一株地芽孢杆菌及其应用的利记博彩app

本发明涉及微生物技术领域，特别是一种地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)JAAS-YTC01及其在降解羽毛中的应用。

背景技术：

角蛋白来源于外胚层细胞，是一类不溶于水、稀酸或稀碱溶液、机械强度很高、化学性质稳定旳硬质蛋白，广泛存在于发、毛、鳞、羽、甲、蹄、角、爪、喙、丝及其他表皮结构中。我国每年的羽毛总量超过100万吨，而且随着集约化养殖的快速发展，产量逐年增加。羽毛中高达90％的成分是角蛋白。羽毛营养成分分析表明，氨基酸含量在70％以上，是潜在的优良蛋白质资源。但是角蛋白结构中的二硫键使其具有抗降解性，不为多数蛋白酶如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶等降解。另一方面每年世界范围内几百万吨的废弃羽毛可导致环境污染的危害，蛋白质资源也存在浪费问题，特别是我国蛋白资源不足，对其加工利用更有实际意义。

由于角蛋白多肽链间二硫键，盐键，氢键的广泛存在，使角蛋白的结构非常稳定，不溶于水，常用的蛋白酶，如胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，胃蛋白酶，都很难降解角蛋白。传统的降解方法为高压蒸汽和酸碱蒸煮法，高压处理对角蛋白的降解程度有限，还会破坏一些具有营养价值的氨基酸，如赖氨酸，蛋氨酸和色氨酸，并产生一些动物不需要的氨基酸，如硫化双丙氨酸；酸碱蒸煮法同样会破坏掉一些具有营养价的氨基酸，并且水解过程中产生的废水还会对环境造成污染。利用角蛋白酶降解羽毛角蛋白能有效解决上述问题，然而目前市面上还没有大量商业角蛋白酶出售。

目前已分离到能降解角蛋白的微生物有30余种，分别属于细菌、放线菌和真菌属。但已知的产角蛋白酶的微生物大多属于常温菌，酶反应温度一般在40-60℃之间，产生的角蛋白酶存在热稳定性差等缺点，且大多数微生物不能够直接利用未经处理的羽毛。如何周凤(“高效羽毛降解菌株的鉴定及发酵条件的优化”，何周凤等，基因组学与应用生物学，2015年)等对产角蛋白酶的枯草芽孢杆菌产酶条件优化之后，酶活力为23.6U/ml,最适酶反应的温度为37℃；地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis BBE11-1)(“地衣芽胞杆菌来源角蛋白酶N端对活力及其热稳定性的影响”，刘伯宏等，微生物学通报，2014)的蛋白酶改造前60℃半衰期为9min，刘伯宏等人通过角蛋白酶N端前5个氨基酸进行分段缺失，并通过序列比对将N端的前5个氨基酸替换为来源于Thermoactinomyces vulgaris的嗜热蛋白酶的N端，将野生型和突变体角蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中进行表达，60℃半衰期提高到20min,但是酶活降低了70％。嗜热细菌在高温条件下表现出独特的生存适应能力和特殊的代谢产物，其产生的酶在高温条件下具有很高的活性和热稳定性，且不易污染，同时热稳定性较好的酶可以在相对较高的温度下进行反应，有利于提高酶的反应速率、减少其他微生物的污染以及促进酶分子充分渗透到底物中进行反应。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明由高温菌出发，筛选到一株能产高温角蛋白酶的地芽孢杆菌，能够在60℃下48小时候完全降解羽毛，该菌产生的角蛋白酶同时具有良好的热稳定性，本发明是这样实现的：

一株地芽孢杆菌(Geobacillus sp)JAAS-YTC01，其保藏编号为CGMCCNO.12740，保藏日期为2016年7月6日；该地芽孢杆菌菌体呈杆状，长2-3μm，革兰氏染色呈阳性，菌落大小中等，表面湿润，边缘整齐；该菌16S rRNA如SEQ ID NO.1所示。

一种保藏编号为CGMCCNO.12740的地芽孢杆菌在制备角蛋白酶液中的应用，具体步骤如下：将所述地芽孢杆菌按质量体积比2％接种于发酵培养基中，于60℃，180rpm搅拌培养24-72h后，过滤或离心，所得滤液或上清液即为角蛋白酶液；

所述发酵培养基配方为：每1000mL发酵培养基中，含蔗糖10g、硫酸铵4g、羽毛10g、NaCl0.5g、K₂HPO₄ 0.4g、KH₂PO₄ 0.3g、MgCl₂·6H₂O 0.1g、pH7.2-7.4。

一种保藏编号为CGMCCNO.12740的地芽孢杆菌产角蛋白酶在降解角蛋白中的应用，具体方法如下：

将所述地芽孢杆菌按质量体积比2％(W/V，g/l)接种于发酵培养基中，调整pH＝8.5,于70℃培养24-72h，即可降解角蛋白；

所述发酵培养基配方为：每1000mL发酵培养基中，含蔗糖10g、硫酸铵4g、羽毛10g、NaCl0.5g、K₂HPO4 0.4g、KH₂PO₄ 0.3g、MgCl₂·6H₂O 0.1g、pH7.2-7.4。

优选的，所述保藏编号为CGMCCNO.12740的地芽孢杆菌在降解角蛋白中的应用，所述角蛋白是指鸡的羽毛，所述发酵培养基中的羽毛为鸡的羽毛。

本发明中，将以角蛋白为底物，每1min催化分解角蛋白生成1μg酪氨酸所需要的酶量定义为一个酶活单位。

酶活检测方法为取稀释5-10倍的粗酶液1ml，加入1ml 1％的角蛋白，在60℃下进行酶反应15min后加入2ml 0.4M的TCA终止酶活，4000rpm离心10min。以先加入2ml 0.4M TCA再加入1％底物作为空白对照。取1ml上清液，加入5ml 0.4M的Na₂CO₃溶液，再加入1ml福林酚试剂，40℃，保温20min，测定660nm的吸光度。

本发明中，将保藏编号为CGMCCNO.12740的地芽孢杆菌JAAS-YTC01接种于发酵培养基中，接种量2％，(W/V，g/l)，60℃，150-200rpm搅拌培养48小时后，发酵瓶中整根羽毛被降解，终止发酵，过滤离心，得到角蛋白酶液，测的角蛋白最高酶活为10.4U/ml。

本发明所提供的保藏号为CGMCCNO.12740的地芽孢杆菌JAAS-YTC01，该菌产生的角蛋白酶最适酶反应温度为70℃，最适pH为8.5，酶液在60℃中保温1h，酶活仍能达到初始酶活的86.7％，与现有菌种相比，具有较高的热稳定性；该菌株可直接降解未经任何处理的羽毛废弃物，降解速度快，所产生的角蛋白酶具有耐高温和热稳定性好的特点，适于大规模推广应用。

附图说明

图1为地芽孢杆菌JAAs-YTC01菌落形态示意图。

图2为地芽孢杆菌JAAs-YTC01革兰氏染色结果示意图。

图3为地芽孢杆菌JAAs-YTC01菌体电镜图。

图4为地芽孢杆菌JAAs-YTC01角蛋白酶最适反应温度柱形示意图。

图5为地芽孢杆菌JAAs-YTC01热稳定性曲线图。

图6为地芽孢杆菌JAAs-YTC01角蛋白酶最适反应pH曲线图。

图7为地芽孢杆菌JAAs-YTC01发酵培养48h对羽毛的降解效果示意图。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明的技术方案进一步进行说明。

实施例中所涉及的培养基：

富集培养基(1000ml)即牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl 5g，加水定容至1000mL,pH自然；

分离培养基(1000ml)：将4g干酪素溶解于20mL 0.1mol/L NaOH溶液中，再加入20g琼脂，再加水定容至1000mL；

筛选培养基(1000ml)：羽毛10g、NaCl 0.5g、K₂HPO₄ 0.4g、KH₂PO₄ 0.3g、MgCl₂·6H₂O 0.1g、酵母粉0.1g，加入定容至1000mL，pH7.2-7.4；

种子培养基(1000ml)：NaCl 5g、牛肉膏5g、蛋白胨10g、酵母粉2g,余量为水，pH7.2-7.4；斜面培养基(1000ml)：NaCl 5g、牛肉膏5g、蛋白胨10g、酵母粉2g，余量为水，pH7.2-7.4；发酵基础培养基(1000ml)：羽毛10g、NaCl 0.5g、K₂HPO₄ 0.4g、KH₂PO₄ 0.3g、MgCl₂·6H₂O 0.1g、pH7.2-7.4；装液量50ml/250ml，60℃，180rpm摇瓶发酵48h；

发酵培养基(1000ml)：蔗糖10g、(NH₄)₂SO₄ 4g、羽毛10g，MgCl₂·6H₂O 0.1g，NaCl 0.5g,K₂HPO₄，0.3g KH₂PO₄ 0.4g,pH7.2-7.4，装液量50ml/250ml。

上述培养基中羽毛为鸡毛(南京鸡屠宰市场收集)。

实施例中所涉及的核苷酸序列：

SEQ ID NO.1：

SEQ ID NO.2(27F)：agagtttgat cctggctcag；

SEQ ID NO.3(492R)：ggttaccttg ttacgactt；

实施例1菌株选育

1、筛选菌种

从畜禽粪便的高温堆肥(南京宁粮有机肥厂)取样，首先从每份样品中取一定样品，用无菌生理盐水将样品打散；梯度稀释后，接种到富集培养基中60-80℃富集继代培养2-3天；平板划线分离，获取高温菌，将高温菌点种到分离培养基平板上，筛选有透明水解圈的菌株，进而将这些菌株接种到筛选培养基中，观察羽毛降解情况，最后筛选出一株有降解羽毛能力的菌株，将该菌株接种到斜面固体培养基中待用。

2、菌种鉴定

A)将步骤1筛选到的菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上划线，60℃培养24h，获得单菌落(如图1所示)，菌落大小中等，表面湿润，边缘整齐；

对该菌进行革兰氏染色，发现呈阳性(如图2所示)；液体培养后收集菌体，戊二醛法固定后，电镜观察菌体形态，并拍摄照片如图3所示，观测该菌体呈杆状，菌体长度为2-3μm，；利用细菌基因组DNA试剂盒(Omega公司)提取该菌株基因组DNA作为模板，以27F和1492R分别作为上下游引物，进行16S rRNA基因扩增：

PCR反应体系：Premix Taq(Takara)25μl，模板0.1-2μg，上游引物10-100pmol，下游引物10-100pmol，双蒸水补足至50μl；

PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；72℃延伸5min。

16S rRNA扩增产物交由上海生工生物工程有限公司测序，测序结果如SEQ ID NO.1所示，将测序结果在NCBI数据库进行比对，并对其进行分子进化系统发育树分析，鉴定其为地芽孢杆菌属(Geobacillus sp)，申请人将其自命名为JAAS-YTC01,于2016年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编100101，保藏编号为：CGMCC NO.12740。

实施例2菌株JAAS-YTC01发酵产酶条件优化

采用单因素试验考察添加不同的碳源(1％)(W/V，g/l)和不同氮源以及不同浓度羽毛的添加量对实施例1获得的菌株JAAS-YTC01角蛋白酶产量影响。

a最适碳源的筛选

在发酵基础培养基中，分别加入1％(W/V，g/l)的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、麸皮、玉米粉，于60℃，180rpm摇瓶发酵48h后测定酶活。结果表明加入蔗糖能够增加角蛋白酶产量。

b最适氮源的筛选

在发酵基础培养基中，分别加入1％(W/V)的酵母粉、豆粕，0.4％(W/V)的脲素、硫酸铵，于60℃，180rpm摇瓶发酵48h后测定酶活。结果表明加入硫酸铵能够增加角蛋白酶产量。

c最适羽毛浓度的确定

在发酵基础培养基中，加入以上筛选出的碳源和氮源，设定羽毛的浓度1％(W/V)、2.5％、5％、10％、20％。、60℃，180rpm摇瓶发酵48h后测定酶活。结果表明最适合的羽毛浓度为10％。

最终确定优化后的发酵培养基为：蔗糖10g、硫酸铵4g、羽毛10g、NaCl 0.5g、K₂HPO4 0.4g、KH₂PO₄ 0.3g、MgCl 6H₂O 0.1g、pH7.2-7.4；装液量50ml/250ml，此条件下产生的角蛋白酶活为12.3U/ml。

实施例3菌株JAAS-YTC01角蛋白酶的最适反应温度、最适pH及热稳定性

将实施例1筛选到的菌株JAAS-YTC01以2％(W/V，g/l)的接种量接种到发酵培养基中，180rpm搅拌培养48h后，8000rpm离心10min，所得上清液即为角蛋白酶液。

取稀释5-10倍的角蛋白酶液1ml，加入1ml 1％的角蛋白，在60℃下进行酶反应15min后加入2ml 0.4M的TCA终止酶活，4000rpm离心10min。以先加入2ml 0.4M TCA再加入1％底物作为空白对照。取1ml上清液，加入5ml 0.4M的Na₂CO₃溶液，再加入1ml福林酚试剂，40℃，保温20min，测定660nm的吸光度。

以角蛋白为底物，每1min催化分解角蛋白生成1μg酪氨酸所需要的酶量定义为一个酶活单位。

1、最适酶反应温度和热稳定性

在相同p H值的条件下，测定50-80℃温度范围内的酶活，以酶活最高值为100％来计算相对酶活。检测结果如图4所示，最适酶反应温度为70℃。

将酶液在不同温度条件下保持20min、40min、60min、80min，测定残留酶的活性，以最高酶活为100％来评价酶的热稳定性。结果见图5所示，最适酶反应温度70℃，该酶50，60℃相对稳定，60℃下保持60min，酶活还能保留86.8％，说明该酶的热稳定性好。

2、最适酶反应pH

在相同温度的条件下，测定酶液在浓度为50mmol·l^-1的不同pH缓冲体系:磷酸缓冲液(pH7.0-7.5),Tris-Cl缓冲液(pH7.5-9.0)，甘氨酸氢氧化钠缓冲液(pH9.0-10.5)下的酶活，以酶活最高值为100％来计算相对活性，确定角蛋白酶的最适pH值。结果见图6所示，最适酶反应pH为8.5，属于碱性角蛋白酶。

实施例4羽毛降解实验

本实施例中的羽毛为鸡毛。

将实施例1获得菌株JAAS-YTC01以2％的接种量接入发酵培养基中(装液量50ml/250ml)，70℃，pH＝8.5的条件下培养24-72h，发酵观察羽毛降解现象。

结果如图7所示，发酵前如图7A，发酵12h左右时，羽毛主梗上的细小毛绒脱落，培养基渐渐浑浊；发酵进行到40h时，培养基浑浊，不透光，羽毛大部分被降解，仅余部分主梗；48h后，培养基中羽毛主梗也被降解(图7B)。

发酵48h后培养基过滤液中17种游离氨基酸和总氨基酸含量增加，具体结果见表1：

表1发酵前后培养基中游离氨基酸含量

本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一株地芽孢杆菌及其应用

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1519

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60

ggactggatt ggagcttgct ctgattcggt cagcggcgga cgggtgagta acacgtgggc 120

aacctgcccg caagaccggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg ataacaccga 180

agaccgcatg gtctttggtt gaaaggcggc ctttggctgt cacttgcgga tgggcccgcg 240

gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggcg acgatgcgta gccggcctga 300

gagggtgacc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt 360

agggaatctt ccgcaatggg cgaaagcctg acggagcgac gccgcgtgag cgaagaaggc 420

cttcgggtcg taaagctctg ttgtgaggga cgaaggagcg ccgttcgaag agggcggcgc 480

ggtgacggta cctcacgagg aagccccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 540

tagggggcga gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagcg cgcgcaggcg gttccttaag 600

tctgatgtga aagcccacgg ctcaaccgtg gagggtcatt ggaaactggg ggacttgagt 660

gcaggagagg agagcggaat tccacgtgta gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac 720

accagtggcg aaggcggctc tctggcctgc aactgacgct gaggcgcgaa agcgtgggga 780

gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttaga 840

ggggtcacac cctttagtgc tgcagctaac gcgataagca ctccgcctgg ggagtacggc 900

cgcaaggctg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt 960

taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tcccctgaca acccaagaga 1020

ttgggcgttc ccccttcggg gggacagggt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg 1080

tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac cctcgcctct agttgccagc 1140

attcggttgg gcactctaga gggactgccg gcgacaagtc ggaggaaggt ggggatgacg 1200

tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatggg cggtacaaag 1260

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<212> DNA

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