一种β‑胡萝卜素单加氧酶的制备方法及其应用与流程

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种β-胡萝卜素单加氧酶的制备方法及其应用。

背景技术：

全反式视黄醛，又称维生素A醛，是维生素A合成的重要前体，在抵抗肌肤衰老方面具有重要生理功能。全反式视黄醛通过生理作用可以转化为活性维生素A，具有双重抗衰老作用，不仅促进细胞代谢，还能提亮肤色。全反式视黄醛可被氧化为反式视黄酸，在免疫缺陷病及癌症治疗中具有重要作用。此外，全反式视黄醛是传统的β-胡萝卜素制备工艺的重要中间体。

全反式视黄醛一般通过视黄醇氧化反应获得，由于视黄醇的分子结构中具有多个共轭双键，对热、光或氧气等极不稳定，在氧化反应过程中容易形成多种氧化产物,同时氧化剂使用会产生大量污染物，因此很难适用于工业化生产（Helv.Chim.Acta 40, 265 (1957)；中国专利200710157075.0；中国专利93118128.3）。通过对β-紫罗兰酮和环柠檬醛侧链上进行增碳反应（Tetrahedron. Lett. 35,7383(1994); Chem. Lett. 1201 (1975)），也可以合成全反式视黄醛，但是由于该方法中β-紫罗兰酮和环柠檬醛的价格昂贵，并且需要多个反应步骤，因此也不适用于工业生产。

鉴于目，提出一种利用β-胡萝卜素单加氧酶制备全反式视黄醛方法。

技术实现要素：

本发明为解决前化学合成方法制备全反式视黄醛的不足的技术问题，提供了一种β-胡萝卜素单加氧酶的制备方法及其应用。

为解决上述技术问题，采用以下技术方案：

一种β-胡萝卜素单加氧酶的制备方法，构建β-胡萝卜素单加氧酶基因的原核表达载体，将原核表达载体导入大肠杆菌中表达，经Ni-NTA柱亲和层析和分子筛纯化后，得到纯化的普β-胡萝卜素单加氧酶。

所述β-胡萝卜素单加氧酶基因来源于弓形栖热菌，保藏号为CGMCC NO.1.6992。

一种β-胡萝卜素单加氧酶的应用，所述β-胡萝卜素单加氧酶作为催化剂，在反应液中催化底物β-胡萝卜素，反应温度45-55℃，反应时间20-30 h，反式视黄醛的转化率达89.5%。

所述反应液的成分为：50mmol/L NaCl、5 mmol/L FeSO₄·7H₂O、20 mmol/L TCEP、2%（w/v）OTG、1% （w/v）Tween 80、5 mmol/L DTT、50mmol/L pH 8.0的Tricine/KOH缓冲液。

所述催化剂的浓度为4U/mL，底物浓度为1000 mg/L。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明得到了一种栖热菌β-胡萝卜素单加氧酶的基因序列和氨基酸序列，该酶是在弓形栖热菌Thermus arciformis中发现并制备获得的第一个β-胡萝卜素单加氧酶；

（2）本发明获得了一种不同于已发现β-胡萝卜素单加氧酶的新型酶资源，该β-胡萝卜素单加氧酶具有不同的氨基酸序列和酶学特性；

（3）本发明建立了栖热菌β-胡萝卜素单加氧酶制备全反式视黄醛的方法，并优化了反应条件，经优化后全反式视黄醛转化率达到89.5%。

附图说明

图1为纯化后的β-胡萝卜素单加氧酶SDS-PAGE分析，其中M：蛋白Marker；1、2和3道为纯化后栖热菌β-胡萝卜素单加氧酶；

图2为β-胡萝卜素单加氧酶的最适反应温度曲线图；

图3为β-胡萝卜素单加氧酶的最适pH曲线图；

图4为β-胡萝卜素单加氧酶具有转化制备全反式视黄醛HPLC结果；

图5为酶浓度对全反式视黄醛产量的影响；

图6为底物浓度对全反式视黄醛产量的影响；

图7为在最佳反应条件下全反式视黄醛产量。

具体实施方式

1. 一种弓形栖热菌（Thermus arciformis）β-胡萝卜素单加氧酶的制备方法，包括菌株、质粒、工具酶、培养基，引物设计，PCR扩增及重组质粒的构建，基因的诱导表达与蛋白质的纯化。具体步骤如下：

（1）菌株、质粒、酶与培养基：

大肠杆菌Escherichia coli DH5α、限制性内切酶NdeI和BamHI、Pyrobest DNA聚合酶、DNA连接酶、细菌基因组DNA提取试剂盒kit ver.3.0购自TAKARA公司；大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）购自Novagen公司；LB培养基：每升含Tryptone 10 g, Yeast extract 5 g, NaCl 10 g；氨苄青霉素浓度为100 mg/L, 氯霉素浓度为34 mg/L；弓形栖热菌（Thermus arciformis）保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1.6992；克隆与表达质粒载体pET22b购自Novagen公司。

（2）弓形栖热菌T. arciformis菌株培养：

弓形栖热菌T. arciformis培养基成分(1 L): Tryptone 1 g, Yeast extract 1 g, 安三乙酸0.1 g，CaSO₄ 0.05 g, MgSO₄·7H₂O 0.1 g, NaNO₃ 0.8 g, KNO₃ 0.1 g, K₂HPO₄ 0.2 g,微量元素溶液1 mL。

微量元素溶液成分(1 L):NaCl 8 g, FeCl₃·6H₂O 0.5 g, MnSO₄·H₂O 2.5 g,ZnSO₄·7H₂O 0.5 g, H₃BO₃ 0.5 g, CuSO₄·5H₂O 0.025 g, Na₂MoO₄·2H₂O 0.025 g, CoCl₂·6H₂O 0.5 g。

以1mol/L NaOH调pH为7.2,121℃灭菌30min后加入适量无菌的0.5 mol/L Na₂CO₃/NaHCO₃溶液调pH为9.0。

培养条件：70℃、转速200 r/min震荡培养24 h至OD_600nm为0.5左右。将菌液转至灭菌的50 mL离心管，4℃下4,000 g离心10 min，弃上清，收集菌体。

（3）PCR扩增及重组质粒的构建：

利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取弓形栖热菌T. arciformis基因组DNA（提取方法见试剂盒说明书）。按照目前已经报道β-胡萝卜素单加氧酶保守氨基酸序列，设计引物，上游引物如SEQ ID NO：1所示，其中CATATG为NdeI酶切位点；下游引物如SEQ ID NO：2所示。其中GGATCC为BamHI酶切位点。以弓形栖热菌T. arciformis基因DNA为模板，PCR技术扩增β-胡萝卜素单加氧酶基因片段,PCR反应体系（100μL）如下：模板1 μL（50 ng）, dNTP (25 mmol/L) 2μL，引物（100 μmol/L）各1μL，MgCl₂(25 mmol/L) 2μL，10×缓冲液10μL，Probest^TM DNA 聚合酶 (5U/μL) 1μL，超纯水82 μL。PCR反应条件：95℃4 min；95℃30s，56℃30s，72℃ 2 min，35个循环。

将质粒pET22b及经琼脂糖凝胶回收β-胡萝卜素单加氧酶基因片段，使用限制性内切酶NdeI和BamHI分别进行双酶切，双酶切液进行回收。双酶切反应体系（20 μL）如下：PCR产物/pET22b 16μL（400 ng），NdeI 内切酶（15 U/μL）1μL，BamHI内切酶（15 U/μL）1μL，10×缓冲液 2 μL。双酶切反应混合液30℃反应6h。

进一步通过目的基因与载体pET22b的连接，获得重组质粒，并进行双酶切（如图1所示）及测序验证。经测序分析鉴定得到β-胡萝卜素单加氧酶基因的序列，如SEQ ID NO：3所示；β-胡萝卜素单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

（4）基因的诱导表达与蛋白质的纯化：

将测序正确的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中。挑取平板上的单菌落于20 mL含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中，培养12-16 h。按2%接种量转接入1 L含氨苄青霉素和氯霉素LB液体培养基中，培养2.5h，使OD₆₀₀nm在0.4-0.6。加入终浓度0.5mmol/L IPTG于30℃继续培养8h，4℃4,000 rpm/min离心20 min。收集的菌体悬浮在30 mL破壁buffer（50mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 100mmol/LNaCl）中，超声波破碎菌体（功率300w，超声时间5秒，间隔时间5秒，超声次数150次）。超声波破碎菌体,12, 000×g离心15min，得到粗酶液。将得到的粗酶液用0.22 μm滤膜过滤，Ni-NTA琼脂糖亲和层析进行蛋白纯化，步骤如下：分别用3 mL水和5 mLCharge buffer（50 mmol/L NiSO₄）洗 1 ml 琼脂糖树脂，然后3 mL Binding buffer（20mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 500 mmol/L NaCl, 5 mmol/L咪唑）平衡柱子。过滤过的蛋白溶液加入柱子中，结合 Ni-NTA树脂上。用6 mL Wash buffer （20mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 500 mmol/L NaCl, 20 mmol/L咪唑）去除非特异结合的蛋白，然后用6 mLElute buffer（20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 500 mmol/L NaCl, 1 mol/L咪唑）洗脱结合在树脂上的蛋白。将过镍柱后蛋白溶液透析在平衡buffer（50mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 200 mmol/L NaCl）中，然后用AKTA FPLC蛋白纯化系统分子筛柱纯化蛋白。分子筛条件为Sephacryl TM S-100 HR column层析柱用50 mmol/L Tris-HCl, 200 mmol/L NaCl 缓冲液(pH 7.5) 平衡，流速为1 ml/min。SDS-PAGE蛋白电泳检测收集下来的蛋白。

2.栖热菌β-胡萝卜素单加氧酶的酶学性质分析鉴定

检测栖热菌β-胡萝卜素单加氧酶酶活性，采用以下反应体系：2 mg/mLβ-胡萝卜素、50mmol/L NaCl、5 mmol/L FeSO₄·7H₂O、20 mmol/L三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐（TCEP）、2%（w/v）辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷（OTG）、1% （w/v）Tween 80、5 mmol/L DTT、50mmol/LTricine/KOH缓冲液（pH 8.0）和0.5U/mLβ-胡萝卜素单加氧酶酶液,50℃酶解120 min，加入5%的甲醛终止反应。以不含有酶液的上述反应体系作为对照组。酶活力单位定义为：在一定条件下，每分钟生成1 微摩尔的全反式视黄醛所需要的酶量为一个活力单位(U)。

高效液相色谱HPLC检测反应产物，所用色谱柱为Alltech PrevailC18柱(美国奥泰公司，25 cm × 4.6 cm)，采用日本岛津SPD-M10A二极管阵列检测器。检测β-胡萝卜素，流动相为正己烷：甲基叔丁基醚（95:5,v/v），洗脱速度为1.0 mL/min，在波长460 nm检测；检测全反式视黄醛，流动相为乙腈：水（90:10,v/v），洗脱速度为0.4 mL/min，在波长370 nm检测。

通过对栖热菌β-胡萝卜素单加氧酶进行分析鉴定，得到该酶的主要以下酶学性质如下：

（1）得到编码栖热菌β-胡萝卜素单加氧酶的基因序列，共960碱基，基因序列如SEQ ID NO：1所示。

（2）得到编码栖热菌β-胡萝卜素单加氧酶的氨基酸序列，共319氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

（3）得到纯化的栖热菌β-胡萝卜素单加氧酶蛋白电泳图如图2所示。重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)表达后，经超声波破壁、50℃ 热处理、镍柱亲和层析和分子筛Sephacryl TM S-100，得到纯化重组β-胡萝卜素单加氧酶，分子量大小为35KDa，结果如图1所示。

（4）栖热菌β-胡萝卜素单加氧酶最适反应温度和pH分别为50℃和8.0（如图2和3所示）。

3. 栖热菌β-胡萝卜素单加氧酶转化β-胡萝卜素制备全反式视黄醛

HPLC检测结果如图4所示，栖热菌β-胡萝卜素单加氧酶具有转化β-胡萝卜素制备全反式视黄醛的活性。在β-胡萝卜素单加氧酶的酶活性标准反应体系中，优化催化合成全反式视黄醛产量。

酶的浓度：分别在反应体系中添加栖热β-胡萝卜素单加氧酶0—6 U/mL，检测全反式视黄醛产量。结果表明，4U/mL的酶液作用下，全反式视黄醛的产量最高，达到400mg/mL（如图5所示）。

底物浓度：分别在反应体系中添加不同浓度底物β-胡萝卜素（0-1000 mg/L），检测全反式视黄醛产量。结果表明，在底物β-胡萝卜素浓度为600 mg/l，β-紫罗兰酮的相对产量最高，达到562.3400 mg/mL（如图6所示）。

在以上实验结果的基础上，建立栖热菌β-胡萝卜素单加氧酶转化β-胡萝卜素制备全反式视黄醛的最佳反应条件，酶浓度4U/mL，β-胡萝卜素浓度1000mg/L，反应温度50℃，反应pH 8.0，其它反应条件为标准反应体系。结果如图6所示，反应25h后，产生569.3mg/L全反式视黄醛，同时消耗600mg/Lβ-胡萝卜素，根据催化反应式，计算生成全反式视黄醛的转化率达到89.5％。以上实验结果表明栖热菌β-胡萝卜素单加氧酶可以高效催化合成全反式视黄醛，具有较好的工业应用价值。

4、栖热菌β-胡萝卜素单加氧酶的应用

全反式视黄醛，不仅可以作为维生素A合成的重要前体，在抵抗肌肤衰老、免疫缺陷病及癌症治疗中也具有重要作用。本发明在弓形栖热菌T. arciformis中发现了一个能够高效催化裂解β-胡萝卜素的β-胡萝卜素单加氧酶。采用分子生物学方法构建了栖热菌β-胡萝卜素单加氧酶的原核表达载体，并将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)。经Ni-NTA柱亲和层析和分子筛纯化后，得到纯化的普β-胡萝卜素单加氧酶。经SDS-PAGE电泳检测，分子质量是35KD。酶学性质研究表明，该酶的最适温度50℃，最适pH8.0。经优化最佳反应条件：底物β-胡萝卜素浓度1000 mg/L，栖热菌β-胡萝卜素单加氧酶4.0U/mL，反应温度50℃，水解反应25 h，50mmol/L NaCl、5 mmol/L FeSO₄·7H₂O、20 mmol/L三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐（TCEP）、2%（w/v）辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷（OTG）、1% （w/v）Tween 80、5 mmol/L DTT、50mmol/LTricine/KOH缓冲液（pH 8.0）。在此条件下，生成569.3mg/L全反式视黄醛，转化率达到89.5%。到目前为止，还未见采用生物酶法制备全反式视黄醛。综上所述，栖热菌β-胡萝卜素单加氧酶具有良好的催化活性，可以高效催化降解β-胡萝卜素，制备高纯度的全反式视黄醛，适用于全反式视黄醛生物酶法制备，具有较好的工业应用前景。