一种遗传性耳聋易感基因20个位点分型检测试剂盒的利记博彩app

本发明涉及生物
技术领域：
中基因多态性检测领域，具体涉及遗传性耳聋易感基因，包括线粒体DNA、GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因共20个位点的多态性检测。
背景技术：
：耳聋是临床上常见的疾病，由遗传性因素引起的约占60%左右，其中先天性重度耳聋、大前庭水管综合征、药物性耳聋、迟发性耳聋导致的耳聋占比分别是：21%、18.6%、3.7%、2.1%。现阶段我国人群携带遗传性耳聋致病基因突变的比例约为12%，即每100人中有12人携带可导致遗传性耳聋的基因缺陷。2008～2010年我国先天性耳聋发生率分别为1.99‰、2.15‰和2.19‰，即每1000个新生儿中就有2～3名聋儿，其中一半以上的新生聋儿是由致聋基因突变导致的遗传性耳聋。这些家庭极有可能再次生育聋儿，有血缘关系的家族其他成员也存在生育聋儿的风险。通过耳聋遗传检测，可以帮助耳聋患儿家庭找到耳聋病因，揭示遗传规律，预测再发风险，为遗传性耳聋家庭成员提供可靠的遗传咨询，通过产前诊断可以预测胎儿听力状况、预防聋儿出生。近年来，随着分子生物学、遗传学等的快速发展，与耳聋相关的基因不断的被定位和发现，目前已经确定了200多个基因与非综合征型耳聋相关，为遗传性耳聋基因检测提供了有力的依据。发病率排前的包括：GJB2，SLC26A4，MYO15A，OTOF，TRIOBP，MYO7A，PCDH15，LOXHD1，OTOG，CDH23、GJB3、12SrRNA。目前临床上广泛开展的常见耳聋基因诊断包括GJB2、GJB3、SLC26A4、线粒体12SrRNA基因。其中GJB2基因35delG、167delT、176_191del16、235delC、299_300delAT变异与先天性重度或极重度感音神经性耳聋密切相关；GJB3基因的538C→T、547G→A变异与后天高频感音神经性耳聋密切相关；SLC26A4基因281C→T、589G→A、IVS7-2A→G、1174A→T、1226G→A、1229C→T、IVS15+5G→A、1975G→C、2027T→A、2162C→T、2168A→G等位点的变异与大前庭水管综合征密切相关；12SrRNA基因1494C→T、1555A→G等位点变异与药物敏感性耳聋密切相关。临床上常用于遗传性耳聋的检测方法为PCR测序方法和基因芯片的方法，但这些方法都是低通量检测，效率低，成本也高，很难实现临床快速检测和大量新生儿筛查。另外，目前耳聋基因检测专利多数集中在GJB2、SLC26A4和线粒体DNA位点上，很少有与与后天高频感音神经性耳聋密切相关的GJB3基因的变异检测。基于此，为实现一次性检测可覆盖多个易感位点，本发明基于SNaPshot技术在基因分型上可以一次性检测多个位点的优势，用来检测包括GJB3基因热点变异在内的20个基因热点。SNaPshot技术是一种基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术，也称小测序，主要针对中等通量的SNP分型项目，通常用于10-30个左右的SNP位点分析。由于涉及到多重PCR扩增和片段延伸，一次反应检测过多的位点，很可能会造成假阴性和假阳性的结果出现，为了保证临床检测结果的准确性，本发明用两次反应，完成20个位点的检测，一次反应只检测10个位点，避免发生由于扩增、杂峰等问题导致假性结果。技术实现要素：基于上述临床检测中存在的问题和不足，本发明公开了一种基于SNaPshot技术检测人类遗传性耳聋相关基因多态性的试剂盒，可一次性快速、准确、灵敏的检测包括线粒体DNA、GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因在内的共20个易感位点，并尽可能提高检测准确性，避免假阴性和假阳性的发生，为遗传性耳聋提供孕前预防、孕中干预、孕后治疗和用药指导的参考。为达到上述目的，本发明的技术方案是：提供一种遗传性耳聋易感基因20个位点分型检测试剂盒，其特征在于：包括了线粒体基因的1494C>T、1555A>G共2个位点，GJB2基因的35dleG、299-300delAT、235delC、176-191del19、167delT共5个位点，GJB3基因的547G>A、538C>T共2个位点，SLC26A4基因的281C>T、589G>A、IVS7-2A>G、1174A>T、1226G>A、IVS15+5G>A、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G共10个位点的PCR扩增引物和单碱基延伸引物。其中，所述线粒体基因的1494C>T、1555A>G位点扩增引物序列如SEQIDNo：1和SEQIDNo：2所示；所述GJB2基因35dleG、299-300delAT、235delC、176-191del19、167delT位点的扩增引物如SEQIDNo：3和SEQIDNo：4所示；所述GJB3基因的547G>A、538C>T位点的扩增引物如SEQIDNo：5和SEQIDNo：6所示；所述SLC26A4基因的281C>T位点的扩增引物如SEQIDNo：7和SEQIDNo：8所示；所述SLC26A4基因的589G>A位点的扩增引物如SEQIDNo：9和SEQIDNo：10所示；所述SLC26A4基因的IVS7-2A>G位点的扩增引物如SEQIDNo：11和SEQIDNo：12所示；所述SLC26A4基因的1174A>T、1226G>A位点的扩增引物如SEQIDNo：13和SEQIDNo：14所示；所述SLC26A4基因的IVS15+5G>A位点的扩增引物如SEQIDNo：15和SEQIDNo：16所示；所述SLC26A4基因的1975G>C、2027T>A位点的扩增引物如SEQIDNo：17和SEQIDNo：18所示；所述SLC26A4基因的2162C>T、2168A>G位点的扩增引物如SEQIDNo：19和SEQIDNo：20所示。所述针对线粒体基因的1494C>T、1555A>G2个位点，GJB2基因的35dleG、299-300delAT、235delC、176-191del19、167delT5个位点，GJB3基因的547G>A、538C>T2个位点，SLC26A4基因的281C>T、589G>A、IVS7-2A>G、1174A>T、1226G>A、IVS15+5G>A、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G10个位点，共20个位点的延伸引物序列如SEQIDNo：21～SEQIDNo：40所示。更进一步地，所述的20个位点的扩增引物分成两组进行扩增，第一组包含线粒体基因的1494C>T、1555A>G位点和GJB2基因35dleG、299-300delAT、235delC、176-191del19、167delT位点，GJB3基因的547G>A、538C>T位点以及SLC26A4基因的281C>T位点的扩增引物SEQIDNo：1～SEQIDNo：8；第二组包含SLC26A4基因589G>A、IVS7-2A>G、1174A>T、1226G>A、IVS15+5G>A、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G位点的扩增引物SEQIDNo：9～SEQIDNo：20。所述20个位点的延伸引物，对应各位点的扩增分组，也分成两组进行延伸反应。所述试剂盒，包括5组试剂，其中第一组为PCR扩增试剂，由PCR扩增酶混合液、PCR扩增引物组1和引物组2组成；第二组为PCR产物纯化试剂；第三组为单碱基延伸反应试剂，由延伸反应酶反应混合液，延伸引物组1和引物组2组成；第四组为延伸产物纯化试剂；第五组为上机检测试剂。上述技术方案的一种优选是：上述第一组PCR扩增体系为20μL，所述1494C>T、1555A>G、35dleG、299-300delAT、235delC、176-191del19、167delT、547G>A、538C>T、281C>T位点的扩增引物SEQIDNo：1～SEQIDNo：8在体系的终浓度分别为0.05μM、0.05μM、0.1μM、0.1μM、0.15μM、0.15μM、0.05μM、0.05μM。第二组PCR扩增体系为20μL，所述589G>A、IVS7-2A>G、1174A>T、1226G>A、IVS15+5G>A、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G位点的扩增引物SEQIDNo：9～SEQIDNo：20在体系的终浓度分别为0.1μM、0.1μM、0.1μM、0.1μM、0.1μM、0.1μM、0.3μM、0.3μM、0.075μM、0.075μM、0.15μM、0.15μM。上述技术方案的一种优选是：上述第一组延伸反应体系为5μL，所述1494C>T、1555A>G、35dleG、299-300delAT、235delC、176-191del19、167delT、547G>A、538C>T、281C>T位点的延伸引物EQIDNo：21～SEQIDNo：30在体系中的终浓度为0.04μM、0.5μM、0.04μM、0.1μM、0.5μM、1μM、0.4μM、0.1μM、0.4μM、0.16μM。第二组延伸反应体系为5μL，所述589G>A、IVS7-2A>G、1174A>T、1226G>A、IVS15+5G>A、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G位点的延伸引物SEQIDNo：31～SEQIDNo：40在体系的终浓度为分别为0.1μM、0.2μM、0.6μM、0.2μM、0.3μM、0.1μM、0.3μM、0.3μM、0.5μM、0.3μM。上述技术方案中：所述试剂盒还可包括阳性对照液、阴性对照液用于对试剂盒进行质量控制，避免出现假阳性和假阴性结果；所述阳性対照液为人类DNA溶液，浓度为10ng/μL；所述空白对照液为Tris-HCL缓冲液（PH=8.0）。本发明的积极效果在于：（1）本发明首次将其他相关产品不包括的基因GBJ3的热点突变位点进行检测和准确分型，对预防后期高频感音神经性耳聋有积极效果。（2）通过大量资料的查阅，本发明挑选出中国人20个耳聋易感位点，分成两组进行PCR扩增和延伸，克服了临床上其他相关产品分型时，一个反应体系包含位点过多，而造成的不稳定性，避免由于多重扩增时过多引物之间的相互干扰，导致假阳性、假阴性结果，可有效提高准确率到100%；实现了遗传性耳聋基因型检测的高效、低成本、高确度。附图说明图1是本发明的检测一个样本的结果的附图。具体实施方式下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本
发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。实施例1一、试剂盒的组成。本实施例的遗传性耳聋易感基因20个位点分型检测试剂盒试剂盒，包括包括5组试剂，其中第一组为PCR扩增试剂，由PCR扩增酶混合液、PCR扩增引物组1和引物组2、阳性对照液和阴性对照液组成；第二组为PCR产物纯化试剂；第三组为单碱基延伸反应试剂，由延伸反应酶反应混合液，延伸引物组1和引物组2组成；第四组为延伸产物纯化试剂；第五组为上机检测试剂。具体组分如下：表3试剂盒（96人份/盒）组成表二、试剂盒的使用方法。本实施例的用于检测人类遗传性耳聋易感基因20个位点分型试剂盒的具体检测步骤如下：1、DNA提取。采用血样DNA提取试剂盒提取样本1（样本1是EDTA抗凝全血），具体的操作参见DNA试剂盒抽提产品说明书。2、样本DNA质量检测。获得样本DNA后，通过测定浓度和OD260/OD280的比值控制样本质量，最终加入反应体系中的样本，OD260/OD280的比值在1.7～2.0之间的可获得最优反应结果，浓度为5～20ng/μl较为合适。3、PCR反应。所需试剂为PCR扩增试剂组中的试剂，充分融化试剂组试剂，每个样品需要分两个PCR反应管分别扩增（其中样本包括待测样本+阳性对照+阴性对照），扩增体系如下所示：PCR反应管1：试剂用量(μL)SEL-202xMastermix10μLSEL-20PrimerPairMix11μL模板9μLTotal20ulPCR反应管2：试剂用量(μL)SEL-202xMastermix10μLSEL-20PrimerPairMix21μL模板9μLTotal20ul将配置好的PCR反应管，在PCR扩增仪上用如下程序进行PCR扩增：第一步：96℃处理1min；第二步：94℃10s，59℃1min，72℃1min，进行30个循环；最后：60ºC处理10min。得到扩增好的PCR产物。4、PCR产物纯化。所需试剂为PCR产物纯化组中的试剂，充分融化试剂组试剂。1）将扩增的产物样品瞬时离心到1000rpm，后停止；2）将磁珠溶液SEL-20FA混匀，加26ul磁珠溶液SEL-20FA，用干净的磁珠纯化用硅胶垫密封96孔PCR板；3）室温旋涡震荡混匀1min后，吸附3min，期间震荡混匀1次，持续30s，吸附结束后，再次旋涡震荡混匀30s，短离心到1000rpm。震荡一定要充分，震荡时盖严胶垫，将两96孔PCR板重叠压紧避免串孔污染4）将96孔PCR板固定到磁力架上，静置磁吸（1~2min）直至溶液澄清透明5）揭开胶垫，连同磁力架将96孔PCR板倒置在干净的吸水纸上，倒甩离心，到370rpm按stop键（离心机升速降速调至2）；6）将96孔PCR板从磁力架上取下，每孔样品加入80ul洗涤液SEL-20FW，用硅胶垫密封96孔板，充分旋涡震荡混匀1min，瞬时离心1000rpm后，放到磁力架上磁吸30s，7）揭开硅胶垫，连同磁力架一起将96孔板倒置在干净的吸水纸上，倒甩离心，到370rpm按stop键（离心机升速降速调至2），8）重复步骤79）将96孔板从磁力架上取下，室温风扇吹干3min，纯水预热65℃；10）加入预热纯水15ul，盖上胶垫，旋涡震荡混匀，室温静置3min，期间震荡混匀一次，吸附后再次旋涡震荡混匀，短离心到1000rpm，将96孔PCR板固定在磁力架上，静置磁吸（1~2min）直至溶液透明澄清；11）揭开胶垫，把纯化好的多重PCR产物样品转移到新的pcr管中，注意不要吸出磁珠。12）纯化后的样品用于下一步实验。5、延伸反应。所需试剂为单碱基延伸反应试剂组试剂，使用前充分融化试剂中各组分。使用干净的0.2mlMicroAmp®反应板并正确标记，进行批量扩增，或者根据反应的数目，使用干净的0.2ml的反应管，并对其正确标记。每个样品的两个PCR反应管分别延伸反应，延伸反应体系如下所示：PCR反应管1：试剂用量(μL)SEL-20PerformMasterMix0.5μLSEL-20PerformPrimerMix11μLPCR反应管1纯化后产物2μLH2O1.5μLTotal5ulPCR反应管2：试剂用量(μL)SEL-20PerformMasterMix0.5μLSEL-20PerformPrimerMix21μLPCR反应管2纯化后产物（5.B.）2μLH2O1.5μLTotal5ul将配置好的PCR反应管，在PCR扩增仪上用如下程序进行单碱基延伸：第一步：96℃处理2min；第二步：96℃20s，50℃20s，60℃30s，进行25个循环；最后：60ºC处理10min。得到经过延伸反应的产物。6、延伸产物纯化所需试剂为延伸产物纯化试剂组中试剂，充分融化试剂中各组分。使用干净的0.2mlMicroAmp®反应板并正确标记，进行批量扩增，或者根据反应的数目，使用干净的0.2ml的反应管，并对其正确标记。每个样品的两个PCR反应管分别进行纯化，纯化体系如下所示：PCR反应管1：试剂用量(μL)SEL-20RemoveMix0.5μLSEL-20RemoveBuffer0.6μLPCR反应管1Perform后产物5μLTotal6.1μlPCR反应管2：试剂用量(μL)SEL-20PerformMasterMix0.5μLSEL-20PerformPrimerMix20.6μLPCR反应管2Perform后产物5μLTotal6.1μl延伸产物纯化程序为：37℃孵育保温1hr，然后65℃保温15min7、上机电泳检测所需试剂为电泳检测试剂组中试剂，充分融化试剂中各组分。使用干净的0.2mlMicroAmp®反应板并正确标记，进行批量扩增，或者根据反应的数目，使用干净的0.2ml的反应管，并对其正确标记。每个样品的两个PCR反应管分别反应，反应体系如下所示：PCR反应管：试剂用量(μL)InternalLaneStandard120LIZ0.2μLHiDi4μLPCR反应管纯化后产物后产物0.8μLTotal5ul电泳上机检测程序：95℃变性5min，4℃迅速冷却后，进行上机电泳。8、结果判读（1）试剂盒有效性的判定根据阳性对照、空白对照电泳检测结果，判定试剂盒的有效性；其中阳性对照，电泳检测结果显示各个检测位点都为明显的峰，20个位点的空白对照，电泳检测，都无峰值图，即无信号，否则可能存在污染，样本检测结果不可靠。（2）样本位点基因型的判定在确定试剂盒的阳性对照检测结果和空白对照检测结果与完全正确无误后，对检测样本结果进行判读，根据电泳后对应样本的延伸产物峰的位置和颜色确定检测位点的分型结果，样本1检测结果见图1所示。9、PCR产物测序验证采用基因检测的金标准-Sanger测序的方法20个位点进行测序验证，测序结果与采用本试剂盒的检测结果完全一致。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。<110>杭州吉洛生物医药科技有限公司<120>一种遗传性耳聋易感基因20个位点分型检测试剂盒<130>2016<160>40<170>PatentInversion3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1cagaaaactacgatagccctt21<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>2ttagtccttgctatattatgcttgg25<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>3tggggcacgctgcagacgatcc22<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>4ccacagtgttgggacaag18<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5tcaagctcatcattgagttc20<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>6caccagcttgtggtggca18<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>7gagagcctttggtgtgctaaaga23<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>8ctacaggaaagatacaggccttg23<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>9ggtgagtttaatggtgggat20<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>10tttcccttctctcatcctcaat22<210>11<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>11gtatgtatgtaatggtctctgta23<210>12<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>12aaccaaataatgctgaactttctaa25<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>13attccattcactaggcagtg20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>14ctccagtgctctcctggacg20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>15aaatggaaaaattagctggg20<210>16<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>16gactgtaaattatttgaaggcaa23<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>17tcttttggataatttgatatg21<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>18acagattaagcaacttgccc20<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>19acaaaaatttcttttcctag20<210>20<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>20ataaacctacacattgtagaactat25<210>21<211>59<212>DNA<213>人工序列<400>21aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagcgcgtacacaccgcccgtcac59<210>22<211>59<212>DNA<213>人工序列<400>22aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaacctacgcatttatatagaggag59<210>23<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>23aaaaaaaaaaaaaaaagctgcagacgatcctggggg36<210>24<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>24aaaaaaaaaaaaaaaaacatgcacgtggcctaccggagac40<210>25<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>25tctcccacatccggctatgggcc23<210>26<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>26gggagatggggaagtagtgatcgtagc27<210>27<211>43<212>DNA<213>人工序列<400>27aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaacgactttgtctgcaacaccc43<210>28<211>54<212>DNA<213>人工序列<400>28aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaatgctacattgcccgacctacc54<210>29<211>53<212>DNA<213>人工序列<400>29aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaatc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