研究三叶青提取物提高人共刺激T细胞增殖的方法与流程

本发明属于医药生物
技术领域：
，具体涉及一种研究三叶青提取物提高人共刺激T细胞增殖的方法。
背景技术：
：本发明属于医药生物
技术领域：
，具体涉及一种研究三叶青提取物提高人共刺激T细胞增殖的方法。技术实现要素：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，而提供一种研究三叶青提取物提高人共刺激T细胞增殖的方法，该研究方法为三叶青提取物新的医药用途提供了参考，可为肿瘤免疫治疗药物研发提供实验参考。本发明采用如下技术方案：研究三叶青提取物提高人共刺激T细胞增殖的方法，步骤如下：步骤一，三叶青提取物体外诱导培养人共刺激T细胞；步骤二，检测不同三叶青提取物对人共刺激T细胞生长的影响，记录结果，采用SPSS13.0软件进行统计学处理，计量资料使用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），检验水准α=0.05，P≤0.05有统计学意义。更进一步地，所述的研究三叶青提取物提高人共刺激T细胞增殖的方法，其中步骤一中所述三叶青提取物体外诱导培养人共刺激T细胞具体为：取适量健康献血者外周抗凝血，淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用含有不同细胞生长因子和刺激分子的共刺激T细胞培养基调整细胞密度为3.5×105/mL，接种于细胞培养板中，培养箱培养，定期换液，并调整细胞密度为5×105/mL，收集培养7天的共刺激T细胞，加入单抗进行细胞表面标志检测。更进一步地，所述的研究三叶青提取物提高人共刺激T细胞增殖的方法，其中步骤一中所述细胞生长因子和刺激因子为CD3mAb、CD28mAb、IFN-γ、IL-2、IL-1α、IL-15、IL-18或IL-21。更进一步地，所述的研究三叶青提取物提高人共刺激T细胞增殖的方法，其中步骤一中接种于6孔细胞培养板中，毎孔5mL，所述培养箱为37°C、5%CO2培养箱，所述定期换液为每2天半量定期换液1次，所述加入的单抗为PerCP-Py5.5标记的CD3和FITC标记的CD56。更进一步地，所述的研究三叶青提取物提高人共刺激T细胞增殖的方法，其中步骤二中所述检测不同三叶青提取物对人共刺激T细胞生长的影响，具体为：取培养7天的共刺激T细胞，配成细胞悬液，加入细胞培养板，设11个浓度组，分别加入共刺激T细胞，然后加入不同浓度的三叶青提取物，每组设5个复孔，同时设末加药物空白对照组，于培养箱中培养24h、48h、72h；培养结束前每孔加入CCK820μl，继续培养，后检测各孔吸光值，并记录结果。更进一步地，所述的研究三叶青提取物提高人共刺激T细胞增殖的方法，其中步骤二中所述检测不同三叶青提取物对人共刺激T细胞生长的影响，具体为：取培养7天的共刺激T细胞，配成5×104/mL的细胞悬液，加入96孔细胞培养板，200μl/孔，设11个浓度组，分别加入5×104/mL的共刺激T细胞，180μl/孔，然后加入不同浓度的三叶青提取物，终浓度分别为0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6μg/mL，每组设5个复孔，同时设末加药物空白对照组，于培养箱中培养24h、48h、72h；培养结束前4个小时每孔加入CCK820μl，继续培养4h后于酶标仪450nm处检测各孔吸光值，并记录结果。更进一步地，上述的研究三叶青提取物提高人共刺激T细胞增殖的方法，其中步骤二中所述三叶青提取物为水煮脱糖部位Th-w3，即经有机溶剂提取后的三叶青药材用水煮后，减压蒸馏后所得的脱水物。综上，本发明的主要研究方法为：由健康人外周血中分离单个核细胞，用含CD3mAb、CD28mAb和细胞因子：IFN-γ、IL-2、IL-1α、IL-15、IL-18和IL-21等诱导培养共刺激T细胞。收集培养第7天的共刺激T细胞，使用不同浓度的三叶青提取物作用共刺激T细胞24h、48h和72h后，CCK-8法检测人共刺激T细胞增殖率；MTT法检测三叶青提取对胰腺癌SW-1990生长的影响；流式细胞术（FCM）检测三叶青提取物作用前后共刺激T细胞细胞穿孔素（PFP）、颗粒酶B(GrB)、CD107a的表达；乳酸脱氢酶（LDH）释放法测定三叶青提取物对共刺激T细胞杀伤胰腺癌SW-1990活性；Westernblot检测药物诱导前后共刺激T细胞胞外信号调节激酶（ERK1/2）蛋白表达。用transwellchambers小室进行药物诱导前后胰腺癌SW-1990迁移率检测。划痕愈合实验观察三叶青提取物诱导后胰腺癌SW-1990生长融合情况。与现有技术相比，本发明的有益效果：研究表明，三叶青提取物能明显促进共刺激T细胞增殖，浓度为0.2mg/L时，细胞增殖率比对照组（三叶青提取物浓度：0mg/L）高46%，两者比较有统计学差异（P＜0.05）。在三叶青提取物为0.2mg/L时诱导共刺激T细胞对靶细胞SW-1990杀伤活性最高（69.8%），与对照组（52.1%）比较差异有统计学意义（P＜0.05）。经含三叶青提取物诱导后的共刺激T细胞PFP、GrB、CD107a表达显著高于对照组（P<0.05）。三叶青作用48h后的共刺激T细胞其ERK1/2蛋白表达较对照组均有所上调，浓度在1.6-0.02mg/L时，ERK1/2蛋白表达高于对照组（P<0.05）。经浓度为50、12.5、3.2、0.8、0.2mg/L三叶青诱导48h后，胰腺癌SW-1990通过transwell小孔细胞数以三叶青浓度为12.5mg/L时最低、胰腺癌SW-1990的融合率以3.2mg/L时最低，与对照组比较有统计学意义（P<0.05）。高浓度三叶青提取物能抑制肿瘤细胞生长。因此本申请可为三叶青提取物在制备人共刺激T细胞增殖剂中的新的医药用途提供参考，可为肿瘤免疫治疗药物研发提供实验参考。附图说明图1：共刺激T细胞培养前倒置显微镜下细胞生长状况（×400倍）；图2：共刺激T细胞培养后倒置显微镜下细胞生长状况（×400倍）；图3：培养前PBMC流式结果；图4：培养后共刺激T细胞的流式结果；图5：三叶青提取物（Th-w3）诱导后的共刺激T细胞增殖率；图6：三叶青提取物（TH-W3）对胰腺癌SW-1990细胞株的抑制作用；图7：0.16μg/ml三叶青提取物（TH-W3）诱导后的共刺激T细胞颗粒酶、穿孔素和CD107a的表达；图8：三叶青提取物Th-w3诱导的共刺激T细胞对SW-1990的杀伤活性；图9：三叶青提取物Th-w3诱导48h后共刺激T细胞ERK1/2的表达；图10：三叶青提取物Th-w3诱导48h后共刺激T细胞ERK1/2灰度扫描；图11：0.16μg/ml三叶青提取物TH-W3诱导后SW-1990细胞融合结果；图12：0.16μg/ml三叶青提取物TH-W3诱导后胰腺癌SW-1990细胞穿过率。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例1：三叶青药材提取分离实验情况材料三叶青干燥块根购于宁波市鄞州医药药材公司；80%大孔吸附树脂树色谱仪；Yanaco显微熔点测定仪（温度计未校正）；VarianMAT-212型质谱仪；Bruker-speckospinAC-600P型核磁共振仪。薄层色谱硅胶板与柱色谱硅胶（100~200目、200~300目）均为山东烟台江友硅胶开发公司生产；SephadexLH-20（20~80µm）为Pharmacia公司生产；ODSC18反相硅胶为Merck公司生产；提取用乙醇；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇为药用级，水为蒸馏水，其余试剂均为分析纯。提取液分组：根据提取时所选用的制剂将提取液分为9组，分别命名为：TH-t、TH-p、TH-a、TH-b、TH-w、TH-w1、TH-w2、TH-w3和TH-w4各组三叶青提取物的提取方法：三叶青提取物提取参照文献［杨阳．甘西鼠尾草及头花蓼化学成分研究．第二军医大学硕士学位论文．上海：第二军医大学，2009］分离纯化得到，经高效液相色谱（HPLC）检查。TH-t部分：取三叶青干燥药材200g，加5倍体积80%乙醇水溶液浸泡24h后，加热回流提取，共3次，每次40min，合并提取液，过滤，减压回收蒸干，得总提取物TH-t21.6g，得率10.8%。TH-p部分：取此总提取，加水混悬，分别采用10倍体积的石油醚（水饱和）进行分步萃取。分别得到石油醚部位TH-p0.15g，得率0.075%。TH-a部分：乙酸乙酯部位TH-a0.58g，得率0.29%。TH-b部分：正丁醇部位TH-b2g，得率1%。TH-w部分：以及水部位TH-w18.9g，得率9.45%。TH-w1部分：取水部位进行大孔吸附树脂色谱，先使用纯水进行洗脱，除去糖分，再使用10%、30%、60%、95%乙醇水溶液分别依次洗脱。其中，10%乙醇水洗脱溶液减压回收蒸干后得到水部位脱糖流分TH-w10.14g,得率0.07%。TH-w2部分：取水部位进行大孔吸附树脂色谱，先使用纯水进行洗脱，除去糖分，再使用10%、30%、60%、95%乙醇水溶液分别依次洗脱。其中，30%乙醇水洗脱溶液蒸干后得到水部位脱糖流分TH-w10.3g,得率0.15%。TH-w3部分：将上述经有机溶剂提取后的三叶青药材用水煮后减压回收蒸干，获得脱水物2.1克。TH-w4部分：将上述经有机溶剂提取后的三叶青药材用减压回收蒸干脱水，再使用10%、30%、60%、95%乙醇水溶液分别依次脱糖，其中，获得了10%乙醇水部位脱糖流分。表1为三叶青各成份提取方法和获得量编号部位分组质量实际重量得率180%乙醇总提物（乙醇DMS0）TH-t21.5g0.55g10.8%2石油醚部位(DMS0)TH-p0.15g0.05g0.075%3乙酸乙酯部位(DMS0)TH-a0.58g0.58g0.29%4正丁醇部位(H2O醇)TH-b2g1.4g1%5水部位（H2O）TH-w18.9g0.04g9.45%6水部位脱糖流分（H2O）TH-w10.15g0.15g0.07%7水部位脱糖后流分（H2O）TH-w22.060.3g8水煮物（去糖）TH-w30.6g9水煮物（含糖）TH-w42.1g实施例2：三叶青提取物对共刺激T细胞增殖的影响实验实验材料：无血清培养基、共刺激T细胞培养基（浙江博纳生物科技有限公司产品）；四甲基偶氮唑蓝(methlthiazolyltetrazolium,MTT)和二甲基亚砜(dimethylsμlfoxideDMSO)(Sigma公司)；淋巴细胞分离液(中国科学院血液病研究所)；IL-2、IL-15和IL-21（厦门特宝生物公司）；INF-γ购于Abender公司；胰蛋白酶、RPMl1640、小牛血清(均购自GIBCO公司)；人AB血清(徐州市血站)；入PerCP-Py5.5标记的CD3、FITC标记的CD56单抗、PE标记的穿孔素（pore-formingprotein,PFP)、颗粒酶B(GranzymeB，GrB)、APC标记的CD107a（联科生物有限公司）；乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase,LDH)试剂盒(日本世诺临床诊断制品株式会社)；Encore自动生化分析仪（北京希亚克技术有限公司；荧光倒置显微镜TE2000-S(日本Nikon公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；流式细胞仪分析软件CellQuest，每个标本分析细胞数≥l×104。共刺激T细胞培养及鉴定：取健康献血者外周抗凝血10ml，淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用含有不同细胞生长因子和刺激分子的共刺激T细胞培养基调整细胞密度为3.5×105/mL，接种于6孔细胞培养板中，毎孔5ml，于37°C、5%CO2培养箱培养，每2天半量换液1次，并调整细胞密度为5×105/mL，收集培养7天的共刺激T细胞，加入PerCP-Py5.5标记的CD3、FITC标记的CD56单抗进行细胞表面标志检测。CCK8法检测不同三叶青提取物对人共刺激T细胞生长的影响：取培养7天的共刺激T细胞配成5×104/mL的细胞悬液，加入96孔细胞培养板，200μl/孔。实验组：共设11个浓度组，分别加入5×104/mL的共刺激T细胞，180μl/孔。然后加入不同浓度的三叶青提取物（终浓度分别为0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6μg/ml），每组设5个复孔，同时设末加药物空白对照组：于培养箱中培养24h、48h、72h。培养结束前4个小时每孔加入CCK820μl，继续培养4h后于酶标仪450nm处检测各孔吸光值（OD）记录结果。增殖率（%）=（实验OD值）—（对照OD值）/（对照OD值）×100%。统计方法：采用SPSS13.0软件进行统计学处理，计量资料使用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），检验水准α=0.05，P≤0.05有统计学意义。结果如下：共刺激T细胞鉴定：共刺激T细胞培养前后倒置显微镜下细胞生长状况见图1和图2。培养前外周血PBMC中CD3-CD56+为4.73%，培养10d时的共刺激T细胞CD3-CD56+比率高达38.85%，见图3和图4。各阶段三叶青提取物对共刺激T细胞生长影响如下：在预实验中发现，各提取阶段三叶青提取物对共刺激T细胞生长影响有较大差异，在药物浓度相同条件下，以水煮脱糖部位（Th-w3）时促共刺激T细胞生长活性最强；总提取物（Th-t）、石油醚部位（Th-p）和水部位脱糖流分次之。从图5中可见，三叶青提取物（Th-w3）对共刺激T细胞生长均有时间依赖性，药物诱导时间越长，促进细胞增殖越明显，药物浓度在0.025-0.02μg/ml时促进细胞增殖最明显，浓度高于0.8μg/ml后可抑制细胞增殖。不同药量组和不同时间组与组之间比较均有统计学差异（p＜0.05）。实施例3：三叶青提取物对胰腺癌细胞SW-1990抑制试验实验材料：无血清培养基（浙江博纳生物科技有限公司产品）；四甲基偶氮唑蓝(methlthiazolyltetrazolium,MTT)和二甲基亚砜(dimethylsμlfoxideDMSO)(Sigma公司)；淋巴细胞分离液(中国科学院血液病研究所)；乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase,LDH)试剂盒(日本世诺临床诊断制品株式会社)；Encore自动生化分析仪（北京希亚克技术有限公司；荧光倒置显微镜TE2000-S(日本Nikon公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；流式细胞仪分析软件CellQuest，每个标本分析细胞数≥l×104。三叶青提取物对胰腺癌细胞SW-1990株生长的影响：取对数生长期对胰腺癌细胞SW-1990细胞配成3×107/L的细胞悬液加入96孔板，每孔180μl，每组设5个复孔，同时设阴性对照组；将培养板放入37℃、50mL/LCO2培养箱培养24h后，实验组分别加入不同种类和浓度的三叶青提取物（浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.25、12.5、25、50、100μg/ml），同时设不加药的对照组。于37℃、50mL/LCO2培养箱中培养72h；在培养结束前4小时加入MTT20μl/孔，继续培养4h后弃去上清，加入DMSO150μl，使甲赞完全溶解，于酶标仪495nm处检测各孔吸光值（OD）记录结果。细胞抑制率IR（%）=（对照OD值）—（实验OD值）/（对照OD）×100%。相同实验重复3次，取平均值。统计方法：采用SPSS13.0软件进行统计学处理，计量资料使用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），检验水准α=0.05，P≤0.05有统计学意义。结果如下：将胰腺癌细胞SW-1990用三叶青提取物进行诱导试验，经诱导72小时后，高浓度的三叶青提取物对三种肿瘤细胞均有抑制作用，随着药物浓度的增加抑制越明显。但是，各浓度组对肿瘤细胞抑制浓度均在6.25μg/ml以上，低于1.6μg/ml时各组均无抑制现象。三叶青提取物对SW-1990细胞的抑制率见图6。实施例4：三叶青提取物对共刺激T细胞上穿孔素、CD107a和颗粒酶B的表达和杀伤活性影响实验实验材料：无血清培养基、共刺激细胞T培养基（浙江博纳生物科技有限公司产品）；四甲基偶氮唑蓝(methlthiazolyltetrazolium,MTT)和二甲基亚砜(dimethylsμlfoxideDMSO)(Sigma公司)；淋巴细胞分离液(中国科学院血液病研究所)；IL-2、IL-15和IL-21（厦门特宝生物公司）；INF-γ购于Abender公司；胰蛋白酶、RPMl1640、小牛血清(均购自GIBCO公司)；人AB血清(徐州市血站)；入PerCP-Py5.5标记的CD3、FITC标记的CD56单抗、PE标记的穿孔素（pore-formingprotein,PFP)、颗粒酶B(GranzymeB，GrB)、APC标记的CD107a（联科生物有限公司）；乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase,LDH)试剂盒(日本世诺临床诊断制品株式会社)；Encore自动生化分析仪（北京希亚克技术有限公司；荧光倒置显微镜TE2000-S(日本Nikon公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；流式细胞仪分析软件CellQuest，每个标本分析细胞数≥l×104。共刺激T细胞培养及鉴定：取健康献血者外周抗凝血10ml，淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用含有不同细胞因子和刺激分子的共刺激T细胞培养基调整细胞密度为3.5×105/mL，接种于6孔细胞培养板中，毎孔5ml，于37°C、5%CO2培养箱培养，每2天半量换液1次，并调整细胞密度为5×104/mL，收集培养7天的共刺激T细胞，加入PerCP-Py5.5标记的CD3、FITC标记的CD56单抗进行细胞表面标志检测。LDH释放法检测三叶青提取物（TH-W3）诱导的共刺激T细胞对SW-1990杀伤活性：取经不同浓度（分别为0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56、5.12、10.24μg/ml）三叶青提取物（Th-w3）诱导48h后的共刺激T细胞配成2×109/L，作为效应细胞；对数生长期的胰腺癌细胞SW-1990配成2×108/L，作为靶细胞；将效靶细胞各取0.5ml等量混合（效靶细胞比例=10:1），同时设置不加三叶青提取物为对照组。置37°C、5%CO2培养箱中孵育6h后，轻轻混匀，重悬细胞，1500r/min离心10min，收集上清液。LDH试剂盒按说明书要求操作，340nm波长下Encore自动生化分析仪测定LDH的活性单位(U/L)。每检测样本设3个复管，重复3遍，取平均值。共刺激T细胞的杀伤活性=（测定管LDH单位－效应细胞自然释放LDH管）/（靶细胞最大释放LDH管－靶细胞自然释放LDH管）×100%。流式细胞仪检测共刺激T细胞上穿孔素和颗粒酶B和CD107a的表达：将培养成功的共刺激T细胞配成浓度为1.0×105/ml的细胞悬液，接种于6孔培养板，每孔3ml，然后加入终浓度分别为0.01、0.04、0.16、0.64、2.56μg/ml的三叶青提取物（TH-W3），每组3个复孔。于37℃、5%CO2培养箱中培养48h。收集细胞并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次，每管加入CD56-FITC抗体20μl，避光孵育30min。加入100μl固定液室温避光孵育15min，PBS洗涤1次。每管加100μl破膜液，100μlanti-Perforin抗体及anti-granzymeB-PE抗体和APC标记的CD107a抗体，室温避光孵育15min，PBS洗涤后，重悬于0.5ml的PBS溶液中，分别用流式细胞术检测穿孔素、颗粒酶B和CD107a的表达。统计方法：采用SPSS13.0软件进行统计学处理，计量资料使用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），检验水准α=0.05，P≤0.05有统计学意义。结果如下：三叶青提取物（TH-W3）对共刺激T细胞中颗粒酶B、穿孔素表达的影响结果：与0μg/ml对照组相比，浓度分别为0.01、0.04、0.16、0.64、2.56μg/ml的三叶青提取物（TH-W3）作用共刺激T细胞48h后，其穿孔素和颗粒酶B阳性表达均明显升高，在0.1μg/ml~1.6μg/ml浓度时，具有一定的剂量依赖性。其中，0.2μg/ml三叶青提取物组的穿孔素、颗粒酶B和CD107a阳性表达率达到最高值，分别为90.48%±2.31%、69.66%±1.29%和93.37%±5.11%，而浓度超过6.25μg/ml时穿孔素和颗粒酶B阳性表达率有所下降，结果见图7。三叶青提取物（TH-W3）诱导的共刺激T细胞对SW-1990杀伤活性如下：实验结果显示，浓度为0.64～0.02μg/ml三叶青提取物（TH-w3）作用72h后的共刺激T细胞细胞对胰腺癌细胞SW-1990的杀伤活性显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。在0.16μg/ml时杀伤活性达最高为56.21%，与对照组（42.7%）比较差异有统计学意义（P＜0.05）。三叶青浓度高于2.56μg/ml时，杀伤活性随浓度增高逐渐降低，当浓度为达2.56-10.32μg/ml时，可抑制共刺激T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性（P＜0.05），结果见图8。实施例5：三叶青提取物对共刺激T细胞ERK1/2蛋白表达实验实验材料：无血清培养基和共刺激T细胞培养基（浙江博纳生物科技有限公司产品）；四甲基偶氮唑蓝(methlthiazolyltetrazolium,MTT)和二甲基亚砜(dimethylsμlfoxideDMSO)(Sigma公司)；淋巴细胞分离液(中国科学院血液病研究所)；IL-2、IL-15和IL-21（厦门特宝生物公司）；INF-γ购于Abender公司；人AB血清(徐州市血站)；FITC和PE标记的CD3、FITC标记的CD56（联科生物有限公司）；GAPDH、Bcl-2购自Abcam.；垂直式电泳装置、电转移槽（北京希亚克技术有限公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所）。共刺激T细胞培养及鉴定：取健康献血者外周抗凝血10ml，淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用含有细胞生长因子和刺激分子的共刺激T细胞培养基调整细胞密度为3.5×105/mL，接种于6孔细胞培养板中，毎孔5ml，于37°C、5%CO2培养箱培养，每2天半量换液1次，并调整细胞密度为5×105/mL，收集培养7天的共刺激T细胞，加入PerCP-Py5.5标记的CD3、FITC标记的CD56单抗进行细胞表面标志检测。Westernblot检测三叶青提取物Th-w3作用前后共刺激T细胞p-ERK表达的变化：取培养7天的共刺激T细胞，配成5×108/L细胞悬液，分别接种于6孔板，3ml/孔，加入三叶青提取物Th-w3（终浓度分别至0.01、0.04、0.16、0.64、2.56μg/ml），同时设置不加Th-w3对照组。继续培养48h后，加细胞裂解液500μl裂解细胞，提取蛋白，Forlin检测蛋白浓度，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜、封闭2h，一抗孵育：加入新鲜配制的1:500稀释鼠抗人p-ERK1/2抗体，置于4°C冰箱过夜；二抗孵育：加入1:1000稀释的碱性磷酸酶标记马抗鼠IgG，将滤膜浸入NBT/BCIP显色液，终止反应后取出条带晾干，ODSEEY上机扫描。用ImageJ图像分析软件进行分析。统计方法：采用SPSS13.0软件进行统计学处理，计量资料使用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），检验水准α=0.05，P≤0.05有统计学意义。结果如下：三时青提取物Th-w3对共刺激T细胞ERK1/2表达：不同浓度三叶青提取物Th-w3作用48h后的CD3AK细胞其ERK1/2蛋白表达较对照组均有所上调，浓度在0.64-0.01μg/ml时，ERK1/2蛋白表达均高于对照组，以0.16μg/m最明显，差异有统计学意义（P＜0.05），结果见图9，10实施例6：三叶青提取物（Th-w3）对SW-1990细胞株移动能力实验实验材料：无血清培养基（浙江博纳生物科技有限公司产品）；四甲基偶氮唑蓝(methlthiazolyltetrazolium,MTT)和二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司)；24孔transweUplate(孔径8μm，膜直径6．5mm)和6孔细胞培养板(Coming公司)；淋巴细胞分离液(中国科学院血液病研究所)。细胞迁移实验：按实验设计分为对照组和三叶青提取物Th-w3（浓度为0.01、0.04、0.16、0.64、2.56μg/ml）干预组。取对数生长期的SW-1990细胞，调整密度为1.0×108/L，吸取200μL细胞悬液加入24孔迁移小室（transwellchambers）的上室，下室缓慢加入500μL培养基，37℃、50mL/LCO2培养箱中孵育48h，取出小室用RPMI1640洗涤3次，用棉球擦去上室面的细胞，下室面用无水乙醇固定10min，PBS漂洗后用0.1%的结晶紫染色10min，PBS漂洗3次。显微镜下计数穿过transwell小孔的细胞，观察5个视野并拍照，实验重复3次。侵袭抑制率（IR）=（1-实验组迁移细胞数/对照组迁移细胞数）×100%。划痕愈合实验：将对数生长期的胰腺癌细胞SW-1990用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养，加入6孔细胞培养板中，当SW-1990细胞生长融合达到90%时，用200μL的移液器枪头，在培养板每孔中央的纵轴方向划痕，吸去原培养基，用RPMI1640培养基洗2次，去除划痕区的漂浮细胞。每孔加入10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养5ml，然后分别加入终浓度分别为0.01、0.04、0.16、0.64、2.56μg/ml的三叶青提取物Th-w3干预组，同时设不加药物的对照组，37℃、50mL/LCO2恒温培养箱中孵育，在培养0、24、48h时分别于倒置显微镜下观察细胞融合生长情况并拍照，每组设3个复孔，实验重复3次。统计方法：采用SPSS13.0软件进行统计学处理，计量资料使用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），检验水准α=0.05，P≤0.05有统计学意义。结果如下：划痕愈合实验：经浓度为0.01、0.04、0.16、0.64、2.56μg/ml的三叶青提取物Th-w3诱导48h后，胰腺癌SW-1990的融合率以0.16μg/ml时低，与对照组比较有统计学意义。其他汉黄芩浓度组诱导的SW-1990融合率也较对照组低。结果见图11。迁移实验结果：经浓度为0.01、0.04、0.16、0.64、2.56μg/ml的三叶青提取物Th-w3诱导48h后，胰腺癌SW-1990通过transwell小孔细胞数以三叶青提取物Th-w3浓度为0.16μg/ml时最低；浓度在0.01-2.56μg/ml时，细胞穿过率也低于对照组，各浓度Th-w3诱导组SW-1990细胞穿过率与对照组比较均有统计学差异。通过染色后洗脱液的比色结果换算的侵袭抑制率：药物诱导的各组迁移率均低于对照组。结果见图12。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页1 2 3