体液循环DNA定量检测方法及试剂盒与流程

本发明属于生物样品检测领域，涉及体液循环DNA定量检测方法及试剂盒。

背景技术：

循环DNA(circulating DNA)又称为无细胞状态DNA(cell-free DNA)，存在于体液，如血液(血浆或血清)、尿液、脑脊液以及滑膜液的细胞外DNA。体液循环DNA的定量检测结果受到多种因素影响，会产生较大偏差，其中在核酸提取和长期保存过程中DNA的丢失和降解是其中两个最主要的影响因素。

由于体液样本中循环DNA含量较低，因此需要采用基因扩增手段进行定量分析。基因扩增检测需要对核酸进行提取，由于提取过程中核酸的丢失，其定量结果无法反映体液循环DNA的真实水平；另一方面，各种核酸提取方法的提取效率存在很大差异，且核酸提取的重复性差，会在很大程度上影响定量检测结果的一致性。同时，无论是原始或纯化后的DNA样本，在长期保存过程中存在不同程度的降解，DNA年降解率甚至高达30％，这种变化对于定量检测结果的准确性和最终结论会产生巨大的影响。正因为如此，体液循环DNA定量检测分析一直都没有准确稳定的标准化方法。

传统的体液循环DNA定量方法包括荧光定量PCR外标法和PicoGreen荧光法。荧光定量PCR外标法是针对人看家基因的单重荧光定量PCR，通过已知浓度的外部标准品建立标准曲线，对待测样本进行定量分析，由于标准品和待测样本分别在不同的试管中进行操作，其管间差异较大，影响定量结果的精密度和稳定性。PicoGreen荧光法采用PicoGreen荧光染料与双链DNA非特异性结合，结合后荧光强度显著增加，通过已知浓度的外部标准品建立标准曲线，从而对待测样本进行定量分析，由于是直接检测而未对DNA进行扩增，该方法检测灵敏度较荧光定量PCR法低，且存在较大的管间差异，影响定量结果的精密度和稳定性。为了解决上述问题，发明人前期设计了血浆循环DNA内标法定量检测，详见CN1811387，虽然较PCR外标法和PicoGreen荧光法有一定程度的改进，然而由于内标序列与引物序列设计的问题，造成内标与目的基因扩增目的片段长度不同，导致两者在双重荧光PCR反应过程中的扩增效率不一致，对其定量检测结果仍然存在显著影响。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种体液循环DNA定量检测方法。

本发明的另一目的是提供一种体液循环DNA定量检测试剂盒。

一种非疾病诊断与治疗用途的体液循环DNA定量检测方法，包括：

人工合成带有“A”粘性末端、长度为45bp的线性双链DNA片段，线性双链DNA片段中有25bp序列与β-actin基因相同，该线性双链DNA片段与T-Vector pMD20质粒载体重组后，得到长度为2781bp的环状重组质粒DNA，经限制性内切酶Sma I酶切为线性双链DNA和紫外分光光度法定量后以一定量加入到待测样本中作为内标(图1)；提取待测样本的总DNA，同时包含待测循环DNA和内标，采用双重实时荧光定量PCR法同时扩增循环DNA中的人看家基因β-actin和内标，按照内标的浓度计算被测体液中β-actin基因浓度，以此得出循环DNA含量；其中，双重实时荧光定量PCR反应体系中包含：共用下游引物、分别针对内标和β-actin基因的上游引物、以及分别标记JOE和FAM荧光基团的两个Taqman水解探针，JOE标记的探针针对β-actin基因，FAM标记的探针针对内标，同步进行基因扩增定量检测；所述的线性双链DNA片段序列如SEQ ID NO.1所示；

在双重实时荧光定量PCR扩增内标时，上游引物如SEQ ID NO.2所示，下游引物如SEQ ID NO.3所示，Taqman水解探针如SEQ ID NO.4所示，5’端标记荧光报告基团FAM；

在双重实时荧光定量PCR扩增β-actin基因时，上游引物如SEQ ID NO.5所示，共用下游引物同内标扩增下游引物如SEQ ID NO.3所示，Taqman水解探针序列如SEQ ID NO.6所示，5’端标记荧光报告基团JOE。

本发明所述的非疾病诊断与治疗用途的体液循环DNA定量检测方法优选：每200ul体液样本中加入浓度为1×10⁴拷贝/ul的内标5ul，内标总拷贝数为5×10⁴，充分混匀后立即检测或可长期-20℃以下冷冻保存。

本发明所述的非疾病诊断与治疗用途的体液循环DNA定量检测方法优选：PCR扩增总反应体系25μl，其中，10×Real Time PCR buffer 2.5μl；dNTPs 400μM；MgCl₂ 6mM；内标和β-actin基因的上游引物各200nM；共用下游引物700nM；内标和β-actin基因的TaqMan水解探针各100nM；TaKaRa Ex热启动DNA聚合酶1U；循环DNA为2.5μl。

本发明所述的非疾病诊断与治疗用途的循环DNA定量检测方法优选：PCR扩增反应条件：(1)95℃，5min(2)94℃，30s；55℃，30s；72℃，40s，分别在JOE和FAM荧光信号通道上检测一次荧光信号，共40个循环。

本发明所述的非疾病诊断与治疗用途的体液循环DNA定量检测方法优选：①双重实时荧光定量PCR结果采用7500system SDS软件进行分析，分别在JOE和FAM两个通道设定基线和阈值，基线起始点为6或其它不小于5的数，终点为在荧光信号开始升高处再往前2个循环数，阈值设定在低荧光信号指数扩增区，以此确定目的基因β-actin和内标扩增Ct值，以Ct_b和Ct_i表示；②采用LinRegPCR软件，计算各样本的PCR扩增效率，以E表示；③以下述公式计算血浆DNA含量，单位为拷贝/ml，并以1拷贝双链DNA≈3.3×10^-3ng计算血浆DNA浓度，单位为ng/ml：

C_b＝C_i×(1+E)^(Cti-Ctb)

公式中C_b和C_i分别表示血浆中β-actin基因和内标的起始模板浓度，单位为拷贝/ml，E表示PCR扩增效率，Ct_b和Ct_i分别表示β-actin基因和内标的临界循环数。

一种体液循环DNA定量检测试剂盒，其特征在于包含以下组分：

(1)内标：含序列如SEQ ID NO.1所示的线性双链DNA片段的T-Vector pMD20重组线性质粒；

(2)如SEQ ID NO.2所示的内标的上游引物；

(3)如SEQ ID NO.4所示且5’端标记荧光报告基团FAM的内标Taqman水解探针序列；

(4)如SEQ ID NO.5所示的β-actin基因的上游引物；

(5)如SEQ ID NO.6所示且5’端标记荧光报告基团JOE的β-actin基因的Taqman水解探针序列；

(6)如SEQ ID NO.3所示的内标和β-actin基因共用的下游引物。

其中，内标的浓度优选1.0×10⁴拷贝/μl。

本发明试剂盒中还包含10Real Time PCR buffer、dNTPs、MgCl₂、TaKaRa Ex热启动DNA聚合酶等组分。

有益效果：

针对现有技术存在的问题，本发明进行了如下改进：①重新设计了插入的双链DNA片段，CN1811387中为避免内标与β-actin基因相互干扰，设计的人工合成DNA片段长度为41bp，且与β-actin基因具有完全不同的序列，与人类基因组也完全不同源；本发明通过大量的实验探索，发现将线性双链DNA片段长度增长至45bp，且其中有25bp序列与β-actin基因相同不仅不会造成内标与β-actin基因相互干扰，并且能够提高扩增效率的一致性；②采用线性质粒载体T-Vector pMD20；③重新设计了共用下游引物序列；④内标和β-actin基因扩增产物长度均为91bp。通过上述措施的联合使用，使得β-actin基因和内标能够在同一反应管中进行效率相同且互不干扰的PCR扩增反应，其扩增信号能够被分别检测，从而显著提高了定量方法的性能，经过与我们前期内标法(即CN1811387中权利要求1请求保护的方法，下同)以及其它2种传统方法(即荧光定量PCR外标法和PicoGreen荧光法，下同)的比较，该体液循环DNA定量检测方法具有更高的精密度、线性范围、准确性和稳定性。

附图说明

图1内标制备流程图

图2克隆载体T-Vector pMD20部分序列及外源片段插入位点

图3循环DNA定量方法的线性范围

图4循环DNA定量方法的回收率试验，图中每一系列从左至右依次为本发明方法、前期内标法、外标法、荧光法。

图5不同提取试剂或DNA聚合酶的循环DNA定量检测结果

图6健康体检者血浆循环DNA定量结果

图7健康体检者尿液循环DNA定量结果

具体实施方式

实施例1

(1)内标的合成

人工合成带有“A”粘性末端的线性双链DNA片段，序列如下：

5’-ACGGGAAGCGGTTGGTGGTGCGGGAAATCGTGCGTGACATTAAGA-3’

3’-ATGCCCTT CGCCAACCACCACGCCC TTT AGCACGCACTGTAATTC-5’

将人工设计的两条互补寡核苷酸分别用Tris-EDTA缓冲液稀释为20μmol/L，等体积混匀，置100℃沸水浴中10min，再放于室温自然冷却得到线性双链DNA片段；将线性双链DNA片段重组至质粒载体T-Vector pMD20中(插入位点见图2)，转染至E.coli JM109感受态细胞，体外培养增殖后接种至含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上，直接筛选含有重组克隆的白色大菌落，再采用M13测序通用引物RV和M4进行菌落PCR产物电泳分析和测序验证。提取重组质粒DNA并纯化，经限制性内切酶Sma I酶切为线性双链DNA，紫外分光光度法测定线性重组质粒DNA浓度，稀释至1.0×10⁴拷贝/μl，作为定量检测内标。

(2)样本处理和保存

采用两步离心法处理待测体液样本：于室温1600g水平离心10min，小心吸取上清于1.5ml离心管中，再于4℃16000g离心10min，吸取上层无细胞体液样本，每200μl样本中加入浓度为1.0×10⁴拷贝/μl的内标5μl，振荡混匀后-70℃保存待用。

(3)体液循环DNA提取纯化

采用传统酚-氯仿法或商品化核酸提取试剂盒(如柱吸附、磁珠法等)，提取体液循环DNA。

(4)双重荧光定量PCR

1)针对β-actin基因的荧光定量PCR引物和探针序列

上游引物(24bp)：5’-GGACCTGACTGACTACCTCATGAA-3’(SEQ ID NO.5)

下游引物(25bp)：5’-CTTAATGTCACGCACGATTTCCCGC-3’(SEQ ID NO.3)

Taqman探针(22bp)：5’-JOE-CACCGAGCGCGGCTACAGCTTC-ECLIPSE-3’(SEQ ID NO.6)

β-actin基因扩增产物序列(91bp)：

5’-GGACCTGACTGACTACCTCATGAAGATCCTCACCGAGCGCGGCTACAGCTTCACCACCACGGCCGAGCGGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3’(SEQ ID NO.8)

2)针对内标的荧光定量PCR引物和探针序列

上游引物(24bp)：5’-TGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAG-3’(SEQ ID NO.2)

下游引物(25bp)：5’-CTTAATGTCACGCACGATTTCCCGC-3’(SEQ ID NO.3)

Taqman探针(22bp)：5’-FAM-CGCTTCCCGTAATCCATATGAC-ECLIPSE-3’(SEQ ID NO.4)

内标扩增产物序列(91bp)：

5’-TGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCTACTAGTCATATGGATTACGGGAAGCGGTTGGTGGTGCGGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3’(SEQ ID NO.7)

PCR扩增反应体系：总体系为25μl。其中，10×Real Time PCR buffer 2.5μl；dNTPs 400μM；MgCl₂ 6mM；上游引物各200nM；共用下游引物700nM；TaqMan水解探针各100nM；TaKaRaEx热启动DNA聚合酶1U；循环DNA为2.5μl。

PCR扩增反应条件：(1)95℃，5min(2)94℃，30s；55℃，30s；72℃，40s，分别在JOE和FAM荧光信号通道上检测一次荧光信号(共40个循环)。

(5)结果分析和计算

①荧光定量PCR结果采用7500system SDS软件进行分析，分别在FAM和JOE两个通道设定基线和阈值。基线起始点为6或其它不小于5的数，终点为在荧光信号开始升高处再往前2个循环数，阈值设定在低荧光信号指数扩增区，以此确定目的基因β-actin和内标扩增Ct值，以Ct_b和Ct_i表示。②采用LinRegPCR软件，计算各样本的PCR扩增效率，以E表示。③以下述公式计算体液循环DNA含量(拷贝/ml)，并以1拷贝双链DNA≈3.310^-3ng计算体液循环DNA浓度(ng/ml)。

C_b＝C_i×(1+E)^(Cti-Ctb)

公式中C_b和C_i分别表示体液样本中β-actin基因和内标的起始模板浓度(拷贝/ml)，E表示PCR扩增效率，Ct_b和Ct_i分别表示β-actin基因和内标的临界循环数。

实施例2方法学考察

所有样本来自健康体检者(50例)，采用EDTA-K₂抗凝真空采血管采集肘静脉血(2ml/管)，室温静置96小时后，于室温1600g水平离心10min，小心吸取上清于1.5ml离心管中，再于4℃16000g离心10min，吸取上层无细胞血浆，混合后磁珠法提取血浆DNA，紫外分光光度法测定吸光度值并计算DNA浓度，将混合血浆用生理盐水稀释为1000、100、10、1.0和0.1ng/ml不同浓度。分别采用本发明方法、前期内标法、传统外标法和荧光法进行检测比较，方法的具体步骤如下：

本发明：参见“实施例1”。

前期内标法：参见CN1811387中的说明书“具体实施方式”。

外标法：①PCR扩增反应体系：总体系为25μl。其中，10 Real Time PCR buffer 2.5μl；dNTPs400μM；MgCl₂6mM；上游和下游引物各200nM；TaqMan水解探针100nM；TaKaRa Ex热启动DNA聚合酶1U；血浆DNA模板投入量为2.5μl。②PCR扩增反应条件：95℃，5min预变性，再94℃，30s；55℃，30s；72℃，40s，循环反应40次，每次反应在JOE信号通道上检测一次荧光信号。③结果计算：荧光定量PCR结果采用7500system SDS软件进行分析，在JOE荧光信号通道设定基线和阈值。基线起始点为6或其它不小于5的数，终点为在荧光信号开始升高处再往前2个循环数，阈值设定在低荧光信号指数扩增区，以此确定目的基因β-actin扩增Ct值，以浓度分别0.1、1.0、10、100和1000ng/ml的基因组DNA作为外部标准品，建立定量检测标准曲线，以此计算待测样本的血浆DNA含量。

荧光法：将PicoGreen荧光染料用TE缓冲液(pH＝7.0)200倍稀释成工作液，50μl血浆DNA样本与50μl PicoGreen工作液混匀，室温避光孵育5min，以480nm为激发光源波长，在荧光分光光度计中检测520nm波长的荧光信号，并以浓度分别为0.1、1.0、10、100和1000ng/ml的λDNA为外部标准品，建立定量检测标准曲线，以此计算待测样本的血浆DNA含量。

(1)精密度：如表1所示，对于不同浓度的样本，本发明方法的批内和批间CV值均小于前期内标法和传统方法，特别是对于浓度为1.0ng/ml及其以下的样本，本发明方法的检测精密度较其他方法显著提高。

表1血浆循环DNA定量方法的批内和批间CV值

(2)线性范围：如图3所示，本发明方法对0.1-1000ng/ml范围内的循环DNA定量检测的线性相关系数r²达到0.996(图3A)，较前期内标法的线性相关性显著提高(图3B)；传统外标法和PicoGreen荧光法的线性范围为1-1000ng/ml(r²分别为0.965和0.961)。

(3)准确度：由于经典核酸定量方法检测灵敏度低，对于微量的循环DNA无法检出，缺乏对照方法，因此对于准确度我们采用回收率实验进行评价，结果如图4所示，回收率越接近100％，表明该方法的准确性更高。PCR外标法对1000、100、10和1ng/ml循环DNA的回收率均值分别为73.1％、77.9％、57.3％和48.6％、；PicoGreen荧光法分别为75.2％、74.6％、61.1％和50.7％、，均低于100％，差异有统计学意义(P<0.01)。前期内标法对1000、100和10ng/ml循环DNA的回收率均值分别为99.4％、93.7％和94.1％，与100％的回收率比较，差异无统计学意义(P值均大于0.05)；但是对于1ng/ml的样本回收率均值为86.2％，低于100％，差异有统计学意义(P<0.01)，表明前期内标法对于浓度为1ng/ml的样本无法准确定量。本发明方法对1000、100、10和1ng/ml循环DNA的回收率均值分别为100.3％、98.7％、102.8％和96.5，与100％的回收率比较，差异无统计学意义(P值均大于0.05)，显示了较高的准确性。

(4)稳定性：本发明和传统方法对采用4种不同试剂提取的循环DNA进行定量检测，结果见图5A。由于4种试剂对循环DNA提取效率各不相同，采用传统外标法和荧光法的定量结果各不相同，差异有统计学意义(P<0.05)；前期内标法结果虽然有所改善，但仍然存在差异(P<0.05)；而本发明方法对采用不同试剂提取的循环DNA定量结果没有差异(P＝0.956)。该结果表明，无论采用何种提取方法，虽然存在不同程度的核酸提取丢失，本发明能够通过内标的校准作用，得到稳定可靠的定量检测结果。

本发明和前期内标法以及传统PCR外标法采用4种不同厂家(ABI、MBI、Promega和Takara)的Taq DNA聚合酶进行荧光定量PCR扩增，其循环DNA定量结果见图5B。采用不同Taq DNA聚合酶进行内标法测定的血浆DNA定量结果之间的差异无统计学意义，而前期内标法和外标法的差异有统计学意义(P<0.001)。该结果表明本发明方法不受DNA聚合酶活性的影响，检测结果更加稳定可靠。

实施例3健康体检者血浆样本检测

400例健康体检者,年龄25-60岁，平均年龄43岁，男性200例，女性200例。收集EDTA-K₂抗凝外周静脉血，两步离心法分离获得无细胞血浆标本，采用磁珠法试剂盒提取血浆DNA，分别采用本发明方法、前期内标法、传统外标法和荧光法进行定量测定，结果如图6。本发明方法检测结果显著高于前期内标法、传统外标法和荧光法，差异均有统计学意义(P<0.001)。本发明通过内标的内参照作用，消除了核酸提取丢失造成的测量误差，因此其定量结果高于其他方法，且趋势相对集中，并且发现男性血浆DNA水平显著高于女性，而其它方法并未发现此差异。

实施例4健康体检者尿液样本检测

1000例健康体检者,年龄25-60岁，平均年龄42岁，男性500例，女性500例。收集晨尿标本，两步离心法分离获得无细胞尿液标本，采用磁珠法试剂盒提取尿液DNA，采用本发明方法进行定量测定，结果如图7。健康体检者尿液DNA定量范围为1.0～296.4ng/ml(中位值：18.1ng/ml；四分位距：30.5ng/ml)，其中84％其尿液DNA在50ng/ml以下，12％在50-100ng/ml之间，4％超过100ng/ml，尿液DNA水平在该1000例健康人群中呈正偏态分布(图7)。不同性别或年龄组之间的尿液DNA含量差异无统计学意义。

<110> 南京麦科林生物医药科技有限公司

<120> 体液循环DNA定量检测方法及试剂盒

<160> 8

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 线性双链DNA片段正义链序列

<400> 1

acgggaagcg gttggtggtg cgggaaatcg tgcgtgacat taaga 45

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 针对内标的荧光定量PCR上游引物

<400> 2

tgcatgcctg caggtcgact ctag 24

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 针对内标的荧光定量PCR下游引物

<400> 3

cttaatgtca cgcacgattt cccgc 25

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 针对内标的Taqman探针

<400> 4

cgcttcccgt aatccatatg ac 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 针对β-actin基因的荧光定量PCR上游引物

<400> 5

ggacctgact gactacctca tgaa 24

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 针对β-actin基因的Taqman探针

<400> 6

caccgagcgc ggctacagct tc 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 内标扩增产物序列

<400> 7

tgcatgcctg caggtcgact ctagaggatc tactagtcat atggattacg ggaagcggtt 60

ggtggtgcgg gaaatcgtgc gtgacattaa g 91

<210> 8

<211> 91

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β-actin基因扩增产物序列

<400> 8

ggacctgact gactacctca tgaagatcct caccgagcgc ggctacagct tcaccaccac 60

ggccgagcgg gaaatcgtgc gtgacattaa g 91