本发明涉及一种产多种L-氨基酸的基因工程菌及应用，属于基因工程领域。
背景技术：
：氨基酸指含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称，在饲料添加剂、食品添加剂、医药、化妆品及表面活性剂等领域均有广泛的应用。据统计，2006年全球的氨基酸原料生产已经达到280万吨，其中用于医药、保健及化妆品等领域的约40万吨，占14.5％；用于饲料添加剂约60万吨，占21.5％；用于调味剂及食品添加剂约180万吨，占64％。至2010年，氨基酸的产量已超过数千万吨。目前氨基酸的工业生产方式主要是通过微生物发酵法，即利用微生物在特定的环境条件下，添加碳源，氮源等营养物质，使微生物生长繁殖而大量获得目的氨基酸，常用的生产氨基酸的微生物为大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，谷氨酸棒杆菌，酵母菌，霉菌等，然而上述微生物往往只能高产一至两种特定氨基酸，其余氨基酸往往产量较低甚至不能生产。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供一种产多种氨基酸的基因工程菌，所述基因工程菌是敲除了编码聚酮合酶基因NCgl2773的谷氨酸棒杆菌。在本发明的一种实施方式中，所述产多种氨基酸的基因工程菌，其分类命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)WGYF001，已于2016年8月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO:M2016425，保藏地址为中国武汉武汉大学。本发明的第二个目的是提供所述基因工程菌的方法，所述方法是将敲除了编码聚酮合酶基因NCgl2773的载体转入谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)中，通过同源重组获得的NCgl2773缺陷型基因工程菌。在本发明的一种实施方式中，所述敲除了编码聚酮合酶基因NCgl2773的载体核苷酸序列如SEQIDNO.1-NO.4所示。在本发明的一种实施方式中，所述敲除了编码聚酮合酶基因NCgl2773的载体是根据如下方法构建的：(1)以C.glutamicumATCC13869基因组为模板，扩增NCgl2773基因上下游片段，其序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.3所示，(2)以pDTW202为模板扩增Kan抗性基因片段，(3)将上述基因片段与载体pBlueScriptIISK(+)连接；所述pBlueScriptIISK(+)序列如SEQIDNO.4所示。在本发明的一种实施方式中，所述方法的主要步骤为：(1)以C.glutamicumATCC13869基因组为模板，分别以2773U-F/R及2773D-F/R为引物扩增各1000bp的NCgl2773基因上下游片段2773-U及2773-D；以pDTW202(JinyuHu，YanzhenTan，YanyanLi，XiaoqingHu，DaqingXu，XiaoyuanWang，2013.Constructionandapplicationofanefficientmultiple-gene-deletionsysteminCorynebacteriumglutamicum.)为模板，Kan-lox-F/R为引物扩增Kan抗性基因片段；2773-U以XhoI、BamHI酶切，2773-D以EcoRI、XbaI酶切，Kan片段以BamHI、EcoRI酶切，三片段一起连入以XhoI及XbaI酶切的pBlueScriptIISK(+)，构建完成的质粒即NCgl2773敲除载体，命名为pYFW-1(图1)；(2)将NCgl2773敲除载体pYFW-1转化宿主菌，通过同源重组获得NCgl2773基因缺陷型表达宿主菌。本发明的第三个目的是提供所述基因工程菌生产L-氨基酸的方法，所述方法是以脑心浸液肉汤培养基，30℃，200～250r/min培养10～90h。在本发明的一种实施方式中，所述脑心浸液肉汤培养基含有37g/L脑心浸液。本发明的第四个目的是提供所述基因工程菌在制备含氨基酸的产品中的应用。在本发明的一种实施方式中，所述应用包括制备饲料添加剂、食品添加剂、保健品、医药制剂、化妆品、表面活性剂等领域。有益效果：本发明的基因工程菌在发酵时不需要外源添加生物素和表面活性剂，节约生产成本，利于工业化生产。与出发菌相比，分枝菌酸层消失，变得薄而疏松，L-氨基酸合成和分泌均得到提高，使L-氨基酸产量显著提高。本发明构建的基因工程菌WGYF001通过摇瓶发酵可显著提高L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-苏氨酸的产量，与出发菌相比，分别提高34.67倍、13.05倍、37.28倍，同时有效提高了L-组氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸的产量，与出发菌相比，产量增幅均在20％以上。生物材料保藏谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)WGYF001，已于2016年8月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO:M2016425，保藏地址为中国武汉武汉大学。附图说明图1为NCgl2773基因敲除载体pYFW-1的构建；图2为本发明的基因工程菌WGYF001摇瓶发酵产L-谷氨酸含量；图3为本发明的基因工程菌WGYF001摇瓶发酵产L-天冬氨酸含量；图4为本发明的基因工程菌WGYF001摇瓶发酵产L-苏氨酸含量；图5为本发明的基因工程菌WGYF001摇瓶发酵产L-组氨酸含量；图6为本发明的基因工程菌WGYF001摇瓶发酵产L-酪氨酸含量；图7为本发明的基因工程菌WGYF001摇瓶发酵产L-缬氨酸含量；图8为本发明的基因工程菌WGYF001摇瓶发酵产L-甲硫氨酸含量；图9为本发明的基因工程菌WGYF001摇瓶发酵产L-苯丙氨酸含量；图10为本发明的基因工程菌WGYF001摇瓶发酵产L-异亮氨酸含量；图11为本发明的基因工程菌WGYF001摇瓶发酵产L-亮谷氨酸含量；图12为本发明的基因工程菌WGYF001胞内L-天冬氨酸含量；图13为本发明的基因工程菌WGYF001胞内L-谷氨酸含量。具体实施方式引物本发明涉及的引物如表1所示。表1本发明涉及引物培养基电转感受态培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10，甘氨酸30，Tween801，去离子水配制，自然pH；电转恢复培养基(g/L)：蛋白胨5，酵母提取物2.5，NaCl5，D-山梨醇91，脑心浸液18.5，去离子水配制，自然pH；脑心浸液肉汤培养基(BHIS培养基)(g/L)：脑心浸液37，D-山梨醇91，去离子水配制，自然pH，固态加15琼脂粉；脑心浸液肉汤发酵培养基(BHI培养基)(g/L)：脑心浸液37，去离子水配制，自然pH。HPLC检测氨基酸样品预处理：利用HPLCOPA(邻苯二甲醛)柱前衍生化法检测发酵液中的氨基酸。将发酵液于12000r/min离心5min，用10％三氯乙酸适当稀释，使L-氨基酸终浓度为100-500mg/L，4℃放置12h，12000r/min离心20min，0.22μm水相针式滤器过滤。检测条件：色谱柱：ThermoHypersilODS-24.6*250mm(5μm)，柱温：40℃。流动相：水相A：无水乙酸钠3.01g，先溶于水，然后加三乙胺200μL，四氢吠喃5mL，ddH2O定容至1L，5％乙酸调节至pH7.2；有机相B：无水乙酸钠3.01g，ddH2O定容为200mL，5％乙酸调节至pH7.2，然后再加400mL甲醇(色谱纯)和400mL乙睛(色谱纯)，流速为1mL/min。样品跑柱子前需进行柱前衍生，衍生完成的样品进入色谱柱进行梯度洗脱，洗脱程序如下：实施例1NCgl2773基因敲除载体pYFW-1的构建以C.glutamicumATCC13869基因组为模板，分别以2773U-F/R及2773D-F/R为引物扩增各1000bp的NCgl2773基因上下游片段2773-U及2773-D，其序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；以pDTW-202(JinyuHu，YanzhenTan，YanyanLi，XiaoqingHu，DaqingXu，XiaoyuanWang，2013.Constructionandapplicationofanefficientmultiple-gene-deletionsysteminCorynebacteriumglutamicum中构建)为模板，Kan-lox-F/R为引物扩增Kan抗性基因片段，其序列如SEQIDNO.3所示；2773-U以XhoI、BamHI酶切，2773-D以EcoRI、XbaI酶切，Kan片段以BamHI、EcoRI酶切，三片段一起连入以XhoI及XbaI酶切的序列如SEQIDNO.4所示的pBlueScriptIISK(+)，构建完成的质粒即NCgl2773敲除载体，命名为pYFW-1(图1)实施例2NCgl2773基因缺陷型表达宿主菌的构建将pYFW-1电转化谷氨酸棒杆菌，通过同源重组，Kan抗性筛选，获得NCgl2773基因敲除转化子，再通过转化子分离纯化，挑取阳性转化子，进行菌落PCR和基因测序验证，最终获得缺陷型表达宿主菌。实施例3转化率分别制备ATCC13869和WGYF001的感受态细胞，同时电转化质粒pDXW-10(DaqinXu，YanzhenTan，FengShi，XiaoyuanWang，2010.AnimprovedconstitutiveshuttlevectorconstructedformetabolicengineeringresearchinCorynebacteriumglutamicum中构建)，电击条件1.80KV，6ms；1.62KV，6ms；1.44KV，6ms，转化液涂布BHISKan平板，30℃培养50h后，计数转化子个数，结果见表1。根据结果可以看到，敲除NCgl2773后，WGYF001细胞通透性发生改变，在电压降低的情况下，转化子数量显著增多，转化率相比野生菌明显增强。表1转化子计数实施例4最小抑菌浓度(MIC)30℃，200rpm过夜培养ATCC13869和WGYF001，分别稀释至新BHI培养基，使OD562＝1。取新的96孔板，从A1孔开始，每孔加入90ul菌液，然后由左向右分别加入经过连续二倍稀释的抗生素溶液10ul，盖好盖，30℃，200rpm过夜培养后，测量OD562。设置阳性对照组：90ul菌液+10ulPBS缓冲液；阴性对照组：90ulBHI培养基+10ulPBS缓冲液；空白对照组：100ulPBS缓冲液。定义最小抑菌浓度(MIC)为：恰好满足|OD实验组-OD阳性对照|≤0.05*OD阳性对照时，所对应的孔的抗生素浓度，示意图如表2，结果见表3。根据结果可以看到，WGYF001耐药性相比野生菌有较大幅度下降，而氯霉素和庆大霉素均是作用于细菌rRNA，需要穿过细胞壁，由此可推断WGYF001细胞壁相比野生菌更为薄而疏松。表2二倍连续法示意12345678910111220212223242526272829210211212213214215216217218219220221222223阳性阴性空白数值为该孔的抗生素稀释倍数表3菌株的耐药性实施例5摇瓶发酵从保藏菌株WGYF001的甘油管中划取一环菌液在固态BHIS培养基上划线，30℃培养48h。利用接种环从活化好的平板上刮取一环菌苔转接到装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，30℃，200r/min培养10h。从培养好的种子液中吸取一定菌液接种至装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，使初始OD＝0.1，30℃，200rpm培养，直至发酵结束(t＝78h)。胞内氨基酸含量测定，取之前离心剩下的菌体，PBS缓冲液洗两遍，终浓度20mg/mL溶菌酶37℃处理1h，进行超声破碎，破碎两轮，测定胞内氨基酸含量。与出发菌相比，WGYF001胞内L-谷氨酸和L-天冬氨酸只在14h被检测到，之后均未被检测到，而两株菌的L-苏氨酸在所有四个时间点均未被检测到，说明胞内苏氨酸几乎全部分泌到胞外。胞外发酵液中氨基酸含量测定结果显示，与出发菌相比，WGYF001通过摇瓶发酵可显著提高L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-苏氨酸的产量，与出发菌相比，分别提高34.67倍、13.05倍、37.28倍，同时有效提高了L-组氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸的产量，与出发菌相比，产量增幅均在20％以上。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。当前第1页1 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