一种检测人胎盘胎儿侧间充质干细胞抗氧化能力的方法与流程

本发明涉及间充质干细胞
技术领域：
，特别涉及一种检测人胎盘胎儿侧间充质干细胞抗氧化能力的方法。
背景技术：
：：间充质干细胞(Mesenchymastemcell,MSCs)，由于其强大的抗氧化及抗炎能力，目前已得到广泛的关注。MSCs作为成体干细胞的一种，可以从多种组织细胞中分离出来，体外扩增后可用于人体疾病的治疗。间充质干细胞在抗氧化方面的应用，基于以下特性：(1)能够分泌抗氧化酶类物质抑制机体氧化反应；(2)能够分泌小分子物质清除机体氧化自由基。MSCs在体外无血清培养的过程中，可以分泌抗氧化酶类以及其他小分子物质释放到培养上清中。收集其培养上清进行抗氧化指标的检测，可以发现其具有一定抗氧化能力，并可以清除氧化自由基，但具体的抗氧化成分还有待研究。氧化应激是诸多疾病的始动因素。机体在遭受氧化损伤后，由于氧化应激作用会产生活性氧簇(Reactiveoxygenspecies,ROS)，其中主要包括清除二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)、羟自由基(·OH)、超氧阴离子(O2—)、一氧化氮离子(NO2—)、过氧化氢离子(H2O2)等。正常生理状况下，人体内自由基的产生和清除处于动态平衡状态，自由基也是人体不可或缺的物质，参与有氧呼吸电子传递，细胞信号传导和基因调控、诱导细胞增殖和凋亡、维持内环境稳态、维持个体的正常生长发育及抵抗细菌、病毒和癌症等方面起着重要作用。然而，当机体遭受外来刺激时，会导致机体遭受氧化应激，自由基就会大量产生打破平衡，而多余的自由基就会攻击生物膜引发一系列的自由基链反应，引发机体蛋白质，酶，脂质和核酸的氧化损伤，进而引发疾病。临床现已证明多种疾病与自由基相关，主要包括：(1)神经退行性疾病：帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、亨廷顿病(HD)和中风等；(2)心脑血管疾病：动脉粥样硬化、高血压、缺血性心脏病等；(3)癌症：膀胱癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌等癌症；(4)糖尿病，系统性红斑狼疮，骨质增生异常综合症，风湿性关节炎、白内障、哮喘、小儿肺炎，缺血再灌注损伤等其他疾病相关。因此，在治疗此类疾病时，针对其发病机制的抗氧化以及清除自由基方面的治疗变得尤为重要，或许可以推测，如果外界干预治疗可以清除机体多余的氧化自由基，便可以在根本上治愈此类疾病，疗效可以优于当前临床治疗上针对于疾病表现所采取的治疗措施，以“本”代“标”。当前关于间充质干细胞的大多数研究主要针对于间充质干细胞本身的抗炎作用以及其多向分化能力，而一些动物实验证明间充质干细胞同样具有抗氧化作用。SALLYM.SHALABY等人将大肠杆菌通过气管进入到大鼠体内，造成大鼠急性肺损伤模型，然后将骨髓来源的间充质干细胞通过尾静脉注射到大鼠体内，结果显示：间充质干细胞能明显减轻大鼠肺损伤，且接受间充质干细胞的实验组大鼠血清的抗氧化酶类物质，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等与对照组相比均有不同程度的提高。ShirongNi等也同样在体内实验中证实了间充质干细胞具有修复损伤肺组织的能力，且此修复能力是通过Nrf2抗氧化信号通路进行的。而究其作用机制，有些观点认为间充质干细胞的抗氧化能力是通过其旁分泌作用发挥功能的。间充质干细胞在分裂增殖的过程中，会向外周分泌微泡/外泌体，其表面携带小分子蛋白，此类小分子可以通过调控抗氧化信号通路来发挥抗氧化作用，或者分泌一些抗氧化酶类物质，酶类抗氧化物在铜、锌、锰、铁等辅因子的协助下通过分解或消除自由基以达到抗氧化的目的，此过程反应复杂、需多步才能完成，其间可能会引发自由基链反应，产生新的自由基或氧化物。因此，申请人认为不仅间充质干细胞在体内治疗中可以发挥作用，其在体外培养过程中将抗氧化活性物质分泌到培养基中，所得的培养上清也具有抗氧化作用。为此，提供一种检测间充质干细胞培养上清的清除自由基能力以及其中的抗氧化酶活性的方法。技术实现要素：：本发明的目的旨在拓展间充质干细胞在临床治疗方面的应用，为临床上间充质干细胞的无细胞治疗提供依据，提供一种检测人胎盘胎儿侧间充质干细胞无血清培养所得上清抗氧化能力的方法。为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种检测人胎盘胎儿侧间充质干细胞抗氧化能力的方法，该方法是应用人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清作为实验对象，检测所述培养上清中人胎盘胎儿侧间充质干细胞分泌的抗氧化成分的抗氧化能力，从而间接推断出人胎盘胎儿侧间充质干细胞及其培养上清中的抗氧化能力，为其后期的研究及应用提供依据。上述检测人胎盘胎儿侧间充质干细胞抗氧化能力的方法，包括如下步骤：从胎盘中提取人胎盘胎儿侧间充质干细胞得原代人胎盘胎儿侧间充质干细胞；将原代人胎盘胎儿侧间充质干细胞进行培养得第一代间充质干细胞，并进行冻存；收集不同个体的第一代间充质干细胞，复苏后进行体外培养至第六代，收集第二代到第六代无血清培养上清，检测其总抗氧化能力、清除自由基能力以及抗氧化酶类物质活性。上述方法具体步骤为：(1)人胎盘间充质干细胞的分离从人胎盘中取得胎儿侧胎盘，将其剪碎后经过漂洗、离心、离心上清收集、过筛后得到原代人胎盘胎儿侧间充质干细胞；(2)原代人胎盘胎儿侧间充质干细胞的原代培养将原代人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养10～15天，待局部融合度达到80％后进行传代，得到第一代间充质干细胞，并进行冻存；(3)第一代间充质干细胞的传代培养复苏第一代间充质干细胞至培养皿中，使用无血清培养基培养至80％融合后收集上清，部分冻存后进行传代培养至第六代，每代次收集上清离心分装后于-80℃冻存，进行检测；(4)将检测得到的各组数据采用SPSS19.0统计软件，分别进行样本组与空白对照组相比，观察所得数据是否有统计学差异。上述检测内容主要包括：①总抗氧化能力(T-AOC)测定：上清中的抗氧化物质可以将Fe3+还原成Fe2+，后者可与菲啉类物质形成稳定的络合物，通过比色法测定出其抗氧化能力的高低。由于抗坏血酸/维生素C(VC)是已知并公认的抗氧化物质，故在预实验中首先检测出所得上清的大致范围，再用培养基配制成不同浓度的VC溶液，检测其抗氧化活性，然后选取其数值为上清抗氧化能力2倍左右的VC溶液作为后续实验的标准阳性对照，同时使用空白培养基作为阴性对照。正式实验中，采用此法分别检测对照组、VC组以及间充质干细胞上清的总抗氧化能力。②清除二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)能力的检测：DPPH·是一种以氮为中心的自由基，含有一个单电子，在517nm处有强烈的吸收峰，其乙醇溶液呈深紫色，加入培养上清后，测定清除DPPH·而引起的吸光度的减少可以反映其抗氧化能力的强弱。本实验采用此法分别检测对照组、VC组以及间充质干细胞上清的清除DPPH·自由基的能力。③抑制羟自由基(·OH)能力：羟自由基是一种氧化能力很强的自由基，其性质很活泼，氧化各种有机物和无机物的速率极快，是造成组织脂质过氧化、核酸断裂、蛋白质和多糖分解的主要因素，与机体衰老、肿瘤、辐射孙损伤和细胞吞噬能力有关。Fenton反应是最常见的产生羟自由基的化学反应，H202的量和Fenton反应产生的·OH量成正比，当给予电子受体后，用griess试剂显色，形成红色物质，其呈色与·OH的多少成正比关系。依据此原理检测出对照组、VC组以及间充质干细胞上清的抑制羟自由基的能力。④抗超氧阴离子自由基(O2—)能力：此实验模拟机体中黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应系统，产生超氧阴离子自由基，加入电子传递物质及gress显色剂，使反应体系呈现紫红色，可用分光光度计测其吸光度。当抗超氧阴离子的物质可抑制该反应使超氧阴离子自由基减少，故比色时颜色变浅；依据形成物的颜色深浅计算出抑制或产生超氧阴离子自由基的能力强弱。依据此原理检测出对照组、VC组以及间充质干细胞上清的抗超氧阴离子自由基(O2—)的能力。⑤超氧化物歧化酶(SOD)活力测定：SOD是人体内清除超氧阴离子自由基的酶，在维持机体自由基平衡上有重要作用。本实验通过模拟黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测定其吸光度。当被测样本中含SOD时，则亚硝酸盐减少，比色管吸光度值降低。依据此原理检测出对照组、VC组以及间充质干细胞上清的超氧化物歧化酶活力。⑥谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性测定：谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—PX)是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解的酶，它特异地催化还原型谷胱甘肽(GSH)对氢过氧化物的还原反应。一般认为它在细胞内能清除有害的过氧化物代谢产物，阻断脂质过氧化链锁反应，从而起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。GSH和二硫代二硝基苯甲酸作用生成5-硫代二硝基苯甲酸阴离子呈现较稳定的黄色，在412nm处测其吸光度即可算出GSH的量。依据此原理检测出对照组、VC组以及间充质干细胞上清谷胱甘肽过氧化物酶的活力。以上各组数据采用SPSS19.0统计软件，分别进行实验组和VC组与对照组进行两样本均数比较，P＜0.05时认为差异具有统计学意义。本发明的有益效果在于：该方法通过测定人胎盘间充质干细胞培养上清的抗氧化能力，进而推断间充质干细胞的总体抗氧化能力，为后续的实验奠定基础。由其结果得知：(1)在总抗氧化能力方面，人胎盘间充质干细胞培养上清具有一定的抗氧化能力，其中总抗氧化能力(T-AOC)约相当于30-70μmol/LVC的总抗氧化能力，且其总抗氧化能力与空白对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)；(2)在清除自由基能力上，人胎盘间充质干细胞培养上清在清除DPPH·、·OH和O2—自由基上均具有一定作用，且其清除自由基能力与空白对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)；(3)在抗氧化酶类活性测定上，人胎盘间充质干细胞培养上清中可以检测到超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GDH-PX)活性，且与空白对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。附图说明：图1是本发明中不同浓度VC的总抗氧化能力的标准曲线图；图2是本发明中对照组、VC组以及样本组的总抗氧化能力的对比图；图3是本发明中对照组、VC组以及样本组的清除二苯基苦基苯肼自由基能力的对比图；图4是本发明中对照组、VC组以及样本组的抑制羟自由基能力的对比图；图5是本发明中对照组、VC组以及样本组的抗超氧阴离子自由基能力的对比图；图6是本发明中对照组、VC组以及样本组的超氧化物歧化酶活力的对比图；图7是本发明中对照组、VC组以及样本组的谷胱甘肽过氧化物酶活性的对比图。具体实施方式：通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本发明检测人胎盘胎儿侧间充质干细胞抗氧化能力的方法，包括如下步骤：S1：人胎盘间充质干细胞的分离及原代培养(1)将胎盘放入无菌托盘中，剥离外层薄膜，利用已消毒的手术剪将胎儿侧胎盘剪至厚度约为0.5cm的组织块，此过程尽量避开血管，立即浸泡至含有双抗(两性霉素、链霉素)的PBS中，漂洗三次至液体变为透明或微红；(2)将上述组织剪至碎末状，并始终保持组织湿润，将组织块转入50ml无菌离心管中，根据收集的组织量加入相应的胶原酶A(5mg/ml)，放入37℃水浴中消化2h；(3)收集上述上清至离心管中，PBS重悬沉淀的细胞团块，加速度为9，离心力为500g进行离心，当离心力接近500g时，加速度降至1并按停止离心取上清，此操作重复3次；(4)将收集的上清离心(500g/min，10min)，弃去上清，加入DMEM培养基使细胞重悬，并进行过筛，即100μm滤网过筛后再置于40μm滤网进行过筛；(5)将过筛后的悬液离心(1000r/min，4min)，弃去上清，加入间充质干细胞无血清培养基使细胞重悬，并将细胞悬液接种到已包被的10cm培养皿中，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，即得原代间充质干细胞；(6)剩余的细胞使用冻存液重悬后转入冻存管中，放入冻存盒，-80℃过夜后转入液氮罐中保存，即原代间充质干细胞；(7)10-15天内观察步骤(5)中培养的细胞，观察到原代间充质干细胞呈梭形或多角形，待局部融合度达80％后进行传代及冻存，此时细胞为第一代间充质干细胞。S2：第一代间充质干细胞的传代培养及培养上清收集(1)取9ml原代间充质干细胞无血清完全培养基加入到已包被的10cm培养皿中，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中平衡；(2)从液氮罐中取出第一代间充质干细胞，37℃水浴复苏后与2ml培养基完全混合，离心去除上清，加入1ml培养基重悬细胞，接种到已平衡至37℃的培养皿中，放入培养箱中培养；(3)48h后镜下观察细胞融合率约为80％时，收集培养上清，离心后去除死细胞，再将上清按需进行分装，与-80℃进行保存；此次收集的即为第二代间充质干细胞上清；(4)培养皿中的细胞使用37℃的PBS冲洗后，使用间充质干细胞专用消化酶进行消化，并按照1：3进行传代，其中2/3细胞进行冻存，1/3细胞用于传代，培养时间同样为48h，细胞融合率达到80％；(5)按照以上操作收集第三代至第六代间充质干细胞培养上清，以上操作为培养及收集单个个体的样本，本发明重复三个人的样本。S3：人胎盘间充质干细胞培养上清的各项抗氧化指标的检测(1)各项抗氧化指标检测前，先将第二代至第六代间充质干细胞上清取出，放入4℃融解，使用前平衡至室温；(2)不同浓度VC及样本组(三个不同个体第二代至第六代上清)的总抗氧化能力(T-AOC)的检测称取m＝0.176gVC，双蒸水配制VC母液，即VC母液＝1000μmol/L；再按照下表1配制不同浓度的VC溶液，溶剂为间充质干细胞完全培养基：C母取样量(μl)加入培养基量(μl)VC终浓度(μmol/L)0100001099010209802040960408092080100900100200800200每个样本测定包含测定管和对照管，各设置三次平行重复。测定管需要将100μl样品加入反应体系中，再与已加入反应体系的对照管同时置于37℃中水浴30min后加入显色终止液，最后向对照管中加入100μl样品，混匀后静置10min，在520nm处测定各管吸光度值。根据公式：计算出各样本总抗氧化能力。由图1、图2所示，不同浓度VC及样本组的总抗氧化能力的检测结果对比可知：人胎盘间充质干细胞培养上清具有一定的抗氧化能力，其中总抗氧化能力(T-AOC)约相当于30-70μmol/LVC的总抗氧化能力，且其总抗氧化能力与空白对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。(3)VC组、对照组、样本组(三个不同个体第二代至第六代上清)DPPH·清除率的测定DPPH溶液配制：称取DPPH颗粒0.01g于少量无水乙醇混合，充分搅拌溶解，再以50％乙醇为溶剂定容至50ml，配制成0.2g/L母液，临时使用时用50％乙醇稀释10倍成DPPH溶液，按下式加样；每组三次平行重复：A0：3.5mlDPPH溶液+0.5ml试样溶剂A：3.5mlDPPH溶液+0.5ml试样B：3.5mlDPPH溶液的溶剂(50％无水乙醇)+0.5ml试样根据公式：DPPH·自由基清除率(％)＝[1-(A-B/A0)]*100％(4)对照组、VC组以及样本组(间充质干细胞上清)的抑制羟自由基(·OH)能力的测定实验分为空白管、标准管、对照管和测定管，每管平行测定三次；其中空白管使用双蒸水作为对照，标准管使用0.03％H2O2作为对照。测试前先将各试剂在37℃中水浴平衡，且需在37℃水浴中将各组样品加入反应体系，准确反应1min后加入显色剂，混匀后室温放置20min，在波长为550nm处测定各管吸光度值。根据公式：计算出各管抑制羟自由基能力。(5)对照组、VC组以及样本组(间充质干细胞上清)的抗超氧阴离子自由基(O2—)能力的测定实验分为对照管、标准管和测定管，每管平行测定三次；其中空白管以双蒸水作为对照，标准管以0.15mg/ml的VC标准品作为对照，测定管则加入上清样品。将各组样品加入反应体系后，37℃水浴40min后加入显色剂，混匀后室温放置10min，在波长为550nm处测定各管吸光度值。根据公式：计算出各管抗超氧阴离子活力单位。由图3～图5所示，对照组、VC组以及样本组(间充质干细胞上清)在清除自由基能力的测定结果可知：人胎盘间充质干细胞培养上清在清除DPPH·、·OH和O2—自由基上均具有一定作用，且其清除自由基能力与空白对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。(6)对照组、VC组以及样本组(间充质干细胞上清)的超氧化物歧化酶(SOD)活力的测定实验分为对照管和测定管，每管平行测定三次。其中空白管以双蒸水作为对照，测定管则加入上清样品。将各组样品加入反应体系后，37℃水浴40min后加入显色剂，混匀后室温放置10min，在波长为550nm处测定各管吸光度值。根据公式：计算出各管SOD活力。(7)对照组、VC组以及样本组(间充质干细胞上清)的谷胱甘肽过氧化物酶(GDH-PX)活性的测定实验分为酶促反应和显色反应两阶段进行①酶促反应：实验分为非酶管和酶管，每管平行重复三次。其中酶管需在37℃水浴前加入待测样品，而非酶管在水浴后加入待测样品。酶促反应完成后充分混匀，3800r/min离心10min，取上清1ml做后续显色反应。②显色反应：实验分为空白管、对照管、非酶管和酶管，每管平行重复三次。其中空白管加入GSH标准溶剂应用液，标准管加入20μmol/L的GSH标准液，非酶管和酶管分别加入1ml酶促反应所得上清。将上述样品显色反应体系后，混匀后室温放置15min，在波长为412nm处测定各管吸光度值。根据公式：计算出各管GSH-PX活力单位。由图6、图7所示，对照组、VC组以及样本组(间充质干细胞上清)在抗氧化酶类活性测定结果可知：人胎盘间充质干细胞培养上清中可以检测到超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GDH-PX)活性，且与空白对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。当前第1页1 2 3