量驯化至F25的细胞悬液，补加适量细胞营养液至初始密度为0.5×10⁶cells/mL,250mL锥形细胞培养瓶悬浮培养。培养参数为温度37.5℃、转速80-120rpm、培养时间72-96h。每传代一次，取样观察及检测细胞生长情况(细胞形态、密度、活率)后，取适量细胞种子并补加适量细胞营养液进行细胞批式传代培养。当细胞密度及活率均逐渐提高且趋于稳定，细胞形态正常(圆形、边缘整齐，饱满透亮，大小均匀)时，表明驯化的细胞在优化的培养条件下可依次连续传代培养。

2结果

由图2及表4可知，驯化的细胞在优化的条件下培养，F25-F30细胞团块明显减少，细胞边缘整齐，饱满透亮；F30-F35细胞呈1-2个花生状，细胞间营养液清亮；F35-F41细胞呈单个圆形，大小均匀，排列紧密。细胞从F25-F41培养过程中，细胞密度从2.13×10⁶cells/mL增加到4.2×10⁶cells/mL；细胞活率从88.7％上升到93.4％，表明细胞在优化的培养条件下密度及活率逐渐增加、可稳定传代，而且经本发明优化驯化的细胞其密度及活率还有明显的上升。

表4培养参数优化过程中细胞密度与活率检测结果

通过细胞培养生长曲线(图3)，可见悬浮培养至F41后，细胞培养生长曲线。文献记载，环形泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞培养至96h后，活率明显下降。本实验在细胞培养的0、24、48、72、96、120、144h分别取样，利用细胞分析仪CASY TT检测细胞密度及活率。根据检测结果绘制的细胞培养生长曲线表明，细胞培养至96h后，密度从3.43×10⁶cells/mL降至2.4×10⁶cells/mL；活率从93.18％降至88.5％，实验结果与文献记载一致。

图4为根据细胞分析仪CASY TT对细胞的生长情况，如存活细胞、死亡细胞及细胞碎片的数量进行统计、分析，最终绘制出细胞大小分布图。其工作原理为：死细胞具有一个可渗透的细胞膜，它允许等渗缓冲溶液CASYton进入。因此，死细胞内的细胞质同胞外的等渗缓冲液具有相同的电导率，可以被电极所忽略，所测得的仅仅是紧密结构的细胞核的体积。而活细胞拥有完整的细胞膜，CASY技术分析的是全细胞的体积。利用两者的相对差异即可区分活细胞与死细胞。如图所示①在以虚线表示的光标左侧(≤6.3μm)为细胞碎片峰。②在左侧的标准光标和以实线表示的赋值光标(6.3μm to 9.1μm)之间出现的是死细胞峰。死细胞的细胞膜不完整，不能屏蔽电脉冲，因此图像表现的死细胞的大小实际是细胞核的大小。③在赋值光标的右侧是活细胞峰和细胞团块峰。由图可知，活细胞及细胞团块峰的峰形陡峭，表明细胞大小均匀，且大部分细胞直径在11.00μm左右；死细胞峰低，但仍存在较多的细胞碎片。本图所示的细胞密度为3.59×10⁶cells/mL，活率为92.83％。