一种雷公藤原生质体的分离及瞬时转化方法与流程

本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种雷公藤原生质体的分离及瞬时转化方法，特别涉及一种雷公藤原生质体的分离纯化方法和外源基因瞬时转化的方法。

背景技术：

中药雷公藤为根类药材，来源于卫矛科植物雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)的根或根的木质部，具有清热解毒、祛风通络、舒筋活血、消肿止痛、杀虫止血等功效。雷公藤的主要活性物质为生物碱类、二萜类、三萜类、倍半萜类及糖类。具有抗炎、抗肿瘤、免疫抑制等作用，在现代临床治疗中主要应用于类风湿、抗肿瘤、肾小球疾病、系统性红斑狼疮等疾病。近年来，雷公藤的研究引起了国内外生物医学和农学等领域专家的广泛关注，但是对于雷公藤原生质体和瞬时转化的研究尚属空白，在一定程度上限制了雷公藤的功能基因及合成生物学等方面的深入研究。

原生质体是指没有细胞壁包被的“裸露”植物细胞，最外层由一层质膜包围，内含细胞质(包括基质、细胞器和后含物等)和细胞核，具有细胞全能性，可以再生细胞壁，进行连续分裂。原生质体的应用前景非常广泛，可以用于植物的遗传转化研究、细胞融合研究、遗传育种研究以及细胞膜研究等领域。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种雷公藤原生质体的分离方法。

本发明提供的雷公藤原生质体的分离方法包括如下步骤：

1)用酶解液酶解雷公藤愈伤组织悬浮细胞，得到酶解后的雷公藤悬浮细胞；

2)收集所述酶解后的雷公藤悬浮细胞中的沉淀，即得到雷公藤原生质体；

所述酶解液包括纤维素酶、果胶酶和离析酶。

上述方法中，

所述纤维素酶、所述果胶酶和所述离析酶的质量比为4:1:1。其中，1个酶活力单位是指在特定条件(25℃，其它为最适条件)下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。

上述方法中，

所述酶解液还包括甘露醇。

上述方法中，

所述甘露醇在所述酶解液中的浓度为0.3-0.7mol/L。

上述方法中，

所述酶解液由甘露醇、BSA、MES、CaCl2·2H₂O、纤维素酶、果胶酶、离析酶和水组成；

所述甘露醇在所述酶解液中的浓度为0.6mol/L；

所述BSA在所述酶解液中的质量分数为0.6％；

所述MES在所述酶解液中的质量分数为0.1％；

所述CaCl₂·2H₂O在所述酶解液中的浓度为0.05mol/L；

所述纤维素酶在所述酶解液中的质量分数为2.0％；

所述果胶酶在所述酶解液中的质量分数为0.5％；

所述离析酶在所述酶解液中的质量分数为0.5％。

上述方法中，

所述收集为离心，所述离心的条件为(17-104)×g离心5min，所述离心的条件具体为67×g离心5min。

上述方法中，

所述酶解的时间为10h。

上述方法中，

所述雷公藤愈伤组织悬浮细胞来源于雷公藤愈伤组织。

上述方法中，

所述1)和所述2)之间还包括过滤的步骤；所述过滤为用灭菌的300目不锈钢细胞筛过滤。

本发明的第二个目的是提供由上述方法分离得到的原生质体。

本发明的第三个目的是提供上述原生质体的新用途。

本发明提供了上述原生质体在外源基因表达中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种外源基因表达的方法。

本发明提供的外源基因表达的方法包括如下步骤：将外源基因转化上述原生质体中，实现外源基因的表达。

上述方法中，所述外源基因为gfp基因。

本发明的第五个目的是提供上述酶解液。

上述酶解液在原生质体分离中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明提供了一种雷公藤原生质体的分离方法。本发明的雷公藤原生质体的分离方法的最佳分离条件是：酶解液配比为2.0％纤维素酶+0.5％果胶酶+0.5％离析酶；甘露醇浓度0.6mol/L，酶解时间10h，67×g转速离心5min。通过实验证明：用本发明的方法提取得到的原生质体经过纯化后，原生质体产量为4.24×10⁵/g FW，活力为94.5％。本发明还通过PEG4000介导转化的方法成功将外源质粒转化到本发明提取的原生质体中并顺利表达，成功的建立了雷公藤悬浮细胞原生质体瞬时转化体系。本发明为深入开展雷公藤的功能基因组学研究奠定了基础，同时也为雷公藤进行基因编辑、亚细胞定位、基因过表达和干扰等研究提供了物质基础。

附图说明

图1为酶解液配比对原生质体产量和活力的影响。图1A为酶解液配比对原生质体产量的影响；图1B为酶解液配比对原生质体活力的影响。

图2为酶解时间对原生质体产量和活力的影响。图2A为酶解时间对原生质体产量的影响；图2B为酶解时间对原生质体活力的影响。

图3为甘露醇浓度对原生质体产量和活力的影响。图3A为甘露醇浓度对原生质体产量的影响；图3B为甘露醇浓度对原生质体活力的影响。

图4为处理转速对原生质体产量和活力的影响。图4A为处理转速对原生质体产量的影响；图4B为处理转速对原生质体活力的影响。

图5为原生质体形态。图5A为可见光下纯化后的原生质体形态；图5B为台盼蓝染色后无活力的原生质体形态。

图6为激光共聚焦扫描显微镜明场下的原生质体及GFP图片。图6A为激光共聚焦扫描显微镜明场下的原生质体；图6B为激光共聚焦扫描显微镜488nm激发光下原生质体的GFP荧光图片；图6C为激光共聚焦扫描显微镜488nm激发光下原生质体叶绿体自发荧光图片；图6D为激光共聚焦扫描显微镜下原生质体GFP荧光与自发荧光叠加图片。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中所用仪器包括：离心机(SIGMA)、激光共聚焦扫描显微镜(VisiTech)、超净工作台、显微镜、恒温培养振荡器，循环水式多用真空泵、电子天平、高温高压灭菌锅。

下述实施例中的W5溶液为0.125mol/L CaCl₂、0.154mol/L NaCl、5mmol/L KCl、2mmol/L MES，KOH调至pH5.6，高温高压灭菌。

下述实施例中的MMG溶液为15mmol/L MgCl₂、0.1％MES、0.4mol/L甘露醇，KOH调至pH5.6，高温高压灭菌。

下述实施例中的PEG溶液为40％PEG4000、0.2mol/L甘露醇、0.1mol/L CaCl₂(现配现用，最多可于4℃保存五天)。

下述实施例中的WI溶液为0.5mol/L甘露醇、4mmol/L MES、20mmol/L KCl，KOH调至pH5.6，高温高压灭菌。

下述实施例中的试剂的购买处和产品目录号如下：纤维素酶(R-10，YAKULT，150703-02)，果胶酶(Y-23，YAKULT)，离析酶(R-10，YAKULT)，甘露醇(D-Mannitol，Solarbio，1126F034)，牛血清白蛋白(BSA，Roche)，吗啉乙磺酸(MES，赛克林，C10035338)，二水合氯化钙(CaCl₂·2H₂O，国药集团化学试剂有限公司，20130130)，聚乙二醇(PEG4000，Solarbio，1226B034)，氯化钠(NaCl，北京现代东方精细化学品有限公司，20140301)，氯化钾(KCl，国药集团化学试剂有限公司，20120925)，磷酸盐缓冲液(PBS，gibco，1760235)，台盼蓝染液(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，5BR00130)。

实施例1、一种雷公藤悬浮细胞原生质体的分离纯化方法及其活性检测

一、雷公藤悬浮细胞的制备

雷公藤悬浮细胞来源于愈伤组织，具有大量的细胞间隙，细胞壁易被酶解，具有生长速度快、次生代谢物积累迅速等优点，是制备原生质体的理想材料。具体制备方法如下：

1、愈伤组织的获得

将雷公藤幼嫩枝条灭菌处理，扦插培育出无菌苗，再取无菌苗的新生叶，切成0.5cm×0.5cm左右小块，接种在含0.5mg/L 2,4-D(北京鼎国昌盛生物技术有限公司，DH101-1)的MS琼脂培养基(Caisson Labs，MSP22-50LT)上，25℃，暗培养诱导形成愈伤组织。

2、愈伤组织的继代培养

选取白色有光泽、质地疏松、长势良好的愈伤组织于0.5mg/L 2,4-D+0.1mg/L KT(北京鼎国昌盛生物技术有限公司，DH135-2)+0.5mg/L IBA(北京鼎国昌盛生物技术有限公司，II172)的MS琼脂培养基上继代培养，25℃，暗培养。继代培养3代以上，选取生长良好、质地疏松、生长情况一致或相似的愈伤组织，用镊子夹成小块，压碎，以每瓶1.0g的愈伤组织量转接入含100mL 0.5mg/L 2,4-D+0.1mg/L KT+0.5mg/L IBA的MS液体培养液的250mL三角瓶中，放于摇床上，25℃，黑暗，120rpm悬浮培养，20天继代一次，获得雷公藤悬浮细胞。

二、原生质体的分离及其活性检测

选取继代培养10-12天的雷公藤悬浮细胞作为原生质体提取材料。采取不同的酶解液配比、甘露醇浓度、酶解时间及处理转速分离雷公藤原生质体并检测原生质体产量和活力，选出最优处理条件参数。具体步骤如下：

1、酶解液配比对原生质体产量和活力的影响

(1)酶解液的配制：将甘露醇、BSA、MES、CaCl₂·2H₂O、纤维素酶、果胶酶、离析酶和超纯水混匀，溶质及其浓度为：0.5mol/L甘露醇、0.6％(质量分数)BSA、0.1％(质量分数)MES、0.05mol/L CaCl₂·2H₂O，KOH调至pH5.6，得到酶解液，根据酶解液中的纤维素酶、果胶酶、离析酶质量分数的不同，将酶解液分为如下5组：

1组：1.5％(质量分数)纤维素酶+0.3％(质量分数)果胶酶+0.5％(质量分数)离析酶；

2组：2.0％(质量分数)纤维素酶+0.3％(质量分数)果胶酶+0.5％(质量分数)离析酶；

3组：2.0％(质量分数)纤维素酶+0.5％(质量分数)果胶酶+0.5％离析酶(质量分数)；

4组：2.0％纤维素酶(质量分数)+0.7％果胶酶(质量分数)+0.5％离析酶(质量分数)；

5组：2.5％纤维素酶(质量分数)+0.3％果胶酶(质量分数)+0.5％离析酶(质量分数)；

将上述5组不同的酶解液分别在55℃水浴锅中活化10min，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，待下一步试验使用。

(2)原生质体的分离

取0.5g雷公藤悬浮细胞，吸干培养基，尽量压碎，按照10mL/g的量分别加入步骤(1)中5组酶解液中酶解，25℃，50rpm黑暗振摇酶解12h；用滴管抽吸悬浮细胞混悬液数次，以促进原生质体的释放；用灭过菌的300目不锈钢细胞筛过滤，得到滤液；滤液在67×g条件下离心5分钟，弃上清，收集原生质体。

(3)原生质体的纯化

向步骤(2)中分离得到的原生质体中加入5ml W5溶液，重悬清洗原生质体，离心5分钟，弃上清，再分别用5ml、2ml的W5溶液各洗涤一次。弃去上清液，加入1ml MMG溶液重悬，即可获得纯化的原生质体。

(4)原生质体的产量和活力检测

原生质体的产量的检测方法为：用MMG溶液将步骤(3)获得的纯化的原生质体稀释5倍，将稀释的原生质体悬浮液滴在血球计数板上。待原生质体将计数室充满，在显微镜下观察并计数(四个大格中的原生质体数目)。每个样品重复计数三次。

每克雷公藤悬浮细胞原生质体产量(个/g FW)计算公式：{原生质体总个数/(4×材料质量)}×稀释倍数×10⁴。

原生质体的活力的检测方法(采用台盼蓝染色法)：用MMG溶液将步骤(3)获得的纯化的原生质体稀释5倍，将配好的台盼蓝染液(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，5BR00130)，按体积比1：10加入到稀释后的原生质体悬浮液中染色，选取4个有代表性的视野进行统计。原生质体活力的计算方法为：未被台盼蓝染色的原生质体占该视野下原生质体总数的百分比。

将得到的原生质体进行产量和活力检测，结果如图1A和图1B。比较1、2、5组，三组的纤维素酶浓度依次增加，其中第二组的原生质体产量和活力最高，分别可以达到1.86×10⁵/g FW和67.8％。纤维素酶浓度过低不能充分解离细胞壁，而纤维素浓度过高则会使细胞膜破裂，影响原生质体活性，故纤维素的最佳浓度为2.0％；比较2、3、4组，三组的果胶酶浓度依次增加，结果显示第四组产量和活力最高，分别可以达到3.08×10⁵/g FW和80.15％，与其他组存在显著性差异，故果胶酶的最佳浓度为0.5％。综上，雷公藤悬浮细胞原生质体分离的最佳酶液配比为2.0％纤维素酶+0.5％果胶酶+0.5％离析酶。

2、酶解时间比对原生质体产量和活力的影响

(1)酶解液的配制：将甘露醇、BSA、MES、CaCl₂·2H₂O、纤维素酶、果胶酶、离析酶和超纯水混匀，溶质及其浓度分别为：0.5mol/L甘露醇、0.6％(质量分数)BSA、0.1％(质量分数)MES、0.05mol/L CaCl₂·2H₂O、2.0％(质量分数)纤维素酶、0.5％(质量分数)果胶酶、0.5％(质量分数)离析酶，KOH调至pH5.6，得到酶解液。将上述酶解液在55℃水浴锅中活化10min，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，待下一步试验使用。

(2)原生质体的分离

取0.5g雷公藤悬浮细胞，吸干培养基，尽量压碎，按照10mL/g的量分别加入步骤(1)中的酶解液中酶解，25℃，50rpm黑暗振摇分别酶解6h、8h、10h、12h、14h和16h；用滴管抽吸悬浮细胞混悬液数次，以促进原生质体的释放；用灭过菌的300目不锈钢细胞筛过滤，得到滤液；滤液在67×g条件下离心5分钟，弃上清，分别收集原生质体。

(3)原生质体的纯化

分别向步骤(2)中分离得到的原生质体中加入5ml W5溶液，重悬清洗原生质体，离心5分钟，弃上清，再分别用5ml、2ml的W5溶液各洗涤一次。弃去上清液，加入1ml MMG溶液重悬，即可获得纯化的原生质体。

(4)原生质体的产量和活力检测

检测方法同步骤1中的(4)。

将得到的原生质体进行产量和活力检测，结果见图2A和图2B。从图中可以看出：随酶解时间的增加，原生质体的产量随之提高，但原生质体的活力在10h时最高，达82.2％。酶解时间过短不能使原生质体完全分离出来，提取效率低，而酶解时间过长，细胞压力过大，容易破碎，镜下检测死细胞和碎片增多，活细胞所占比例小，不利于后续实验的开展。因此，10h为雷公藤能悬浮细胞原生质体的最佳酶解时间。

3、甘露醇浓度比对原生质体产量和活力的影响

(1)酶解液的配制：将甘露醇、BSA、MES、CaCl₂·2H₂O、纤维素酶、果胶酶、离析酶和超纯水混匀，溶质及其浓度分别为：0.6％(质量分数)BSA、0.1％(质量分数)MES、0.05mol/L CaCl₂·2H₂O、2.0％(质量分数)纤维素酶、0.5％(质量分数)果胶酶、0.5％(质量分数)离析酶，KOH调至pH5.6，得到酶解液，根据酶解液中甘露醇浓度的不同分为如下5组：

1组：0.3mol/L甘露醇；

2组：0.4mol/L甘露醇；

3组：0.5mol/L甘露醇；

4组：0.5mol/L甘露醇；

5组：0.7mol/L甘露醇；

将上述酶解液分别在55℃水浴锅中活化10min，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，待下一步试验使用。

(2)原生质体的分离

取0.5g雷公藤悬浮细胞，吸干培养基，尽量压碎，按照10mL/g的量分别加入步骤(1)中5组酶解液中酶解，25℃，50rpm黑暗振摇酶解12h；用滴管抽吸悬浮细胞混悬液数次，以促进原生质体的释放；用灭过菌的300目不锈钢细胞筛过滤，得到滤液；滤液在67×g条件下离心5分钟，弃上清，收集原生质体。

(3)原生质体的纯化

向步骤(2)中分离得到的原生质体中加入5ml W5溶液，重悬清洗原生质体，离心5分钟，弃上清，再分别用5ml、2ml的W5溶液各洗涤一次。弃去上清液，加入1ml MMG溶液重悬，即可获得纯化的原生质体。

(4)原生质体的产量和活力检测

检测方法同步骤1中的(4)。

将得到的原生质体进行产量和活力检测，结果见3A和图3B。由图可见，当甘露醇浓度为0.5mol/L时原生质体产量最高，而此时活力却不是最高的，当甘露醇浓度为0.6mol/L时虽然产量比0.5mol/L稍低，但此时原生质体活力最高。溶液渗透压低于原生质体的渗透压会导致细胞胀破死亡；当甘露醇浓度过高时原生质体失水皱缩，且不利于原生质体的释放。虽然0.5mol/L与0.6mol/L两个处理组中存活的原生质体总数相近，但由于具存活的原生质体才能进行瞬时转化，相较而言，甘露醇浓度为0.6mol/L是更有利于下一步实验的开展。所以，分离原生质体的最佳甘露醇浓度为0.6mol/L。

4、处理转速对原生质体产量和活力的影响

(1)酶解液的配制：将甘露醇、BSA、MES、CaCl₂·2H₂O、纤维素酶、果胶酶、离析酶和超纯水混匀，溶质及其浓度分别为：0.5mol/L甘露醇、0.6％(质量分数)BSA、0.1％(质量分数)MES、0.05mol/L CaCl₂·2H₂O、2.0％(质量分数)纤维素酶、0.5％(质量分数)果胶酶、0.5％(质量分数)离析酶，KOH调至pH5.6，得到酶解液。将上述酶解液在55℃水浴锅中活化10min，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，待下一步试验使用。

(2)原生质体的分离

取0.5g雷公藤悬浮细胞，吸干培养基，尽量压碎，按照10mL/g的量分别加入步骤(1)中的酶解液中酶解，25℃，50rpm黑暗振摇酶解12h；用滴管抽吸悬浮细胞混悬液数次，以促进原生质体的释放；用灭过菌的300目不锈钢细胞筛过滤，得到滤液；将滤液在不同处理转速：17×g、37×g、67×g、104×g条件下离心5分钟，弃上清，分别收集原生质体。

(3)原生质体的纯化

分别向步骤(2)中分离得到的原生质体中加入5ml W5溶液，重悬清洗原生质体，离心5分钟，弃上清，再分别用5ml、2ml的W5溶液各洗涤一次。弃去上清液，加入1ml MMG溶液重悬，即可获得纯化的原生质体。

(4)原生质体的产量和活力检测

检测方法同步骤1中的(4)。

将得到的原生质体进行产量和活力检测，结果见图4A和图4B。比较四组数据，当转速为67×g时产量可以达到2.17×10⁵g/FW；活力最高可达78.4％，产量和活力均为最高水平。当转速过低时不利于原生质体的沉降，碎片和原生质体不能得到有效分离；当转速过高时，会对原生质体造成机械损伤，同样不利于原生质体的分离纯化。综上，分离纯化原生质体的最佳转速为67×g。

三、原生质体分离纯化方法的有效性验证

1、酶解液的配制：将甘露醇、BSA、MES、CaCl₂·2H₂O、纤维素酶、果胶酶、离析酶和超纯水混匀，溶质及其浓度分别为：0.6mol/L甘露醇、0.6％(质量分数)BSA、0.1％(质量分数)MES、0.05mol/L CaCl₂·2H₂O、2.0％(质量分数)纤维素酶、0.5％(质量分数)果胶酶、0.5％(质量分数)离析酶，KOH调至pH5.6，得到酶解液。将上述酶解液在55℃水浴锅中活化10min，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，待下一步试验使用。

2、原生质体的分离

取0.5g雷公藤悬浮细胞，吸干培养基，尽量压碎，按照10mL/g的量加入步骤1中的酶解液中酶解，25℃，50rpm黑暗振摇酶解10h；用滴管抽吸悬浮细胞混悬液数次，以促进原生质体的释放；用灭过菌的300目不锈钢细胞筛过滤，得到滤液；滤液在67×g条件下离心5分钟，弃上清，收集原生质体。

3、原生质体的纯化

向步骤2中分离得到的原生质体中加入5ml W5溶液，重悬清洗原生质体，离心5分钟，弃上清，再分别用5ml、2ml的W5溶液各洗涤一次。弃去上清液，加入1ml MMG溶液重悬，即可获得纯化的原生质体。

4、原生质体的产量和活力检测

检测方法同步骤二的1中的(4)。

获得的原生质体产量高达4.24×10⁵/g FW，活力可达94.5％，原生质体形态及台盼蓝染色后的原生质体形态见图5A和图5B。

实施例2、雷公藤悬浮细胞原生质体在外源基因瞬时转化表达中的应用

利用PEG介导转化法对雷公藤悬浮细胞原生质体的瞬时转化进行了研究，具体步骤如下：

1、将实施例一的步骤三中获得的纯化的原生质体的浓度调到约为5×10⁵个/mL，得到原生质体溶液；

2、将200μl的原生质体溶液、20μg的E3025质粒(E3025质粒自带GFP编码序列，E3025质粒的核苷酸序列如序列1所示)和220μL PEG溶液轻敲混匀，得到转化混合物，在黑暗条件下诱导转化混合物20min，得到转化混合液；

3、室温下用880μL W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应。67×g离心2min，收集沉淀，去上清；

4、用W5溶液重复清洗步骤3收集的沉淀一次，收集沉淀，去上清；

5、用1mL WI溶液轻柔重悬步骤4收集的沉淀于多孔组织培养皿中，25℃黑暗静置培养。

6、18h后取出，67×g离心2min，去掉部分上清，对其进行浓缩，取适量制片，激光共聚焦扫描显微镜下观察GFP表达情况。

结果如图6A、图6B、图6C和图6D。由于原生质体来源于黑暗培养的雷公藤悬浮细胞，因此其细胞中不含叶绿素，激光共聚焦扫描显微镜488nm激发光下只能观察到GFP绿色荧光，证明编码GFP的E3025质粒成功转化到原生质体中，并顺利表达，雷公藤悬浮细胞原生质体瞬时转化体系成功建立。

序列表

<110>首都医科大学

<120>一种雷公藤原生质体的分离及瞬时转化方法

<160>1

<210>1

<211>4612bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccac ccataatacc cataatagct 420

gtttgccaac cggtcaacat gtggagcacg acacacttgt ctactccaaa aatatcaaag 480

atacagtctc agaagaccaa agggcaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa 540

acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg 600

aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct 660

ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag 720

acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga taacatggtg gagcacgaca 780

cacttgtcta ctccaaaaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg gcaattgaga 840

cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc 900

actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat cattgcgata 960

aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac 1020

ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt 1080

gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc 1140

cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac gtcgagagtt ctcaacacaa 1200

catatacaaa acaaacgaat ctcaagcaat caagcattct acttctattg cagcaattta 1260

aatcatttct tttaaagcaa aagcaatttt ctgaaaattt tcaccattta cgaacgatag 1320

ccatggtccg gactcagatc tcgagctcaa gcttcgaatt ctgcagtcga cggtaccgcg 1380

ggcccgggat ggtagatctg actagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa 1440

ttcttgttga attagatggt gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg 1500

aaggtgatgc aacatacgga aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac 1560

ctgttccgtg gccaacactt gtcactactt tctcttatgg tgttcaatgc ttttcaagat 1620

acccagatca tatgaagcgg cacgacttct tcaagagcgc catgcctgag ggatacgtgc 1680

aggagaggac catcttcttc aaggacgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt 1740

ttgagggaga caccctcgtc aacaggatcg agcttaaggg aatcgatttc aaggaggacg 1800

gaaacatcct cggccacaag ttggaataca actacaactc ccacaacgta tacatcatgg 1860

ccgacaagca aaagaacggc atcaaagcca acttcaagac ccgccacaac atcgaagacg 1920

gcggcgtgca actcgctgat cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc 1980

ttttaccaga caaccattac ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa 2040

agagagacca catggtcctt cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg 2100

atgaactata caaagctagc cactaatcta gagtccgcaa aaatcaccag tctctctcta 2160

caaatctatc tctctctatt tttctccaga ataatgtgtg agtagttccc agataaggga 2220

attagggttc ttatagggtt tcgctcatgt gttgagcata taagaaaccc ttagtatgta 2280

tttgtatttg taaaatactt ctatcaataa aatttctaat tcctaaaacc aaaatccagt 2340

gacgcggccg cacccataat acccataata gctgtttgcc agtaatcatg gtcatagctg 2400

tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata 2460

aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca 2520

ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc 2580

gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg 2640

cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 2700

tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 2760

aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 2820

catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 2880

caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 2940

ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt 3000

aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 3060

gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 3120

cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 3180

ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta 3240

tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 3300

tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 3360

cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 3420

tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc 3480

tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact 3540

tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 3600

cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta 3660

ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta 3720

tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc 3780

gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat 3840

agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt 3900

atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg 3960

tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca 4020

gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta 4080

agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg 4140

cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact 4200

ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg 4260

ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt 4320

actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga 4380

ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 4440

atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 4500

caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt 4560

attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tc 4612