三羟基咪唑‑荧光素pH荧光探针及其制备方法与流程

本发明涉及一种三羟基咪唑-荧光素pH荧光探针及其制备方法。

背景技术：

pH值是生物体的一个重要指标，特定的pH值在很多生理、病理过程中起着十分重要的作用。细胞内的pH在许多生理、病理过程中起着重要的作用。酸性或碱性过强会引起细胞功能紊乱，导致心、肺病变或神经类疾病，严重时甚至会有生命危险。因此监测细胞内pH值的变化可以为研究生理和病理过程提供重要信息。大部分文献报的荧光素类pH探针多以罗丹明B为主体，而且此类的pH探针水溶性很差，这就大大限制了其应用范围。2015年，报道了一种乙酰基链接的罗丹明B肼-1-苯基哌嗪pH探针（The Journal of Biological and Chemical Luminescence）的31期的865–870页公开的文章（Sensitive detection of strong acidic condition by a novel rhodamine-based fluorescent pH chemosensor），此探针的测试液乙醇与水的体积比为1:1，有机溶剂体积分数占50%，pH在1.75-2.6的范围内随着pH值增大，荧光值逐步降低，且呈现良好的线性关系。

2014年,报道了一种名为碳碳双键链接的荧光素肼-3,4二羟基苄基的荧光探针（Dyes and Pigments）的107期的127-132页公开的文章（A sensitive and selective fluorescence probe based fluorescein for detection of hypochlorous acid and its application for biological imaging）。此探针的测试液二甲基亚砜与水的体积比为20:1，有机溶剂体积分数仅占5%。研究发现此化合物含有四个羟基，这就大大增加了其水溶性。

2016年，报道了一类苯并咪唑pH探针（Dyes and Pigments）的12期的165-169页公开的文章（Benzimidazole-BODIPY as optical and fluorometric pH sensor）Stokes'位移仅为15 nm。在pH为3.05-8.09的范围内，随着pH值得增大荧光值逐渐降低。

据文献报道的pH荧光探针，多羟基咪唑-荧光素具有以下优点：

1、荧光素在结构上含两个羟基，若以荧光素为荧光主体，可以提高探针的水溶性。

2、以荧光素为信号体的分子探针荧光发射波长可达550 nm以上，可以实现荧光变化的“裸眼”观测。如果将荧光素和咪唑有机结合起来不仅可以克服咪唑自身缺点，还可以将大大提高其应用价值。

技术实现要素：

本发明是要解决现有的pH荧光探针水溶性差，咪唑类化合物自身的荧光强度较低，与受体作用后荧光发射波长没有太大变化，Stokes 位移变化较小的问题，而提供三羟基咪唑-荧光素pH荧光探针及其制备方法。

本发明的三羟基咪唑-荧光素pH荧光探针的结构式为：

上述三羟基咪唑-荧光素pH荧光探针的制备方法，按以下步骤进行：

一、中间体化合物的合成：

将菲醌、5-硝基水杨醛、苯胺、乙酸铵按照1 : 1.0~2.0 : 1.0~2.0 : 2~5物质的量比加入到反应器中，再加入20.0~40.0 ml冰乙酸，升温至80~130℃并搅拌4~12 h后，冷却至室温，向反应器中加入水，再用碱性溶液（质量分数为30~40%氢氧化钠溶液）调pH值至8～10，抽滤，收集黄色固体，干燥。乙酸乙酯重结晶，经抽滤、干燥，得到土黄色固体（2-羟基-3-硝基）苯基菲并咪唑，中间体化合物。

二、中间体化合物的合成：

称取2.0 mmol中间体化合物和 0.08~0.22 g 雷尼镍加入到反应器中，再加入乙醇作为溶剂，通入氮气保护，在25~30℃ 下搅拌，滴加5.0~12.0 mL质量百分浓度为80%的水合肼溶液，滴加完毕后，升温至50~80℃，反应5~10 h，冷却至室温，抽滤，并用大量乙酸乙酯洗涤，收集滤液，浓缩，得到棕色固体（2-羟基-3-胺基）苯基菲并咪唑，中间体化合物。

三、中间体化合物的合成：

将3.0 g荧光素加入到反应器中，加入3.0~8.0 ml甲醇溶液，加入40%~60%的氢氧化钠溶液，冷至50~60℃，缓慢滴加8.0~16.0 ml氯仿，搅拌3~12 h，停止反应，冷至25~30℃。加入酸性溶液（质量分数为50~70%醋酸溶液），调至pH值为4~6，抽滤，收集褐色固体，干燥，柱分离。得到浅黄色固体，荧光素单醛，中间体化合物。

四、pH荧光探针的合成：

按照1:1~3物质的量比称取中间体化合物和中间体化合物，加入到反应器中，再加入酸性介质为溶剂，25~30℃下搅拌反应4~8 h，停止反应，加水淬灭，再用碱性溶液调pH值至6～10，抽滤，水洗滤饼至中性，干燥，乙酸乙酯重结晶，得到褐色固体，三羟基咪唑-荧光素的pH荧光探针。

步骤一中碱性介质可以是质量分数为30~40%的氢氧化钠溶液、质量分数为50~60%的碳酸钠溶液、质量分数为50~70%的碳酸氢钠溶液、质量分数为40~55%的碳酸钾溶液、质量分数为48~80%的碳酸氢钾溶液、质量分数为30~40%的氢氧化钾溶液。三中所述的酸性介质可以是质量分数为98%的浓硫酸、质量分数为36~37%的浓盐酸、质量分数为50~70%冰乙酸、质量分数为40~50%磷酸、质量分数为30~60%的甲酸、质量分数为10~30%的酸性离子液体。

本发明的合成过程如下式子所示：

中间体化合物I

中间体化合物

中间体化合物

三羟基咪唑-荧光素

本发明提供了一种具有良好水溶性，在pH值为6.5~8.0的范围内，具有高选择性、响应灵敏的三羟基咪唑-荧光素pH荧光探针。该pH荧光探针在pH值为6.5~8.0的范围内具有良好的线性关系，而且不受K⁺、Ba²⁺、Ca²⁺、Na²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Cr³⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、Ag⁺、Al³⁺、Fe³⁺和Hg²⁺；I^-、Cl^-、Br^-、CO₃^2-、HCO₃^-、SO₄^2-、NO^2-、AcO^-、H₂PO₄^-、HPO₄^2-、BrO₃^-、NO₃^-、SO₃^2-、HSO₃^2-、F^-、SCN^-等其他离子的干扰，结构稳定，用于pH值的检验，方便稳定。

附图说明

图1是试验1制备的三羟基咪唑-荧光素的pH荧光探针在DMF/HEPES缓冲溶液 (v/v= 1/9，pH = 2~12) 体系中的紫外光谱图，横坐标为波长，纵坐标为吸光度。

图2是试验1制备的三羟基咪唑-荧光素为pH荧光探针在DMF/HEPES缓冲溶液 (v/v= 1/9，pH = 6.5~7.9)，λ= 488 nm处的吸光度线性关系图,横坐标为pH值，纵坐标为吸光度

图3是试验1制备的三羟基咪唑-荧光素为pH荧光探针在DMF/HEPES缓冲溶液 (v/v = 1/9) 在不同pH下，λ = 488 nm处的吸光度与此波长下最大吸光度之比A/A_max。当A/A_max = 0.5时，根据公式pK_a= pH ± lg ((A_max-A)/(A-A_min))，计算出pK_a= 6.6319或pK_a= 6.9680，横坐标为pH值，纵坐标为A/A_max。

图4是试验1制备的三羟基咪唑-荧光素为pH荧光探针在DMF/HEPES缓冲溶液 (v/v= 1/9，pH = 2~12，λ_ex = 488 nm，λ_em = 520 nm，狭缝宽度为2)在不同的pH条件下的荧光发射光谱，横坐标为pH值，纵坐标为荧光强度。

图5是试验1制备的三羟基咪唑-荧光素pH荧光探针在DMF/HEPES缓冲溶液 (v/v = 1/9，pH = 6.5~8.0，λ_ex = 488 nm，λ_em = 520 nm，狭缝宽度为2)，在λ=525 nm处的荧光值线性关系图，横坐标为pH值，纵坐标为荧光强度。

图6是试验1制备的三羟基咪唑-荧光素pH荧光探针在DMF/HEPES缓冲溶液 (v/v = 1/9，pH = 2~12，λ_ex = 488 nm，λ_em = 520 nm，狭缝宽度为2)，在λ = 525 nm处的荧光强度与此波长下最大荧光强度之比I/I_max。当I/I_max = 0.5时，根据公式pK_{a =} pH ± lg((I_max-I)/(I-I_min))，计算出pK_a= 7.0806或pK_a= 6.9193，横坐标为pH值，纵坐标为I/I_max。

图7是试验1制备的三羟基咪唑-荧光素pH荧光探针在DMF/HEPES缓冲溶液 (v/v = 1/9，λ_ex = 488 nm，λ_em = 520 nm，狭缝宽度为2)，在pH = 9.1和pH = 2之间的荧光可逆光谱图，横坐标为循环次数，纵坐标为荧光强度。

图8是试验1制备的三羟基咪唑-荧光素pH荧光探针在DMF/HEPES缓冲溶液 (v/v = 1/9，pH=9.1，λ_ex = 488 nm，λ_em = 520 nm，狭缝宽度为2)，阴离子对三羟基咪唑-荧光素pH荧光探针干扰的荧光发射光谱图，横坐标为阴离子，纵坐标为荧光强度。

图9是试验1制备的三羟基咪唑-荧光素pH荧光探针在DMF/HEPES缓冲溶液 (v/v = 1/9，pH=2，λ_ex = 488 nm，λ_em = 520 nm，狭缝宽度为2)，阴离子对三羟基咪唑-荧光素pH荧光探针干扰的荧光发射光谱图，横坐标为阴离子，纵坐标为荧光强度。

图10是试验1制备的三羟基咪唑-荧光素pH荧光探针在DMF/HEPES缓冲溶液 (v/v= 1/9，pH = 2~12，λ_ex = 488 nm，λ_em = 520 nm，狭缝宽度为2)，在pH = 9.1, pH = 7.0 ,pH = 2.0 三个不同pH条件下的时间响应及时间稳定荧光光谱图，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的三羟基咪唑-荧光素pH荧光探针的结构式为：

具体实施方式二：具体实施方式二的三羟基咪唑-荧光素pH荧光探针的制备方法，按以下步骤进行：

一、中间体化合物的合成：

将菲醌、5-硝基水杨醛、苯胺、乙酸铵按照1 : 1.0~2.0 : 1.0~2.0 : 2~5物质的量比加入到反应器中，再加入20~40 ml冰乙酸，升温至80~130℃并搅拌4 ~12 h后，冷却至室温，向反应器中加入水，再用碱性溶液（质量分数为30~40%的氢氧化钠溶液）调pH值至8～10，抽滤，收集黄色固体，干燥。乙酸乙酯重结晶，经抽滤、干燥，得到土黄色固体（2-羟基-3-硝基）苯基菲并咪唑，中间体化合物。

二、中间体化合物的合成：

称取2.0 mmol中间体化合物和 0.08~0.22 g 雷尼镍加入到反应器中，再加入乙醇作为溶剂，通入氮气保护，在25~30℃ 下搅拌，滴加5.0~12.0 mL质量百分浓度为80%的水合肼溶液，滴加完毕后，升温至50 ~80℃，反应5 ~ 10 h，冷却至室温，抽滤，并用大量乙酸乙酯洗涤，收集滤液，浓缩，得到棕色固体（2-羟基-3-胺基）苯基菲并咪唑，中间体化合物。

三、中间体化合物的合成：

将3.0 g荧光素加入到反应器中，加入3~8 ml甲醇溶液，加入40%~60% 的氢氧化钠溶液，冷至50~60℃，缓慢滴加8~16 ml氯仿，搅拌3~12 h，停止反应，冷至25~30℃。加入酸性溶液（质量分数为50~70% 醋酸溶液），调至pH值为4~6，抽滤，收集褐色固体，干燥，柱分离。得到浅黄色固体，荧光素单醛，中间体化合物。

四、pH荧光探针的合成：

按照1 : 1的物质的量的比称取中间体化合物I和中间体化合物II，加入到反应器中，再加入酸性介质为溶剂，常温搅拌反应6 h，反应结束后，向反应体系中加入水淬灭反应，再用质量分数为5~10％氢氧化钾溶液调pH值至7～8，析出固体，然后进行抽滤，滤饼并水洗至中性，烘干，再用乙酸乙酯重结晶，得到三羟基咪唑-荧光素pH荧光探针。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是步骤三中所述的酸性介质为质量分数为98%的浓硫酸、质量分数为36~37%的浓盐酸、冰乙酸或甲酸。其它与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是步骤一中的反应温度为95~100℃，反应时间为10～12 h。其它与具体实施方式二或三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一不同的是步骤一中的pH值至7~9。其它与具体实施方式二至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二至五之一不同的是步骤二中反应温度为70~80℃，反应时间为8~9 h。其它与具体实施方式二至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式二至六之一不同的是步骤三中常温搅拌反应3~5天。其它与具体实施方式二至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式二至七之一不同的是步骤三中pH值为8~10。其它与具体实施方式二至七之一相同。

用以下实例验证本发明的有益效果：

试验1：本试验的三羟基咪唑-荧光素的pH荧光探针的制备方法，按以下步骤进行：

一、中间体化合物的合成：

将菲醌、5-硝基水杨醛、苯胺、乙酸铵按照1 : 1.0~2.0 : 1.0~2.0 : 2~5物质的量比加入到反应器中，再加入20~40 ml冰乙酸，升温至80~130℃ 并搅拌4 ~12 h后，冷却至室温，向反应器中加入水，再用碱性溶液调pH值至8～10，抽滤，收集黄色固体，干燥。乙酸乙酯重结晶，经抽滤、干燥，得到土黄色固体（2-羟基-3-硝基）苯基菲并咪唑，中间体化合物。

本步骤得到的中间体化合物的产率为95%，熔点：>300℃。用红外光谱、核磁氢谱和核磁碳谱表征该中间体化合物，得到的结果如下：

IR (KBr, cm^–1): 3326, 3080, 1595, 1479, 1332, 1299, 760, 725; ¹H NMR ( 600 MHz , DMSO ): δ_H 14.33 (H, s), 9.28 (H, s)，8.90 (2H, d, J = 8.40 Hz )，8.53(2H, d, J = 7.80 Hz), 8.25 (H, d, J = 8.40 Hz), 7.80 (3H, t, J = 7.20 Hz), 7.71 (2H, t, J = 7.80 Hz), 7.26(H, d, J = 9.0 Hz); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO) : δ_C163.4, 147.7, 140.2, 128.5, 128.5, 128.4, 128.4, 127.9, 127.9, 127.9, 126.7, 126.6, 126.6, 124.5, 124.5, 124.5, 122.5, 122.5, 122.5, 118.5, 113.5.

从表征结果知该中间体化合物的结构式为：

二、中间体化合物的合成：

称取2.0 mmol中间体化合物和 0.08~0.22 g 雷尼镍加入到反应器中，再加入乙醇作为溶剂，通入氮气保护，在25~30℃ 下搅拌，滴加5.0 ~12.0 mL质量百分浓度为80% 的水合肼溶液，滴加完毕后，升温至50 ~80℃，反应5 ~ 10 h，冷却至室温，抽滤，并用大量乙酸乙酯洗涤，收集滤液，浓缩，得到棕色固体（2-羟基-3-胺基）苯基菲并咪唑，中间体化合物。

本步骤得到的中间体化合物的产率为91%，熔点：>300℃。用红外光谱、核磁氢谱和核磁碳谱表征该中间体化合物，得到的结果如下：

IR (KBr) (ν_max, cm^–1): 3421，1728，1636，1616，1465，1349，757，725;¹H NMR ( 600 MHz , DMSO ): δ_H13.60 (H, s, J = 13.60 Hz), 12.23 (H, s, J = 12.23 Hz), 8.90 (2H, q, J = 8.90 Hz), 8.64 (H, d, J = 8.64Hz), 8.49 (H, d, J = 8.49 Hz), 7.77 (2H, q, J = 7.77 Hz), 7.68 (2H, t, J = 7.68 Hz), 7.44 (H, s, J = 7.44 Hz), 6.84 (H, q, J = 6.84 Hz), 6.73 (H, d, J = 6.73 Hz), 4.75 (2H, s, J = 4.75 Hz); ¹³C NMR (150 MHz, DMSO): δ_C 170.8, 150.4, 149.5, 141.3, 134.8, 128.3, 128.1, 127.9, 127.7, 126.7, 126.2, 126.0, 124.6, 124.4, 122.7, 122.5, 122.2, 119.2, 118.0, 113.2, 110.7.

从表征结果知该中间体化合物的结构式为：

二、中间体化合物的合成：

将3.0 g荧光素加入到反应器中，加入3~8 ml甲醇溶液，加入40%~60% 的氢氧化钠溶液，冷至50~60℃，缓慢滴加8~16 ml氯仿，搅拌3~12 h，停止反应，冷至25~30℃。加入酸性溶液，调至pH值为4~6，抽滤，收集褐色固体，干燥，柱分离。得到浅黄色固体，荧光素单醛，中间体化合物。本步骤得到的中间体化合物的产率为24～28%；

用红外光谱、核磁氢谱进行表征，得到的结果如下：

IR (KBr) (ν_max, cm^–1): 2928, 2853, 1727;¹H NMR(200 MHz, DMSO): δ_H 11.88 (H, s), 10.66 (H, s), 10.27 (H, s), 8.02 (H, d, J = 6.6 Hz), 7.86–7.69 (2H, m), 7.32 (H, d, J = 6.6 Hz), 6.96 (H, d, J = 8.8 Hz), 6.85 (H, s), 6.71 (H, d, J = 8.8 Hz), 6.61 (H, s).

从表征结果知该中间体化合物的结构式为：

三、三羟基咪唑-荧光素pH荧光探针的合成：

按照1 :1～3物质的量的比称取中间体化合物和中间体化合物，加入到反应器中，再加入酸性介质为溶剂，25℃～30℃ 搅拌反应4～8 h，停止反应，加水淬灭，再用溶液调pH值至6～10，抽滤，水洗滤饼至中性，干燥，乙酸乙酯重结晶，得到褐色固体，三羟基咪唑-荧光素的pH荧光探针。本步骤中，三羟基咪唑-荧光素pH荧光探针的产率为96%。

三羟基咪唑-荧光素pH荧光探针的熔点为303~305℃。质量百分纯度大于95%。

用红外光谱及核磁共振谱进行表征，得到的结果如下：

IR (KBr) (ν_max, cm^–1): 3421, 1728, 1636, 1616, 1600, 1465, 1394, 1349, 757, 725, 695; ¹H NMR ( 600 MHz , DMSO ): δ_H 15.13 (H, s, J = 15.13 Hz), 13.87 (H, s, J = 13.87 Hz), 13.45 (H, s, J = 13.45 Hz), 10.22 (H, s, J = 10.22 Hz), 9.64 (H, s, J = 9.64 Hz), 8.92 (2H, s, J = 8.92 Hz),8.60 (2H, d, J = 8.60 Hz), 8.46 ( s, J = 8.46Hz, H, ArH), 8.04 ( d, J = 8.04 Hz, H, ArH), 7.82 ( t, J = 7.82 Hz, 3H, ArH), 7.76 (H, q, J = 7.76 Hz), 7.34 (H, d, J = 7.34 Hz), 7.27 (H, d, J = 7.27 Hz), 7.04 (H, d , J = 7.04 Hz) 6.80 (2H, q , J = 6.80 Hz) 6.63 (2H, s, J = 6.63 Hz, ArH);

¹³C NMR (150 MHz, DMSO): δ_C169.12, 164.18, 160.07, 157.61, 156.02, 152.74, 151.74, 151.17, 149.17, 138.96, 136.26, 134.62, 133.18, 130.77, 129.46, 128.58, 128.26, 127.88, 126.59, 125.25, 124.77, 123.44, 122.69, 120.84, 118.86, 114.25, 109.91, 107.24, 103.42, 83.01.

从以上的表征结果可知，三羟基咪唑-荧光素pH荧光探针的结构式为：

将本试验制备的三羟基咪唑-荧光素pH荧光探针进行光谱性能测试，步骤如下：

试验2：本试验与试验1不同的是试验1的步骤四用以下的操作代替：按照1 : 1 ~ 4的物质的量的比称取0.65 g中间体化合物和0.62~2.5 g中间体化合物，加入到100 ml三口瓶中，同时加入20~30 mL的40~50%的硫酸溶液作为溶剂，常温搅拌反应2~7小时，反应结束后，向反应体系中加入水淬灭反应，并置于200 mL的烧杯中，用10~30％氢氧化钠溶液调pH值至8~10，抽滤，滤饼用水洗至中性，干燥，再用乙酸乙酯重结晶，收集固体，得到三羟基咪唑-荧光素pH荧光探针。本试验三羟基咪唑-荧光素pH荧光探针的结构式为：

产率为50%。

试验3：本试验与试验1不同的是试验1的步骤4用以下的操作代替：按照1~3 : 1的物质的量的比称取0.65~1.9 g中间体化合物和0.62 g中间体化合物，加入到100 ml三口瓶中，同时加入15~50 mL的甲醇作为溶剂，常温搅拌反应5~10小时，停止反应，旋出甲醇，乙酸乙酯重结晶，收集固体，得到三羟基咪唑-荧光素pH荧光探针。本试验得到的三羟基咪唑-荧光素pH荧光探针结构为：

产率为75%。

试验4：本试验与试验1不同的是试验1的步骤四用以下的操作代替：按照2~6 : 1的摩尔比称取1.3~3.8 g中间体化合物和0.62 g中间体化合物，加入到100 ml三口瓶中，同时加入15~55 mL的37%的浓盐酸作为溶剂，25~30℃下反应5小时，停止反应，加入水淬灭，并置于200 mL的烧杯中，用5~30％氢氧化钠溶液调pH值至7~9，抽滤，滤饼水洗至中性，干燥，再用乙酸乙酯重结晶，收集固体，得到三羟基咪唑-荧光素pH荧光探针。本试验得到的三羟基咪唑-荧光素pH荧光探针的结构式为：

产率为40%。