一种γδT细胞的培养方法与流程

本发明涉及医学领域，具体的说是涉及一种γδT细胞的培养方法。

背景技术：

在机体对肿瘤杀伤的过程中，细胞免疫是主力。细胞免疫是由T淋巴细胞介导的，T淋巴细胞在对肿瘤细胞杀伤的时候是有MHC限制性的，即CD4+T细胞只能识别MHC-II类复合物，CD8+T细胞只能识别MHC-I类复合物，两种T细胞不能识别不表达相应MHC的细胞，所以具有限制性。而非限制杀瘤一般指不需要MHC识别即可杀伤肿瘤，通常包括NK细胞和CIK细胞。

γδT细胞是一类分布于外周血及粘膜组织的非MHC限制性固有T淋巴细胞，主要分布于肠道上皮、皮肤、脾脏和肝脏，在外周血中所占比例很低。γδT细胞被证明能够体外清除血液系统肿瘤细胞和实体肿瘤尤其是上皮来源肿瘤细胞，也能在体外培养扩增。激活的γδT细胞能在血循环中持续发挥抗肿瘤效应，有望成为肿瘤的细胞过继免疫治疗的候选细胞亚群。

现有技术一般是直接分离外周血中的单个核细胞(PBMC)，然后将PBMC细胞在含有一定浓度的IL-2或其他白介素的培养基中培养2周，得到γδT细胞，并将其作为细胞制剂，运用于临床。但是这种常用的方法的扩增倍数较低，同时杀伤活性也不高。

现有专利CN102994448A和CN103756962A均公开了一种体外扩增γδT细胞的方法，区别在于诱导培养基不同，前者是将单个核细胞在含有唑来膦酸、HSP70、IL-7、IL-15、IL-2的无血清培养基中培养12-16天，后者是将单个核细胞在含有唑来膦酸、HSP70、TLR7配体、左旋咪唑、IL-7、IL-15、IL-2的无血清培养基中培养12-16天，虽然这两个专利所培养的γδT细胞在杀伤活性方面优势明显，但是在细胞扩增倍数方面却不足，最高不到200倍。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种γδT细胞的培养方法，使得所述培养方法能够显著提高γδT细胞的扩增倍数。

本发明的另一个目的在于提供一种γδT细胞的培养方法，使得所述培养方法能够显著提高γδT细胞的杀伤活性。

本发明的另一个目的在于提供一种γδT细胞的培养方法，使得所述培养方法能够显著提高γδT细胞分泌细胞因子IFN-γ和IL-4的含量。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种γδT细胞的培养方法，包括：

将单个核细胞在包含IL-15、OKT-3和的IL-2的无血清培养基诱导培养，至诱导出γδT细胞(一般为6天左右)，然后加入肿瘤细胞裂解液继续进行培养增殖(一般为9天左右)，然后再加入TNF-α继续培养促进γδT细胞成熟和进一步增殖，培养至14天获得γδT细胞。

更具体地，所述培养方法按照1-2×10⁶/mL的细胞密度将单个核细胞在包含IL-15、OKT-3和的IL-2的无血清培养基培养，培养至第6天加入肿瘤细胞裂解液继续进行培养，培养至第9天再加入IFN-γ继续培养，培养至14天获得γδT细胞。

针对现有方法存在的增殖速度不高等问题，本发明在体外诱导培养γδT细胞过程中采用适宜的培养基诱导后采用肿瘤细胞裂解液和IFN-γ进行刺激和致敏，不仅提高了增殖速度，而且提高了杀伤活性和提高了IFN-γ、IL-4的分泌量。其中，组为优选，所述无血清培养基包含100-1000U/mL的IL-15、50-500μg/mL的OKT-3和100-1000U/mL的IL-2。

在本发明的具体实施方式中，所述无血清培养基包含500U/mL的IL-15、100μg/mL的OKT-3和500U/mL的IL-2；或者包含100U/mL的IL-15、500μg/mL的OKT-3和1000U/mL的IL-2；或者包含1000U/mL的IL-15、50μg/mL的OKT-3和100U/mL的IL-2。

作为优选，所述无血清培养基为X-VIVO 15培养基。

作为优选，所述肿瘤细胞裂解液加入量为10-100μg/mL；本发明所述肿瘤细胞裂解液进一步优选为K562细胞反复冻融形成的裂解液。

作为优选，所述TNF-α加入量10-200ng/mL。

作为优选，所述培养为在37℃、5％二氧化碳条件下培养。

本发明所述单个核细胞可采用常规方法提取获得，在本发明中是按照如下方式制备获得：

采集外周血，离心后收集血浆；将下层血细胞用生理盐水进行稀释，再将稀释液加入Ficoll分离液离心，离心后将上层液体从离心管中倒出，再加入培养基重悬细胞，离心，获得单个核细胞。其中，所述培养基为RPMI 1640培养基。

按照本发明所述培养方法对外周血分离的单个核细胞进行诱导培养，以现有常规的方法作为对照。结果显示，在相同细胞密度前提下，本发明培养方式在16天细胞数可达到750百万个左右，扩增倍数为750倍左右，远高于对照的300百万个左右，扩增倍数为300倍左右。同时，在细胞杀伤活性方面以及IFN-γ、IL-4的分泌量方面以显著优于对照方法。

由以上技术方案可知，本发明通过调整前期诱导培养基的细胞因子，在培养中后期采用肿瘤细胞裂解液和IFN-γ进行刺激和致敏，不仅提高了细胞扩增倍数，而且提高了杀伤活性和提高了IFN-γ、IL-4的分泌量。

附图说明

图1所示为不同方法培养的γδT细胞流式检测结果；其中，A表示本发明方法的结果，B表示对照方法的结果；

图2所示为不同方法培养的γδT细胞的形态图，放大倍数为200倍；其中，A为本发明方法的结果，B为对照方法的结果；

图3所示为不同方法培养的γδT细胞的生长曲线；其中，A曲线为本发明方法的曲线，B为对照方法的曲线。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种γδT细胞的培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明产品和应用已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

以下就本发明所提供的一种γδT细胞的培养方法做进一步说明。

实施例1：外周血单个核细胞的提取分离

采集人外周血20mL，离心后收集血浆；将下层血细胞用生理盐水进行稀释，再将稀释液加入已有Ficoll分离液(购至STEM CELL公司)的sepmate离心管(购至STEM CELL公司)中，离心10-20min；离心后将上层液体从离心管中倒出，再加入一定量的RPMI 1640培养基重悬细胞，离心，获得单个核细胞。

实施例2：本发明所述培养方法

按照1-2×10⁶/mL的细胞密度加入X-VIVO 15培养基进行培养，并在培养基中加入IL-15、OKT-3和IL-2；第6天，加入K562肿瘤细胞裂解液，对γδT细胞进行刺激；第9天，加入IFN-γ，对γδT细胞进行致敏；14天后，获得γδT细胞；期间注意补加培养基和细胞因子。

其中，IL-15、OKT-3和IL-2浓度可选择如下：

(1)500U/mL的IL-15、100μg/mL的OKT-3和500U/mL的IL-2；

(2)100U/mL的IL-15、500μg/mL的OKT-3和1000U/mL的IL-2；

(3)1000U/mL的IL-15、50μg/mL的OKT-3和100U/mL的IL-2；

实施例3：流式细胞仪检测γδT细胞的表面标志物CD56⁺和CD3-

对照方法：按照1×10⁶/mL的细胞密度加入X-VIVO 15培养基进行培养，并在培养基中加入IL-15和IL-2，培养14天后，获得γδT细胞；期间注意补加培养基和细胞因子。

本发明方法：实施例2中采用第一种培养基的方法；

取两种方法培养后的γδT细胞进行CD56和CD3的流式检测。流式检测方法如下：取1×10⁶个γδT细胞；250g离心5min去上清；用含10％FBS的PBS溶液清洗2次；避光加入CD56和CD3抗体2.5μL室温孵育30min；用含10％FBS的PBS溶液清洗2次；用500mL RPMI 1640培养基重悬细胞并过滤，上流式细胞仪进行检测，结果见图1。

由图1可知，实施例1中γδT细胞的CD56+CD3+双阳性表达量为34％，而对比例1中γδT细胞的CD56+CD3+双阳性表达量仅为15.3％。

实施例4：细胞增殖对比

对照方法和本发明方法同实施例3。分别按照两种方法进行培养，并在培养过程中计数和进行形态观察，结果见图2和图3。

图2为第7日的细胞形态。图2所示，本发明方法培养的细胞中不规则形状的细胞要多于对照方法。

图3显示在培养过程中，采用本发明培养方法可显著增加细胞的增殖速度，16天细胞数可达到7.5×10⁸个左右，远高于对照的3.0×10⁸个左右，两者的扩增倍数分别为750倍和300倍左右。

实施例5：检测γδT细胞的杀伤活性

对照方法和本发明方法同实施例3。取两种方法培养后的γδT细胞进行杀伤活性检测。

铺板时各实验孔和对照设置如下：

试验孔：按效靶比40:1、20:1和10:1进行靶细胞(K562)和效应细胞(本发明方法或对照方法得到的γδT细胞共培养物)的铺板。其中，效应细胞的浓度分别为4×10⁶个/mL，2×10⁶个/mL，1×10⁶个/mL，每孔100μL，每组3个复孔；K562浓度为1×10⁵个/mL，每孔100μL，每组3个复孔。

效应细胞自然释放孔：4×10⁶个/mL，2×10⁶个/mL，1×10⁶个/mL，每孔100μL，每组3个复孔，每孔加入100μL培养基。

靶细胞最大释放孔：1×10⁵个/mL的靶细胞，每孔100μL，每组3个复孔，每孔加入100μL培养基，于37℃、5％二氧化碳培养箱孵育前45min每孔加入20μL细胞裂解液。

靶细胞自然释放孔：1×10⁵个/mL的靶细胞，每孔100μL，每组3个复孔，每孔加入100μL培养基。

培养液空白对照：每孔200μL培养液，每组3个复孔。

体积纠正对照：每孔200μL培养液，每组3个复孔，于37℃、5％二氧化碳培养箱孵育前45min每孔加入20μL细胞裂解液。

铺板后将培养板250g离心4min，置于37℃、5％二氧化碳培养箱孵育4h。在培养结束前45min，取出培养板，在靶细胞最大释放组和体积纠正组每孔加入20μL细胞裂解液，250g离心4min，继续培养45min后取出。

进行LDH(乳酸脱氢酶)测定，具体步骤如下：250g离心4min，每孔吸出50μL上清转移到另一新的96孔板中，每孔加底物溶液50μL，室温避光孵育30min。每孔加入50μL终止液，用振荡器将色素颗粒打散，测定490波长处的吸光度值。

试验组、靶细胞LDH自然释放组和效应细胞LDH自然释放组的吸光度均值减去培养液空白对比例吸光度值均值，获得校正值。靶细胞LDH最大释放组的吸光度均值减去体积纠正组吸光度值均值，获得校正值。

杀伤活性按如下公式计算：

活性＝(A-E-T)/(Tmax-T)×100％

A:试验组吸光度值校正值；

E:效应细胞自然释放孔吸光度值校正值；

T：靶细胞自然释放孔吸光度值校正值；

Tmax：靶细胞最大释放组吸光度值校正值。

结果见下表。

表1杀伤活性对比

由上表可以明显看出，本发明γδT细胞在不同效靶比下，杀伤活性均远高于对照方法。

实施例6：检测γδT细胞的IL-4和IFN-γ的表达量

对照方法和本发明方法同实施例3。

将γδT细胞培养后的细胞培养液收集起来进行浓缩，为实验品；分别将IFN-γ和IL-4标准品溶解，分别设置了5个浓度，分别是10μg/mL，20μg/mL，30μg/mL、40μg/mL及50μg/mL；从已恢复到室温的密封袋中取出实验所需板条；

留空白孔，提前30min制备生物素化抗体工作液，于10℃～35℃下避光放置；

分别将实验品或不同浓度的标准品(0μg/mL孔加试剂稀释液)加入相应孔中，100μl/孔，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育90min；

洗板4次：

除空白孔外，加入酶结合物工作液，100μl/孔。用胶纸封住反应孔，于37℃孵箱避光孵育60min；

洗板4次；

除空白孔外，加入酶结合物工作液，100μl/孔。用胶纸封住反应孔，于37℃孵箱避光孵育30min；

洗板4次；

加入显色底物，100μl/孔，于37℃孵箱避光孵育15min：

加入终止液，100μl/孔，混匀后检测其吸光度值(OD₄₅₀值)。

结果见表2。

表2 IL-4和IFN-γ的表达量

由上表可以明显看出，本发明方法培养的γδT细胞IL-4和IFN-γ的表达量远高于对照方法。

以上所述只是用于理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利的保护范围。