产生物表面活性剂的琼氏不动杆菌及其应用的利记博彩app

本发明属于生物工程技术在微生物采油育种中的应用领域，具体是关于一种分离自油藏的产生物表面活性剂的琼氏不动杆菌及其应用，包括将该菌株用于发酵生产表面活性剂、以及该菌种在提高原油采收率中的应用。
背景技术：
：石油开采技术中，水驱是世界范围内广泛使用的一种有效的提高原油采收率的开采方式。然而，在水驱过后，地层中仍然残留有大量的石油。化学驱、CO2泡沫驱，蒸汽驱等采油技术被用来提高原油采收率。然而，这些开采技术需要更高的经济、能源成本，对环境也会造成破坏。微生物采油是一种成本低廉、环境友好三次采油技术，也受到越来越多人的关注，在油田应用也越来越广泛。普遍认为的微生物采油的机理有降低界面张力、润湿性反转、微生物产气、原油乳化、降黏等。其中有两种机理被认为是微生物采油的主要机理。其一是微生物代谢产生的生物表面活性剂降低油水界面张力，促进原油乳化，改善原油在地层中的流动性能。另一机理是微生物代谢产生的表面活性剂能够改变油层的润湿性。不管哪种机理，微生物代谢产生的表面活性剂是提高原有采收率的关键。在过去的几十年里，许多文献报道了许多不同类型的生物表面活性剂及其产生菌。生物代谢产生的表面活性物质通常被分为两大类，一类是分子量相对较小的生物表面活性剂，一类是分子量相对较大的生物乳化剂。代谢产生生物表面活性剂的微生物主要有Pseudomonas、Bacillus、Rhodococcus、Nocardia等，主要代谢产物为糖脂、脂肽等类型的生物表面活性剂。代谢生物乳化剂的微生物主要有Acinetobacter、Bacillus、Geobacillus等，主要的代谢产物有糖蛋白、脂多糖等类型的生物乳化剂。这些代谢产物在微生物采油中占有重要的地位。在不同的油藏中，不同的微生物占据主导地位，在进行微生物采油过程中，不同的油藏对菌种也有一定的要求，分离自油藏的微生物，能够更好的适应油藏环境，也被广泛的应用于微生物采油，许多分离自油藏的微生物能够降解原油并代谢产生生物表面活性剂，常见的属有Pseudomonas，Bacillus，Rhodococcus，Arthrobacter。然而，尽管有报道不动杆菌属Acinetobacter在油藏系统中普遍存在，但是到目前为止还没有分离自油藏系统的Acinetobacterjunii相关报道。技术实现要素：本发明的目的在于针对微生物采油现状，基于微生物采油的机理，提供一株能产生物表面活性剂的菌株，该菌株能够产生生物表面活性剂，具有较好的乳化活性及降解饱和烷烃能力。本发明提供了一株能产生物表面活性剂的琼氏不动杆菌(Acinetobacterjunii)菌株，其能够产生生物表面活性剂，具有较好的乳化活性，且该菌株具有显著的降解饱和烷烃特别是C18、C19、C21、C22、C23、C26、C28正构烷烃的能力。本发明提供的该琼氏不动杆菌(Acinetobacterjunii)菌株命名为BD，该菌株已于2016年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号：CGMCCNo.13206。根据本发明的具体实施方案，本发明还提供了一种琼氏不动杆菌制剂，该琼氏不动杆菌制剂中含有保藏编号为CGMCCNo.13206的琼氏不动杆菌，该琼氏不动杆菌为固态或液态菌制剂。根据本发明的具体实施方案，本发明还提供了一种制备生物表面活性剂的方法，该方法包括在营养培养基中发酵培养本发明所述的琼氏不动杆菌或所述的琼氏不动杆菌制剂，产生生物表面活性剂。更具体地，其中，所述营养培养基为LB培养基，或者，所述营养培养基包括：葵花籽油8-30g/L，NaNO38-30g/L，KH2PO40.5-2g/L，Na2HPO40.5-2g/L，yeast0.1-1.0g/L，pH5-9.5。根据本发明的具体实施方案，本发明的制备生物表面活性剂的方法中，还包括发酵后除去菌体的过程，以其发酵清液(含生物表面活性剂)用于驱油。根据本发明的具体实施方案，本发明还提供了一种生物表面活性剂，其是按照所述方法制备得到的。该生物表面活性剂物理性状良好，能够有效降表面张力，对石油及多种烃和脂类具有良好的乳化性能。根据本发明的具体实施方案，本发明还提供了所述的琼氏不动杆菌或所述的琼氏不动杆菌制剂在降解原油和/或饱和烷烃中的应用。具体应用时，是将所述的琼氏不动杆菌或所述的琼氏不动杆菌制剂与待降解的原油和/或饱和烷烃混合，使琼氏不动杆菌在混合体系中培养生长，从而降解原油和/或饱和烷烃。优选地，所述饱和烷烃包括C18～C28烷烃中的一种或多种，更优选包括nC18、nC19、nC21、nC22、nC23、nC26、nC28的正构烷烃中的一种或多种。根据本发明的具体实施方案，本发明还提供了所述的琼氏不动杆菌、所述的琼氏不动杆菌制剂、或者所述的生物表面活性剂在驱油以提高原油采收率中的应用。综上所述，本发明提供的琼氏不动杆菌(Acinetobacterjunii)BD能产生物表面活性剂，具有优异的乳化活性及降解饱和烷烃能力。附图说明图1为基于16SrRNA的产表面活性剂菌BD的进化树。图2为BD菌对原油降解前后样品总离子流图。图3为BD菌对原油生物降解前后原油中化合物类型相对丰度。图4为BD代谢产物粗品的薄层层析。图5为BD代谢产物粗品的FT-ICR-MS谱图。图6为温度对生物表面活性剂表面张力的影响。图7为pH对生物表面活性剂表面张力的影响。图8为菌株BD或其代谢产物驱替后微观模型中的残余油分布。用于专利程序的微生物保存：保藏日期：2016年10月31日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101；保藏编号：CGMCCNo.13206；分类命名：琼氏不动杆菌(Acinetobacterjunii)。具体实施方式下面通过具体实施例进一步详细说明本发明的琼氏不动杆菌(Acinetobacterjunii)及特点和应用中所具有的技术效果，但本发明并不因此而受到任何限制。实施例1、本发明的产生物表面活性剂菌种的分离、鉴定及保藏1、产生物表面活性剂菌种的分离本发明中，产生物表面活性剂微生物的筛选方法为：将从新疆油田采集的水样取10mL接入盛有100mL灭菌原油无机盐培养基(2％原油，v：v)中，35℃，150rpm恒温振荡培养72h，选取原油乳化分散程度高的实验组，取100μL发酵液涂布于LB琼脂平板培养基，35℃培养48h；挑取不同形态单菌落，在LB琼脂平板培养基上划线纯化，35℃培养48h。挑取单菌落经过富集培养接种入以原油为碳源的原油无机盐培养基(g/L：NaNO38，MgSO40.5，KH2PO41，K2HPO41，FeSO4·7H2O0.02，Na2MoO40.02，CaCl2·2H2O0.06，原油0.5％(W/V)，pH7.2)中，35℃，150rpm培养72h，观察原油乳化分散程度和测定发酵液表面张力选取苯酚降解率最大的菌株。本实施例中，通过初步筛选以原油为碳源产表面活性剂的微生物，发现油藏地层水中有能够很好乳化原油的微生物。经过对样品中的单菌落的筛选，发现四类油藏中有能够很好乳化原油的微生物，总共分离得到了乳化原油效果较好的单菌3株，分别命名为BD、BD-2、BD-3。在3个菌株中，BD的排油圈直径为5cm，BD-2的排油圈直径为4.5cm。采用表面张力仪对3株菌的发酵液的表面张力进行测定，结果见表1，从表中可以看到BD、BD-2、BD-3菌株发酵液具有较强的降低表面张力的能力，分别将表面张力从73.20mN/m降低到30.364mN/m、34.182mN/m和30.127mN/m。表1典型产表面活性剂微生物的确定菌株最适温度/℃表面张力mN/m排油圈直径/cmBD3730.3645.0BD-23734.1824.5BD-33730.1274.12、菌种鉴定依据《常见细菌系统鉴定手册》，对本发明分离出的菌株BD进行鉴定，主要从菌株个体形态特征、菌落特征、染色反应、生理生化反应等鉴定到属，内容包括形态观察、革兰氏染色、过氧化氢接触酶反应、氧化酶实验、葡萄糖氧化发酵实验、甲基红实验等，鉴定结果表2。表2BD菌与对照菌的生理生化特征表中：+，所有菌株为阳性；-，所有菌株为阴性；数字为阳性菌株的％。另外，按照常规菌种鉴定方法，分别提取菌株BD的基因组DNA，设计引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，选择理想的PCR产物送至上海生工测序进行DNA测序。产物测序结果提交NCBI用BLAST进行检索和同源性比较，并利用SepnConverter，Clustalx1.83，Phylip3.63及TreeView等软件构建系统进化树(见图1)。通过16SrDNA序列分析，确定菌株BD为琼氏不动杆菌(Acinetobacterjunii)。本发明的菌株BD可以采用如下保存方法：(1)短期保存：将上述菌株于斜面培养基上划线，经35℃，48h培养后，4℃保藏。(2)长期保存：可采用甘油冷冻保存法：从新鲜的斜面培养基上刮取几环菌，转入到已装有1.5mL30％灭菌甘油的甘油管中，-70℃冷冻保存。或采用脱脂牛奶冷冻保藏法：从新鲜的斜面培养基上刮取几环菌，转入到已装有灭菌脱脂牛奶的甘油管中，-70℃冷冻保存。本发明所筛选到的琼氏不动杆菌(Acinetobacterjunii)BD菌株已于2016年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号：CGMCCNo.13206。实施例2、BD对原油的降解实验种子菌液：将BD菌接种于富集培养基(参考现有技术配制，基本组成包括：Yeast5g/L，NaCl10g/L，Peptone10g/L。培养至浓度108-109cells/mL，作为种子液，进行本实施例的实验研究。原油无机盐培养基(g/L)：NaNO38，MgSO40.5，KH2PO41，K2HPO41，FeSO4·7H2O0.02，Na2MoO40.02，CaCl2·2H2O0.06，原油0.5％(W/V)，pH7.2。BD菌对原油降解的GC-MS分析：用LB培养基活化菌种，然后配制原油无机盐培养基(g/L)：NaNO38，MgSO40.5，KH2PO41，K2HPO41，FeSO4·7H2O0.02，Na2MoO40.02，CaCl2·2H2O0.06，新疆原油0.5％(W/V)，pH7.2，将培养基分装至250mL三角瓶中，每瓶100mL，按照4％接种量分别接种BD，于35℃摇床培养(150rpm)，分别于2d、7d、14d取样。用二氯甲烷萃取培养液中原油，萃取后室温挥干溶剂。采用标准SYT5119-2008岩石中可溶有机物及原油族组分分析分离降解前后原油四组分，将得到的饱和烃利用Thermo–FinniganSSQ710色谱/质谱联用仪进行色质分析。测定原油生物降解前后饱和烃的组分变化。实验结果请参见图2所示，BD菌作用后，正构烷烃的相对丰度明显下降，nC18以下的烷烃相对丰度变化不大，nC18、nC19、nC21、nC22、nC23、nC26、nC28的正构烷烃相对丰度降低显著，部分在两天内被完全消耗，高于nC25的烷烃相对丰度有所增加，其中，nC25、nC30和nC35增加幅度较大，表明BD可以利用中等分子量的烷烃为碳源，但分解高分子量的烷烃的能力较低，且较难利用nC25、nC30和nC35作为碳源。总的来说BD对原油具有较为明显的降解效果，两天内可以将饱和烃中的多种组分完全消耗(表3)。从图3可以看出降解前化合物类型相对丰度从高到低依次是O2>O1>O4>O5>O3；经BD降解后原油组分中O2类化合物的相对丰度也是最高的，其它化合物类型相对丰度从高到低依次是O3>O4>O1>O5；其中变化最为明显的为O2和O3类化合物，经BD降解后，两类化和物相对丰都均大幅度增加，O2类占极性化合物的35％以上。而利用BD-2、BD-3菌对原油进行降解，nC19、nC21、nC22、nC23、nC26、nC28的正构烷烃的相对丰度在两天内下降并不显著。另外，曲丽娜等从大庆油田长期石油污染的土壤中分理出5株石油烃降解菌其中AcinetobacterjuniiX9相对降解能力较弱，在原油含量为1％的原油无机盐培养基中，降解一天时，对原油基本没有什么降解效果，降解15天时，原油降解率为20％。本发明中菌株BD在原油无机盐培养基中培养一天后，原油出现明显的乳化现象，在培养两天时，nC18、nC19、nC21、nC22、nC23、nC26、nC28的正构烷烃相对丰度降低显著，部分在两天内被完全消耗，说明菌株BD对原油具有快速高效的降解效果。LiuTao(2012)等从石油污染土壤中分离得到两株石油烃降解菌，分别为Pseudomonasaeruginosa(B1)和Acinetobacterjunii(B2)，但是只研究了两株菌对正十六烷的降解能力，文献中关于Acinetobacterjunii在石油烃降解中的相关报道很少。本发明的菌株BD为首次分离自油藏系统的Acinetobacterjunii，对石油烃具有良好的降解效果，可用于微生物采油和石油污染土壤修复。表3BD菌作用后正构烷烃相对丰度变化(wt％)实施例3、产表面活性剂微生物BD的产物提取及分析菌种的活化与发酵(1)菌种活化：吸取甘油管保藏的BD菌种100μl接种到LB培养基，在37℃恒温摇床中振荡培养8h，作为种子液。(2)初始发酵条件：按体积比10％的接种量将种子液接入到装有200mL发酵培养基(发酵培养基组分为：葵花籽油20g/L，NaNO310g/L，KH2PO40.8g/L，Na2HPO40.8g/L，yeast0.5g/L，pH7.2)中，在37℃恒温摇床中，150r/min条件下振荡培养96h，得初始发酵液。实验1、发酵产物的提纯在发酵培养基(发酵培养基组分为：葵花籽油20g/L，NaNO310g/L，KH2PO40.8g/L，Na2HPO40.8g/L，yeast0.5g/L，pH7.2)中接入5％的初始发酵液，35℃，150rpm下振荡培养5天后，将发酵液离心去菌体后，加入用2倍体积无水乙醇醇沉，4℃冷藏过夜，收集沉淀和上层液相，将得到的沉淀洗涤冷冻干燥，同时提取上清液中有机物，得到黄色粘稠油状液体。将黄色粘稠油状液体溶于氯仿中，过滤除去蛋白质等杂质，用柱层析进一步的纯化粗品，纯化方法参考文献，具体步骤如下：①柱子填充物为硅胶，在180℃下活化24h；②将氯仿与活化后的硅胶混合，填装入φ15×300mm玻璃柱，排尽残留气泡；③将粗品的氯仿溶液小心沿层析柱内壁从层析柱顶部注入；④用氯仿对硅胶柱进行淋洗除去粗品中的中性脂；⑤依次用10:1(v/v)、2:1(v/v)、1:1(v/v)和1:2(v/v)的CHCl3和CH3OH的混合液对硅胶柱进行淋洗，流速控制在2ml/min；⑥每隔10ml，收集一次淋洗液，用薄层层析(TLC)对收集样进行鉴定。实验2、代谢产物的薄层色谱分析薄层层析所用展层板为硅胶板，显色剂为蒽酮硫酸溶液，主要步骤如下：①点样：粗品用氯仿溶解，将溶解液分次点加在硅胶板上，形成均匀小斑点，并烘干；②展开：把薄板点样的一端浸入展开剂(V/V/V,CHCl3:CH3OH:H2O＝65:15:2的混合液)中，深度约为0.5-1cm，当展开剂的前缘接近硅胶板前缘时停止操作，迅速取出硅胶板，用铅笔标记溶剂的前缘位置，用吹风机的冷风吹干；③显色。将蒽酮硫酸溶液均匀的喷洒在硅胶板上，100℃下显色15分钟；实验结果见图4，其中A为鼠李糖，A1为鼠李糖的层析结果，B为BD菌代谢的生物表面活性剂，B1、B2为BD代谢物的层析结果。BD代谢物与茚三酮不显色，推测该菌能产生糖脂类表面活性剂，薄层层析出现两个显色点，这说明其产生的糖脂类物质主要含有两种组分。实验3、代谢产物组成分析将提取得到的代谢产物进行FT-ICR-MS分析，对代谢产物的样品组成进行分析，对200-1200分子量范围内进行扫描，通过BrukerDaltonicsDataAnalysis软件计算得出样品中相对含量较高的化合物种类。结果如图5所示，挑选质谱图中主要的峰，用BrukerDaltonicsDataAnalysis分析并计算每个峰所代表的化学物质，计算所得到的化学式如表4所示，通常认为误差在3ppm范围以内，数据可靠。其中m/z为503.32139的峰所代表的的化合物为C26H48O9，为R1型鼠李糖脂；m/z为531.35377的峰所代表的的化合物为C28H52O9，为R1型鼠李糖脂；m/z为649.37936的峰所代表的的化合物为C32H58O13，为R3型鼠李糖脂；m/z为529.33773的峰所代表的的化合物为C28H50O9，为R1型鼠李糖脂；m/z为475.2911的峰所代表的的化合物为C24H44O9，为R1型鼠李糖脂；m/z为677.41079的峰所代表的的化合物为C34H62O13，为R3型鼠李糖脂；m/z为479.24932的峰所代表的的化合物为C22H40O11，为R2型鼠李糖脂(见表4)。从高分辨质谱结果来看BD代谢产物粗品中主要的表面活性物质有R1、R2、R3型鼠李糖脂。本发明分离得到的AcinetobacterjuniiBD具有优异的产表面活性性能，可代谢产生多种类型的鼠李糖脂类表面活性剂，同时对油藏具有较好的适应性，可应用于微生物采油。表4菌株BD代谢产物多样性实施例4、BD菌株代谢产物稳定性评价微生物发酵液乳化性能的测定如下：(1)将BD菌接种于LB培养基中，于35℃条件下培养48h，得BD发酵液；(2)取BD发酵液离心除去菌体(5000rpm离心两次，每次15min)，移取上清夜7mL，煤油3mL加入带刻度试管中，用漩涡混合器漩涡混合2min，静置24h后，观察测定油相、乳化相的体积，计算乳化率E24。实验1、BD产表面活性剂热稳定性研究将BD发酵液在不同温度处理1h，冷却至室温，按照上述(2)测定其乳化活性。结果请参见图6，显示了温度对生物表面活性剂表面张力的影响。由图6可知：BD产表面活性剂对温度有一定的耐受性，在30～80℃范围内均具有较高的乳化活性，当在90℃温度下处理1h时发酵液的乳化活性降低。这说明BD产生的表活剂能够适应多种不同温度的油藏。实验2、BD产表面活性剂耐酸碱的研究将BD菌发酵液分别调整pH至1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0处理一段时间后，测定其乳化性能。结果如图7所示，显示了pH对生物表面活性剂表面张力的影响。从图中可以看出：当溶液pH降低(从pH3.0到pH1.0)时，发酵液的乳化活性大幅度下降。可能是由于酸引起生物表面活性剂发生了沉淀。从pH4.0到pH12.0发酵液的乳化活性变化不大，说明BD菌产生的表面活性剂的乳化活性物质能耐受的pH范围较广，有较广阔的应用空间。实施例5、利用菌株BD及其代谢产物提高原油采收率评价实验评价产生物表面活性剂菌提高原油采收率的效果采用玻璃微观模型，制作低渗透油藏岩心铸体薄片，用偏光显微镜图像处理软件处理岩心铸体薄片照片。分别以两个孔隙结构图为模版，制作玻璃微观模型。玻璃微观模型由两块玻璃板组成，在其中一块玻璃板表面蚀刻，然后将两块玻璃板高温烧结在一起。所得模型的孔隙约为20μm～40μm。实验1、生物原位激活驱油实验①模型饱和原油将均质性玻璃微观模型用煤油，二氯甲烷洗干净，放在马沸炉中，400℃煅烧3个小时，冷却至室温，在两端用胶把驱替针头粘好，防止其漏气，待胶凝固之后，两端连上胶管，其内径为0.8mm，用1mL的注射器注入稀释好的原油，放在室温下饱和36h。②AcinetobacterjuniiBD悬浮液的制备取AcinetobacterjuniiBD种子液(参照实施例2种子菌液的制备)100μL，接入100mL装有灭菌的LB培养基的三角瓶中，于35℃条件下摇床培养10h，10000rpm高速离心10min，收集菌体，用无菌水清洗3遍，用同等基础培养基重悬菌体。③第一次水驱取过滤后的新疆油田水样200mL，平均分装到两个灭菌后的100mL的细口瓶中，调节pH至中性。在35℃条件下，用地层水驱替模型中的原油，每次水驱的时间是30min。第一次水驱完之后放在显微镜下进行观察，并拍照。④注入微生物在35℃条件下注入AcinetobacterjuniiBD悬浮液，驱替时间为10min，之后再用地层水驱替20min，其间每隔2min记录一次模型图像；注完菌液之后放在显微镜下进行观察，并拍照。然后放在35℃的条件下培养96h。⑤第二次水驱培养96h之后，用过滤后的地层水在35℃条件下进行水驱。水驱完之后在显微镜下观察并拍照。⑥数据处理结束实验，利用photoshop软件处理图片，计算其采收率。用煤油和二氯甲烷把模型洗干净后，400℃煅烧4h，以备再次使用。实验2、表面活性剂驱油实验①模型饱和原油玻璃微观模型用煤油，二氯甲烷洗干净，放在马沸炉中，400℃煅烧3h，冷却至室温，在两端用胶把驱替针头粘好，防止其漏气，待胶凝固之后，两端连上胶管，其内径为0.8mm，用1mL的注射器注入稀释好的原油，放在室温下饱和36h。②微生物培养液的制备取AcinetobacterjuniiBD种子液(参照实施例2种子菌液的制备)100μL，接入100mL装有灭菌的LB培养基的三角瓶中，于35℃条件下摇床培养10h，取5mL接入到100mL发酵培养基中，35℃条件下摇床培养96h，静置分层去下层发酵液，12000rpm离心10min，吸取中层清液备用。③驱替实验在35℃条件下首先用过滤后的地层水驱替30min，然后将处理后的菌液注入模型，流速控制在8μL/min，菌液驱替时间为10min，之后再用地层水驱替20min，其间每隔2min记录一次模型图像。④数据处理利用photoshop软件处理图片，计算采收率。用煤油和二氯甲烷把模型洗干净后，400℃煅烧4h，以备再次使用。表5不同驱替模式下原油采收率不同驱替方式对内源微生物驱油效果的影响如表5所示。两种不同驱替模式下，二次水驱的采收率提高幅度均在9％以上，当采用发酵液驱替时，二次水曲采收率要远高于采用菌体悬浮液原位驱替。图8是生物表面活性剂驱油实验不同时期的拍照图片。当注入除去菌体的发酵液时，发酵液中生物代谢产生的表面活性剂能够降低水的表面张力，改善油的乳化特性，同时也改变了地层岩石表面的润湿性，使油与水形成较稳定的水包油乳状液，提高了原油自岩石孔隙表面自发洗脱效果。不同驱替方式对内源微生物驱油效果的影响如表5所示。两种不同驱替模式下，二次水驱的采收率提高幅度均在9％以上，当采用发酵液驱替时，二次水驱采收率要远高于采用菌体悬浮液原位驱替。当前第1页1 2 3