本发明涉及一种花青素的提取方法，尤其涉及一种从越橘中提取纯化花青素的方法。
背景技术：
越橘(Vaccinium spp.)又名温普、红豆、牙疙瘩、小苹果，属杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium spp.)的灌木类浆果果树，原产于北美和欧洲，是地球上少有的真正蓝色食物之一，有“浆果之王”、“北国红豆”之美誉。越橘果实味道鲜美，营养丰富，经济价值较高，还含有VC、VA、VB等多种维生素以及K、Mg、Ca、Fe等大量矿物元素，并且富含酚酸、黄烷醇、类黄酮等酚类化合物。我国《本草纲目》中记载越橘果实成熟后，酸甜可食，可入药，有强筋益气、益肾固精之效；《吉林中草药》记载越橘果可以止痛，治肠炎、痢疾。
越橘果实中花青素含量很高而且种类丰富，花青素属于类黄酮化合物，其基本结构母核是2-苯基苯并呋喃。由于B环R1、R2、R3上的取代基不同(OH或OCH3)，形成各种各样的花色素。据美国Tufts大学的农业部人类营养研究中心发布的研究报告，越橘是他们研究过的40多种水果和蔬菜中含抗氧化成分最丰富的一种资源，因而其抗氧化能力很强，并具有促进视红素再合成，抗炎症，增强机体免疫力，抗心血管疾病，清除自由基、抗衰老，抑制癌症细胞发生等药理学功效。越橘花青素受到国内外专家的高度关注，目前成为越橘研究热点之一。
国内外关于花青素生产技术的研究报告很多，现有越橘花青素的提取方法主要是采用大孔吸附树脂和离子交换树脂两种方法共同实现的。经查，现有专利号为CN201010503367.7的中国专利《一种蔓越橘果实中花色苷和原花青素类成分的提取方法》，包括以下步骤：先将蔓越橘果实破碎处理，用生物酶酶解后，在pH值1.0～5.5条件下进行水浸提，得水提取液和残渣；再将残渣进行醇提萃取，浓缩萃取液回收醇，得醇提浓缩液；将水提取液与醇提浓缩液合并，通过大孔吸附树脂吸附，用水洗涤大孔吸附树脂后，用含水醇溶液解析，将解析液浓缩、干燥，得含花色苷和原花青素类成分的混合物；此方法采用乙醇水提，成本较高，使用磷酸调pH，对环境污染严重，并且得到的产品是花色苷和原花青素的混合物，原花青素含量低；另外现在药学工作者多运用水提醇沉法去除中药材煎煮液中的无效成分，近年来，大量的研究及实践证明醇沉法易造成有效成分的损失，存在较多问题。且存在成本较高，生产周期长，生产工时多，劳动强度高，成品稳定性差等问题。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种从越橘中提取纯化花青素的方法，具有工艺简单、收率高、环境污染少、成本低的特点。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种从越橘中提取纯化花青素的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)原料预处理：选取新鲜的越橘果实或低温储藏并解冻的冻果，拣选除杂备用；
2)微生物降解：将步骤1)预处理的越橘果实接种微生物进行降解，接种量为0.5～2％，温度40～60℃，初始含水量为20～40％，PH为4～6，降解时间3～6小时。
3)水提：向微生物降解后的越橘果实中加入料液比1:10～1:14的蒸馏水，室温条件下避光搅拌2～3次，每次1.5～2.5小时，得到提取液；
4)絮凝除杂：向上述得到的提取液中加入一定量的絮凝剂，在30～50℃下搅拌均匀后静置，然后通过过滤和离心除去提取液中的固型杂质；
5)树脂纯化除杂：将步骤4)得到的越橘提取液用大孔树脂进行吸附并用体积分数为5～15％、60～80％乙醇进行梯度洗脱，收集60～80％洗脱液；
6)浓缩：将步骤5)得到的60～80％洗脱液进行减压浓缩，回收乙醇；
7)喷雾干燥：浓缩液进行喷雾干燥，得到目标成分精制越橘花青素。
作为优选，所述步骤2)中的微生物为木霉、黑曲霉、青霉菌或者固氮菌。
作为优选，所述步骤2)中微生物降解中其降解接种量为0.5％，温度50℃，初始含水量为30％，PH值为5.0，降解时间为5小时。
优选，所述步骤2)中微生物降解中培养基的主要成分为蔗糖12～13％、磷酸二氢钾3～4％、硫酸镁0.02～0.03％、硝酸铵0.1～0.3％、山芋粉3～4％。
再优选，所述步骤2)中微生物降解中培养基的主要成分为蔗糖12.6％、磷酸二氢钾3.85％、硫酸镁0.026％、硝酸铵0.2％、山芋粉3.78％。
作为优选，所述步骤3)中按料液比1:10加入蒸馏水，搅拌为2次，每次2小时。
再优选，所述步骤4)的絮凝剂为ZTC1+1，添加量为提取液重量的2～3％，搅拌时间为10～30min，静置时间为1～2小时。
再优选，所述步骤5)中所述的大孔树脂的型号为D101、D4020、AB-8、HPD-100、DA201中的一种，大孔树脂吸附后用3～4倍柱体积纯水除糖、蛋白质。
作为改进，所述步骤6)的减压浓缩的真空度为0.075-0.095Mpa，温度为60℃以下，浓缩至体积1/5-1/20，且无醇味。
最后，所述步骤7)中喷雾干燥前需对浓缩液进行灭菌，喷雾干燥的进风温度为110～130℃，出风温度为45～55℃。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1.纤维素菌代谢的的主要产物乙酸，可以对花青素进行分子修饰--酰基化反应，酰基化能有效地阻碍花青素随温度及PH变化而发生结构转变，对花色苷的稳定起到很重要的作用；
2.花青素流动的糖链将折叠好的酰基缠绕在2-苯并吡喃骨架表面，这种堆积作用不仅保护花色素的结构，而且能保持系统色泽的稳定性；
3.降解条件温和，提取花青素稳定性要好于常规提取方法；
4.纤维素降解菌的胞外代谢产物含有大量的纤维素酶，利用酶可以温和的作用于植物组织，破坏细胞壁，从而促进生物活性成分的释放，提高越橘果实中花青素的出汁率，显著提高提取率；
5.ZTC1+1为从食品中提取出的天然澄清剂，由A和B两种组分构成，采用“1+1”澄清技术，一组分起主絮凝作用，另一组分通过“搭桥”起辅助絮凝作用，大大加快了澄清过程。对胶体不稳定成分的一步清除率在70％左右，二步清除率在90％以上；它可代替中药水提醇沉工艺，提高有效成分的含量，保证中药成品质量的稳定性。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
选取经过拣选除杂后新鲜的越橘果实或低温储藏并解冻的冻果50g，装入250mL三角瓶中，加入培养基，灭菌，培养基的主要成分为蔗糖12.6％、磷酸二氢钾3.85％、硫酸镁0.026％、硝酸铵0.2％、山芋粉3.78％。然后在无菌操作台上按接种量0.5％将单一青霉菌接入瓶中，加入蒸馏水，使原料的含水量达到30％，PH值达到5.0，在智能培养箱中50℃条件下培养降解5小时；按料液比1:10(g/ML)加入蒸馏水，避光搅拌2次，每次2小时得到提取液；提取液中加入2％的ZTC1+1絮凝剂，在温度40℃的条件下搅拌10min,后静置1小时，然后通过过滤和离心除去提取液中的固型杂质；将上述离心液用前处理好D101型大孔树脂吸附，吸附饱和后，用3倍柱体积的纯水洗脱糖蛋白质等杂质，再分别用5％、70％乙醇溶液梯度洗脱，收集70％乙醇溶液的洗脱液，上样量15ml/min，洗脱流速3.5ml/min；收集的70％乙醇洗脱液减压浓缩，减压浓缩真空度为0.075-0.095Mpa,温度为50℃以下，浓缩至体积1/5-1/20，且无醇味；浓缩液灭菌后，进行喷雾干燥，得到目标成分精制越橘花青素，得到含花青素为27.2％的产物0.21g，产品总收率为84％。喷雾干燥的的进风温度120℃，出风温度50℃。
实施例2
选取除杂后新鲜的越橘果实或低温储藏并解冻的冻果50g，装入250mL三角瓶中，加入培养基，灭菌，培养基的主要成分为蔗糖12％、磷酸二氢钾3.5％、硫酸镁0.02％、硝酸铵0.3％、山芋粉3％。然后在无菌操作台上按接种量2％.将单一黑曲霉菌接入瓶中，加入蒸馏水，使原料的含水量达到20％，PH值达到4.0，在智能培养箱中60℃条件下培养降解3小时；按料液比1:12(g/ML)加入蒸馏水，避光搅拌3次，每次2小时得到提取液；提取液中加入3％的ZTC1+1絮凝剂，在温度50℃的条件下搅拌20min，后静置1.5小时，然后通过过滤和离心除去提取液中的固型杂质；将上述离心液用前处理好AB-8型大孔树脂吸附，吸附饱和后，用4倍柱体积的纯水洗脱糖蛋白质等杂质，再分别用10％、60％乙醇溶液梯度洗脱，收集60％乙醇溶液洗脱液，上样量15ml/min，洗脱流速3.5ml/min；收集的60％乙醇洗脱液减压浓缩，减压浓缩真空度为0.075-0.095Mpa,温度为60℃以下，浓缩至体积1/5-1/20，且无醇味；浓缩液灭菌后，进行喷雾干燥，得到目标成分精制越橘花青素，得到含花青素为21.6％的产物0.16g，产品总收率为64.1％喷雾干燥的进风温度120℃，出风温度50℃。
实施例3
选取除杂后新鲜的越橘果实或低温储藏并解冻的冻果50g，按料液比1:14(g/ML)加入蒸馏水，避光搅拌3次，每次2小时得到提取液；液中加入2.5％的ZTC1+1絮凝剂，在温度30℃的条件下搅拌30min,后静置2小时，然后通过过滤和离心出去提取液中的固型杂质；将上述离心液用前处理好D4020型大孔树脂吸附，吸附饱和后，用4倍柱体积的纯水洗脱糖蛋白质等杂质，再分别用15％、80％乙醇溶液梯度洗脱，收集80％乙醇溶液洗脱液，上样量15ml/min，洗脱流速3.5ml/min；收集80％乙醇洗脱液减压浓缩，减压浓缩真空度为0.075-0.095Mpa,温度为40℃以下，浓缩至体积1/5-1/20，且无醇味；浓缩液灭菌后，进行喷雾干燥，得到目标成分精制越橘花青素，得到含花素为18.7％的产物0.09g，产品总收率为36.7％。喷雾干燥的进风温度120℃，出风温度50℃。
实施例4
选取经过拣选除杂后新鲜的越橘果实或低温储藏并解冻的冻果50g，装入250mL三角瓶中，加入培养基，灭菌，培养基的主要成分为蔗糖12.6％、磷酸二氢钾3.85％、硫酸镁0.026％、硝酸铵0.2％、山芋粉3.78％。然后在无菌操作台上按接种量0.5％将单一青霉菌接入瓶中，加入蒸馏水，使原料的含水量达到30％，PH值达到5.0，在智能培养箱中50℃条件下培养降解5小时；按料液比1:10(g/ML)加入蒸馏水，避光搅拌2次，每次2小时得到提取液；将上述提取液的离心液用前处理好D101型大孔树脂吸附，吸附饱和后，用3倍柱体积的纯水洗脱糖蛋白质等杂质，再分别用5％、70％乙醇溶液梯度洗脱，收集70％乙醇溶液的洗脱液，上样量15ml/min，洗脱流速3.5ml/min；收集的70％乙醇洗脱液减压浓缩，减压浓缩真空度为0.075-0.095Mpa,温度为50℃以下，浓缩至体积1/5-1/20，且无醇味；浓缩液灭菌后，进行喷雾干燥，得到目标成分精制越橘花青素，得到含花青素为15.7％的产物0.11g，产品总收率为44.2％。喷雾干燥的的进风温度120℃，出风温度50℃。
实施例5
选取经过拣选除杂后新鲜的越橘果实或低温储藏并解冻的冻果50g，装入250mL三角瓶中，加入培养基，灭菌，培养基的主要成分为蔗糖13％、磷酸二氢钾4％、硫酸镁0.03％、硝酸铵0.1％、山芋粉4％。然后在无菌操作台上按接种量2％将单一青霉菌接入瓶中，加入蒸馏水，使原料的含水量达到20％，pH值达到4.0，在智能培养箱中40℃条件下培养降解5小时；按料液比1:14(g/ML)加入蒸馏水，避光搅拌3次，每次2.5小时得到提取液；提取液中加入2.5％的ZTC1+1絮凝剂，在温度30℃的条件下搅拌30min,后静置2小时，然后通过过滤和离心除去提取液中的固型杂质；将上述离心液用前处理好D101型大孔树脂吸附，吸附饱和后，用3倍柱体积的纯水洗脱糖蛋白质等杂质，再分别用15％、80％乙醇溶液梯度洗脱，收集80％乙醇溶液的洗脱液，上样量15ml/min，洗脱流速3.5ml/min；收集的80％乙醇洗脱液减压浓缩，减压浓缩真空度为0.075-0.095Mpa,温度为50℃以下，浓缩至体积1/5-1/20，且无醇味；浓缩液灭菌后，进行喷雾干燥，得到目标成分精制越橘花青素，得到含花青素为25.2％的产物0.17g，产品总收率为68％。喷雾干燥的的进风温度120℃，出风温度50℃。