一种成熟体miRNA表达检测引物设计新方法及其应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体的说是涉及一种成熟体miRNA表达检测引物设计新方法及其应用。

背景技术：

microRNA(miRNA)是一类小分子非编码RNA，大小约为18－24个核苷酸(nts)。其可通过与靶基因的3’非翻译区(3’UTR)进行不完全互补配对结合，以转录后水平阻碍mRNA的蛋白翻译。为了揭示miRNA的生物学功能，关键的是准确检测miRNA在不同类型细胞或组织中的表达水平。目前已有30多种miRNA表达检测方法被公布，例如金标准Northern blot方法、大规模miRNA芯片检测方法、二代高通量测序法和荧光定量RT-PCR法等。在这些方法中，荧光定量RT-PCR的方法最为敏感，通常被用于验证miRNA芯片和二代高通量测序法。对于荧光定量RT-PCR方法，目前主要有两种，其一是poly(A)聚合酶加尾法，其次是茎环引物反转录法。为了提高其特异性和敏感性，基于这两种检测方法，又有数种新的定量RT-PCR方法被开发。例如，S-Poly(T)miRNA表达检测实验，该方法利用一条特异的oligo(dT)反转录引物替换原本通用型的反转录引物。

对于成熟体miRNA表达检测引物设计而言，由于miRNA与PCR引物长度相当，约为18-24个核苷酸，加之不同实验检测方法原理不同，目前尚没有一种通用的针对任意物种任意种类成熟体miRNA的引物设计方法，制约了对靶标miRNA分子标记物的表达水平进行精确检测。尽管国内外有公司提供miRNA定量检测试剂盒，但是不仅价格较高，均仅提供引物干粉，而且不对使用者公开引物序列，这会对实验过程产生不利影响。例如使用者在实验过程中，假如碰到实验结果不理想的情况，将无法追踪PCR引物序列或质量好坏，因此无法进行有效改进。目前针对miRNA引物设计方法已有相关的专利公布，说明对此问题的确是一个值得关注的问题，如“(1)一种检测miRNA的方法及引物及其应用(公开号:CN102154505A)；(2)一种miRNA及对其进行检测的特异性引物和方法(公开号:CN104630222A)；(3)一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法(CN103866009A)；(4)miRNA检测方法及试剂盒(CN1763223)”。但是，通过对这些专利内容进行分析后，发现它们或针对某一种特定的miRNA进行引物设计，或针对某一种特定的miRNA检测方法设计引物，而且对于miRNA引物设计的具体参数阐述不清楚。如何准确检测miRNA表达一直是本领域的亟待解决的问题，因此，在综合现有检测方法优缺点的基础上，我们开发了一种新的成熟体miRNA表达检测方法，该方法特异性和灵敏度较以往方法均有提升，可适用科研或临床上检测miRNA分子标记物的表达水平。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种成熟体miRNA表达检测引物设计新方法及其应用。

本发明的第一方面，提供了一种检测RNA表达的方法，所述方法包括步骤：

(1)样本处理；

使用poly(A)聚合酶处理RNA样本，向靶标RNA的3’末端添加poly(A)尾；

(2)反转录

向经过步骤(1)处理的样本中加入与靶标RNA特异结合的茎-环反转录引物，使用反转录酶进行反转录，

其中，所述茎-环反转录引物自3’端至5’端依次包括：特异性碱基序列或简并碱基序列、poly(T)片段、茎-环结构，其中，所述特异性碱基与所述靶标miRNA的3’末端特异性互补结合，所述poly(T)片段与所述poly(A)尾特异性互补结合；和

(3)对步骤(2)中的反转录产物进行扩增，并检测所述扩增产物。

在另一优选例中，所述步骤(1)中，poly(A)尾的长度为5－20nt；优选地为8－15nt；更优选地为10－15nt；最优选地为11nt。

在另一优选例中，所述茎-环反转录引物的长度为30－80nt；优选地为40－70nt；更优选地为45－65nt；最优选地为50-60nt。

在另一优选例中，所述茎-环反转录引物中的茎-环结构的核苷酸序列为：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-3’(SEQ ID NO.1)。

在另一优选例中，所述特异性碱基序列的长度为2-15nt；优选地为3－10nt；更优选地为5－8nt。

在另一优选例中，所述简并碱基序列长度为1-3nt；优选地为2nt。

在另一优选例中，所述反转录酶为M-MLV(RNase H^-)反转录酶。

在另一优选例中，步骤(3)中，所述扩增为PCR扩增，用于所述PCR扩增的PCR特异性扩增引物对的设计要求为：GC％含量为40-60％，Tm退火温度为60℃，正向引物与反向引物Tm值相差±2℃，PCR引物长度范围为18-25nt，PCR反向引物与反转录引物部分区域互补结合，且PCR前向引物的3’末端与反转录引物在miRNA上的结合位点至少相隔2个碱基；而PCR前向引物3’末端与RNA的5’末端约有13-16bp的区域相配，PCR前向引物5’末端设置6-8nt的随机碱基对加以填充。

在另一优选例中，所述PCR特异性扩增引物对中的反向引物的序列为：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGT-3’(SEQ ID NO.2)

在另一优选例中，所述简并碱基序列为NV，其中V为A、C或G；N为A、C、G或T。

在另一优选例中，所述方法为非诊断方法。

在另一优选例中，所述RNA为miRNA。

在另一优选例中，所述miRNA为成熟体miRNA。

在另一优选例中，所述靶标miRNA来源于动物、植物、微生物或病毒等。

在另一优选例中，所述动物包括人、非人哺乳动物(如家禽、家畜、宠物等)。

本发明的第二方面，提供了一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1是本发明实施例中5种miRNA定量表达检测实验原理示意图；

图2是本发明实施例中5种miRNA定量表达检测实验方法反转录引物设计原理图；

图3是本发明实施例中5种miRNA定量表达检测实验方法的PCR扩增前向引物设计原理图；

图4是本发明实施例中新方法A和B可行性验证定量PCR实验结果；

图5是本发明实施例中5种miRNA荧光定量RT-PCR方法检测灵敏度定量PCR实验结果；

图6是本发明实施例中不同退火温度条件下5种方法设计的引物的PCR扩增稳定性检测结果。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种新的miRNA荧光定量RT-PCR表达检测方法A或B，即通过poly(A)聚合酶对miRNA加尾，然后采用通用的或特异性的茎环反转录引物替代线性化的反转录引物，对靶标miRNA进行反转录，然后进行扩增。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供了一种成熟体miRNA表达检测方法，该方法可以采用方案(一)或方案(二)进行：

方案(一):茎环S-poly(A)-tail RT-PCR

该方法采用poly(A)聚合酶和M-MLV(RNase H^-)反转录酶处理RNA样本，可将miRNA的3’末端延长约11个碱基A，利用与靶标miRNA特异结合的茎-环反转录引物(茎环RT)进行反转录。设计的反转录引物通用序列为“5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTTTTTTTTTT-3’”(SEQ ID NO.3)，而其3’末端额外添加5-8个可与miRNA的尾部特异位点互补结合的碱基对。反转录引物的特定区段碱基序列自由能非常低，极易形成茎-环结构，主要目的除了延长成熟体miRNA外，反转录引物折叠后具有空间位阻，可区分成熟体和miRNA前体。利用此特异反转录引物，每次仅能将单个靶标miRNA反转录成cDNA。其次是设计PCR特异性扩增引物对，其次是设计PCR特异性扩增引物对，设计要求为：GC％含量为40－60％，推荐最佳Tm退火温度为60℃，正向引物与反向引物Tm值相差±2℃，PCR引物长度范围为18－25nt，PCR反向引物与反转录引物部分区域互补结合，其序列依据反转录引物而定，且PCR前向引物的3’末端与反转录引物在miRNA上的结合位点至少相隔2个碱基，目的是防止PCR反应时扩增反转录引物导致假阳性；而PCR前向引物3’末端与miRNA的5’末端约有13－16bp的区域相配，其5’末端将依据与反向引物Tm的差值选取最佳6－8nt的随机碱基对加以填充，再根据Gibbs自由能选取不易形成发夹(hairpin)和二聚体结构(Dimer)，且全基因范围评估特异性高的引物对。但最后利用一条特异的反转录引物和PCR扩增正反向引物对，结合SYBR Green染料法即可定量检测靶标miRNA的表达。最后利用一条特异的反转录引物和PCR扩增正反向引物对，结合SYBR Green染料法即可定量检测靶标miRNA的表达。

方案(二):茎环poly(A)-tail RT-PCR，该方法采用poly(A)聚合酶和M-MLV(RNase H^-)反转录酶处理RNA样本，可将miRNA的3’末端延长约11个碱基A，设计茎-环反转录引物(茎环RT)进行反转录，该反转录引物末端含有11个碱基T，3’端含有2个简并碱基VN，可与miRNA的poly(A)尾互补结合，其核苷酸序列为

“5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTTTTTTTTTTVN-3’”(SEQ ID NO.4)，其中V为A,C或G；N为A,C,G或T。反转录引物的特定区段碱基序列自由能非常低，极易形成茎-环结构，主要目的除了延长成熟体miRNA外，反转录引物折叠后具有空间位阻，可区分成熟体和miRNA前体。利用此通用反转录引物，理论上，可一次性将样品中所有miRNA全部反转录成cDNA。其次是设计PCR特异性扩增引物对，设计要求与方法A相同。最后利用一条通用的反转录引物和PCR扩增正反向引物对，结合SYBR Green染料法即可定量检测靶标miRNA的表达。

实验方法

本发明对成熟体miRNA定量表达检测方法的灵敏度进行了研究，开发出了具有较高检测灵敏度的实验方法。

本发明通过以下技术方案实现：一种成熟体miRNA表达检测方法及其应用，具体步骤如下：

(I)利用sRNAPrimer在线软件，设计用于成熟体miRNA定量表达检测方法的RT-PCR引物对；

(II)miRNA定量RT-PCR反应体系的配置；

(III)miRNA反转录和PCR反应条件的设定与运行；

(IV)miRNA的琼脂糖凝胶电泳和荧光定量检测。

步骤(I)中，使用的sRNAPrimer软件为免费公开的在线软件，登录网址为：http://123.57.239.141:8080/。成熟体miRNA定量RT-PCR检测方法以及特定引物设计规则如下：

方法A:茎环S-poly(A)-tail RT-PCR，即方案(一)的策略，该方法采用poly(A)聚合酶和M-MLV(RNase H^-)反转录酶处理RNA样本，可将miRNA的3’末端延长约11个碱基A，利用与靶标miRNA特异结合的茎-环反转录引物(茎环RT)进行反转录。设计的反转录引物通用序列为“5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTTTTTTTTTT-3’”(SEQ ID NO.3)，而其3’末端额外添加5-8个可与miRNA的尾部特异位点互补结合的碱基对。反转录引物的特定区段碱基序列自由能非常低，极易形成茎-环结构，主要目的除了延长成熟体miRNA外，反转录引物折叠后具有空间位阻，可区分成熟体和miRNA前体。利用此特异反转录引物，每次仅能将单个靶标miRNA反转录成cDNA。其次是设计PCR特异性扩增引物对，其次是设计PCR特异性扩增引物对，设计要求为：GC％含量为40－60％，推荐最佳Tm退火温度为60℃，正向引物与反向引物Tm值相差±2℃，PCR引物长度范围为18－25nt，PCR反向引物与反转录引物部分区域互补结合，其序列依据反转录引物而定，且PCR前向引物的3’末端与反转录引物在miRNA上的结合位点至少相隔2个碱基，目的是防止PCR反应时扩增反转录引物导致假阳性；而PCR前向引物3’末端与miRNA的5’末端约有13－16bp的区域相配，其5’末端将依据与反向引物Tm的差值选取最佳6－8nt的随机碱基对加以填充，再根据Gibbs自由能选取不易形成发夹(hairpin)和二聚体结构(Dimer)，且全基因范围评估特异性高的引物对。但最后利用一条特异的反转录引物和PCR扩增正反向引物对，结合SYBR Green染料法即可定量检测靶标miRNA的表达。最后利用一条特异的反转录引物和PCR扩增正反向引物对，结合SYBR Green染料法即可定量检测靶标miRNA的表达。

方法B:茎环poly(A)-tail RT-PCR，即方案(二)的策略，该方法采用poly(A)聚合酶和M-MLV(RNase H^-)反转录酶处理RNA样本，可将miRNA的3’末端延长约11个碱基A，设计茎-环反转录引物(茎环RT)进行反转录，该反转录引物末端含有11个碱基T，3’端含有2个简并碱基，可与miRNA的poly(A)尾互补结合，其核苷酸序列为“5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTTTTTTTTTTVN-3’”(SEQ ID NO.4)，V为A,C或G；N为A,C,G或T。反转录引物的特定区段碱基序列自由能非常低，极易形成茎-环结构，主要目的除了延长成熟体miRNA外，反转录引物折叠后具有空间位阻，可区分成熟体和miRNA前体。利用此通用反转录引物，理论上，可一次性将样品中所有miRNA全部反转录成cDNA。其次是设计PCR特异性扩增引物对，设计要求与方法A相同。最后利用一条通用的反转录引物和PCR扩增正反向引物对，结合SYBR Green染料法即可定量检测靶标miRNA的表达。

方法C:线性poly(A)-tailed RT-PCR，该方法采用poly(A)聚合酶和M-MLV(RNase H^-)反转录酶处理RNA样本，可将成熟体miRNA的3’末端延长约11个碱基A。设计线性化的反转录引物进行反转录，该反转录引物末端含有11个碱基T，3’端含有2个简并碱基，可与miRNA的poly(A)尾互补结合，其核苷酸序列为：

“5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTVN-3’”，(SEQ ID NO.5)

V为A,C或G；N为A,C,G或T。利用此通用反转录引物，理论上，可一次性将样品中所有miRNA全部反转录成cDNA。其次是设计PCR特异性扩增引物对，设计要求为：GC％含量为40-60％，推荐最佳Tm退火温度为60℃，正向引物与反向引物Tm值相差±2℃，PCR引物长度范围为18-25nt，PCR反向引物与反转录引物部分区域互补结合，其序列依据反转录引物而定；而PCR前向引物3’末端与靶标miRNA的5’末端约有13-16bp的区域相配，其5’末端将依据与反向引物Tm的差值选取最佳6-8nt随机碱基对加以填充。再根据Gibbs自由能选取不易形成发夹(hairpin)和二聚体结构(Dimer)，且全基因范围评估特异性高的引物对。最后利用一条通用的反转录引物和PCR扩增正反向引物对，结合SYBR Green染料法即可定量检测靶标miRNA的表达。

方法D:茎环RT-PCR，该方法采用M-MLV(RNase H^-)反转录酶处理RNA样品，利用与靶标miRNA特异结合的茎-环反转录引物(茎环RT)进行反转录。设计的反转录引物通用序列为“5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-3’”(SEQ ID NO.1)，而其3’末端额外添加5-8个可与miRNA的尾部特异位点互补结合的碱基对。反转录引物的特定区段碱基序列自由能非常低，极易形成茎-环结构，主要目的除了延长成熟体miRNA外，反转录引物折叠后具有空间位阻，可区分成熟体和miRNA前体。利用此特异反转录引物，每次仅能将单个靶标miRNA反转录成cDNA。其次是设计PCR特异性扩增引物对，其次是设计PCR特异性扩增引物对，设计要求为：GC％含量为40－60％，推荐最佳Tm退火温度为60℃，正向引物与反向引物Tm值相差±2℃，PCR引物长度范围为18－25nt，PCR反向引物与反转录引物部分区域互补结合，其序列依据反转录引物而定，且PCR前向引物的3’末端与反转录引物在miRNA上的结合位点至少相隔2个碱基，目的是防止PCR反应时扩增反转录引物导致假阳性；而PCR前向引物3’末端与miRNA的5’末端约有13－16bp的区域相配，其5’末端将依据与反向引物Tm的差值选取最佳6－8nt的随机碱基对加以填充，再根据Gibbs自由能选取不易形成发夹(hairpin)和二聚体结构(Dimer)，且全基因范围评估特异性高的引物对。但最后利用一条特异的反转录引物和PCR扩增正反向引物对，结合SYBR Green染料法即可定量检测靶标miRNA的表达。最后利用一条特异的反转录引物和PCR扩增正反向引物对，结合SYBR Green染料法即可定量检测靶标miRNA的表达。

方法E:茎环poly(U)-tail RT-PCR，该方法采用poly(U)聚合酶和M-MLV(RNase H^-)反转录酶处理RNA样本，可将miRNA的向3’末端延长约18个碱基U。设计茎-环反转录引物(茎环RT)进行反转录，该反转录引物末端含有18个碱基A，3’端含有2个简并碱基，可与miRNA的poly(U)尾互补结合，其核苷酸序列为“5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAAAAAAAAAAAAAAAAVN-3’”(SEQ ID NO.6)，V为A,C或G；N为A,C,G或T。反转录引物的特定区段碱基序列自由能非常低，极易形成茎-环结构，主要目的除了延长成熟体miRNA外，反转录引物折叠后具有空间位阻，可区分成熟体和miRNA前体。利用此通用反转录引物，理论上，可一次性将样品中所有miRNA全部反转录成cDNA。其次是设计PCR特异性扩增引物对，设计要求与方法A相同。最后利用一条通用的反转录引物和PCR扩增正反向引物对，结合SYBR Green染料法即可定量检测靶标miRNA的表达。

步骤(II)和(III)中，miRNA定量RT-PCR反应体系和反应条件，具体步骤如下：

1.方法A:茎环S-poly(A)-tail RT-PCR的反应体系和反应条件：

(1)10μl反转录体系为：总RNA为0.5μg，0.1μM特异性的茎-环反转录引物，补充无RNA酶的灭菌水至1.75μl，震荡混匀，离心1min。加入8.25μl RT反应混合液：2μl 5x RT Buffer，1μl 10x PAP Buffer，2μl dNTP(10mmol each)，0.4μl Rnase inhibitor(40U/μl)，0.6μl M-MLV(RNase H-)或RTase(200U/μl)反转录酶，2.5μl MgCl2(25mM)，0.25μl ATP(100mM)，0.5μl poly(A)聚合酶PAP(2U/μl)(购自Takara公司)。

(2)反转录在ABI7300PCR仪上进行，反应条件为：16℃,15min,37℃,20min,42℃,30min,85℃,5min,4℃保存。

(3)PCR反应前将cDNA产物稀释10倍，配置的20μl普通PCR反应体系为：2μl稀释的cDNA溶液，0.8μl前向引物(10μm)，0.8μl反向引物(10μm)，10μl 2x Taq PCR Master，含PCR聚合酶和buffer等(购自天根生化科技(北京)有限公司)，6.4μl灭菌双蒸水。

(4)PCR反应在ABI7300PCR仪上运行，反应条件为：94℃,5min,(94℃,10s,60℃,15s,72℃,20s),32cycle,72℃,10min,4℃保存。

(5)SYBR Green荧光定量PCR按照 Green Realtime PCR Master Mix(Toyobo)试剂盒操作说明进行，配置的20μl反应体系为：2μl稀释的cDNA溶液，0.8μl前向引物(10μm)，0.8μl反向引物(10μm)，10μl SYBR Green Realtime PCR Master Mix，6.4μl灭菌双蒸水。

(6)定量PCR反应在CFX96 Touch^TM荧光定量PCR仪(Bio-Rad)上进行，反应条件为：94℃,5min,(94℃,20s,68℃,20s),40个循环。

2.方法B:茎环poly(A)-tail RT-PCR的反应体系和反应条件：

(1)10μl反转录体系为：总RNA为0.5μg，0.1μM通用性的茎-环反转录引物，补充无RNA酶的灭菌水至1.75μl，震荡混匀，离心1min。加入8.25μl RT反应混合液：2μl 5x RT Buffer，1μl 10x PAP Buffer，2μl dNTP(10mmol each)，0.4μl Rnase inhibitor(40U/μl)，0.6μl M-MLV(RNase H-)或RTase(200U/μl)反转录酶，2.5μl MgCl2(25mM)，0.25μl ATP(100mM)，0.5μl poly(A)聚合酶PAP(2U/μl)(购自Takara公司)。

后续步骤同方法A的(2)，(3)，(4)，(5)，(6)。

3.方法C:线性poly(A)-tailed RT-PCR的反应体系和反应条件：

(1)10μl反转录体系为：总RNA为0.5μg，0.1μM通用型线性反转录引物，补充无RNA酶的灭菌水至1.75μl，震荡混匀，离心1min。加入8.25μl RT反应混合液：2μl 5x RT Buffer，1μl 10x PAP Buffer，2μl dNTP(10mmol each)，0.4μl Rnase inhibitor(40U/μl)，0.6μl M-MLV(RNase H-)或RTase(200U/μl)反转录酶(购自Promega公司)，2.5μl MgCl2(25mM)，0.25μl ATP(100mM)，0.5μl poly(A)聚合酶PAP(2U/μl)(购自Takara有限公司)。

(2)反转录在ABI7300PCR仪上进行，反应条件为：37℃,1h,85℃,5min,4℃保存。

后续步骤同方法A的(3)，(4)，(5)，(6)。

4.方法D:茎环RT-PCR的反应体系和反应条件：

(1)10μl反转录体系为：总RNA为0.5μg，0.1μM特异性的茎-环反转录引物，0.5μl随机引物，补充无RNA酶的灭菌水至2μl，震荡混匀，离心1min。加入8μl RT反应混合液：2μl 5x RT Buffer，2μl dNTP(10mmol each)，0.4μl Rnase inhibitor(40U/μl)，0.6μl M-MLV(RNase H-)或RTase(200U/μl)反转录酶，3μl无RNA酶的灭菌双蒸水。

后续步骤同方法A的(2)，(3)，(4)，(5)，(6)。

5.方法E:茎环poly(U)-tail RT-PCR的反应体系和反应条件：

(1)10μl反转录体系为：总RNA为0.5μg，0.1μM通用性的茎-环反转录引物，补充无RNA酶的灭菌水至1.75μl，震荡混匀，离心1min。加入8.25μl RT反应混合液：2μl 5x RT Buffer，1μl 10x PAP Buffer，2μl dNTP(10mmol each)，0.4μl Rnase inhibitor(40U/μl)，0.6μl M-MLV(RNase H-)或RTase(200U/μl)反转录酶，2.5μl MgCl2(25mM)，0.25μl ATP(100mM)，0.5μl poly(U)聚合酶(2U/μl)(购自NEB公司)。

后续步骤同方法A的(2)，(3)，(4)，(5)，(6)。

步骤IV中，miRNA的琼脂糖凝胶电泳和荧光定量检测，具体步骤如下：(1)普通琼脂糖凝胶法检测PCR产物，需配置2.5％的琼脂糖，加微量的EB染料或无毒的GelRed核酸染料(北京普利莱(APPLYGEN)基因技术有限公司)，电泳仪电压100V，电泳约20min，通过凝胶成像系统检测；(2)荧光定量PCR，通过SYBR Green染料法检测。

本发明对新方法A和B进行了可行性实验验证，包括如下步骤：

(1)登录miRBase数据库下载miRNA的成熟序列，利用sRNAPrimer软件分别设计方法A和B的反转录和PCR引物对，送公司合成；

(2)制备猪的不同组织RNA，等量混合后进行反转录和定量PCR扩增。

其次，本发明还对5种成熟体miRNA定量表达检测方法的灵敏度进行了比较研究，包括如下步骤：

(1)登录miRBase数据库下载miRNA的成熟序列，利用sRNAPrimer软件针对5种实验检测方法分别设计反转录和PCR引物对，送公司合成；

(2)制备猪的不同组织RNA，等量混合后进行反转录和定量PCR扩增猪的miRNA。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明公开了一种通用型成熟体miRNA表达检测引物设计新方法，并提供了适用于不同实验方法的反转录和PCR扩增反应液的配置方案及反应条件，由此可准确检测miRNA的表达水平。

(2)本发明的检测成熟体miRNA表达的方法，灵敏度高，特异性强，且稳定性好。

(3)本发明的方法中反转录引物的特定区段碱基序列能够形成茎-环结构，反转录引物折叠后具有空间位阻，可区分成熟体和miRNA前体。

(4)本发明提供的成熟体miRNA表达检测新方法，不仅可以检测miRNA，而且可用于检测其它种类小分子非编码RNA，如piwiRNA和siRNA等。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1

一种成熟体miRNA表达检测引物设计新方法及其应用，具体步骤如下：

(I)利用sRNAPrimer在线软件，按照特定规则设计用于成熟体miRNA定量表达检测方法的RT-PCR引物对；

(II)miRNA定量RT-PCR反应体系的配置；

(III)miRNA反转录和PCR反应条件的设定与运行；

(IV)miRNA的琼脂糖凝胶电泳和荧光定量检测。

步骤(I)中，miRNA荧光定量RT-PCR引物设计要点如下：

本发明的miRNA定量表达检测实验原理示意图见图1。依据不同的检测方法，反转录引物设计主要考虑以下几点因素(图2)：

1)反转录引物是否线性化或茎环结构；

2)是否与miRNA的3’端存在特定长度的碱基互补；

3)含多个碱基T还是A，而PCR反向引物的序列与反转录引物上的部分序列相同。

值得一提的是，在不同研究中miRNA检测所使用的反转录引物序列差异较大。本发明人收集了不同的反转录引物，最后针对每种miRNA检测方法，确定了各自的反转录引物，进而设计出通用型的PCR反向引物和特异的PCR前向引物。而对于设计PCR扩增的前向引物，如图3所示，其主要考虑的因素有：1)前向引物的3’端的13-16个碱基对与对应的miRNA的5’端结合；2)需要在前向引物的5’端增加5-8个碱基对，以提高引物的退火温度(Tm值)；3)鉴于miRNA较短，如果采用特异能与miRNA的3’端结合的反转录引物进行反转录，前向引物设计还需要考虑其3’端与miRNA结合的碱基不能与反转录引物末端有重叠，即考虑以miRNA全长为限，PCR扩增前向引物与反转录引物之间至少有2个碱基间隔，避免PCR反应对反转录引物进行非特异性扩增；4)前向与反向引物对之间的Tm值应尽可能接近，且GC含量范围为40％-60％；5)PCR前向引物的3′末端碱基最好为碱基G或C，以增加引物与目标miRNA结合的稳定性；6)分别计算引物的发夹结构(Hairpin structure),self-dimer,及上下游引物之间二聚体(cross-dimer)形成情况的热力学参数，每个miRNA设计5条候选的最佳PCR扩增前向引物。

步骤(I)中，使用的sRNAPrimer软件为免费公开的在线软件，登录网址为：http://123.57.239.141:8080/。依据各miRNA荧光定量RT-PCR实验原理和特定引物设计规则可设计引物。以猪miRNA为为例，其成熟序列来自miRBase数据库(http://mirbase.org/)，分别是：

>ssc-let-7a MIMAT0013865

UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU(SEQ ID NO.7)

>ssc-let-7g MIMAT0013867

UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU(SEQ ID NO.8)

步骤(II)和(III)中，5种miRNA定量RT-PCR反应体系的配置和反应条件；

方法A(方案一):茎环S-poly(A)-tail RT-PCR的反应体系和反应条件：

(1)10μl反转录体系为：总RNA为0.5μg，0.1μM特异性的茎-环反转录引物，补充无RNA酶的灭菌水至1.75μl，震荡混匀，离心1min。加入8.25μl RT反应混合液：2μl 5x RT Buffer，1μl 10x PAP Buffer，2μl dNTP(10mmol each)，0.4μl Rnase inhibitor(40U/μl)，0.6μl M-MLV(RNase H-)或RTase(200U/μl)反转录酶，2.5μl MgCl2(25mM)，0.25μl ATP(100mM)，0.5μl poly(A)聚合酶PAP(2U/μl)(购自Takara公司)。

(2)反转录在ABI7300PCR仪上进行，反应条件为：16℃,15min,37℃,20min,42℃,30min,85℃,5min,4℃保存。

(3)PCR反应前将cDNA产物稀释10倍，配置的20μl普通PCR反应体系为：2μl稀释的cDNA溶液，0.8μl前向引物(10μm)，0.8μl反向引物(10μm)，10μl 2x Taq PCR Master，含PCR聚合酶和buffer等(购自天根生化科技(北京)有限公司)，6.4μl灭菌双蒸水。

(4)PCR反应在ABI7300PCR仪上运行，反应条件为：94℃,5min,(94℃,10s,60℃,15s,72℃,20s),32cycle,72℃,10min,4℃保存。

(5)SYBR Green荧光定量PCR按照 Green Realtime PCR Master Mix(Toyobo)试剂盒操作说明进行，配置的20μl反应体系为：2μl稀释的cDNA溶液，0.8μl前向引物(10μm)，0.8μl反向引物(10μm)，10μl SYBR Green Realtime PCR Master Mix，6.4μl灭菌双蒸水。

(6)定量PCR反应在CFX96 Touch^TM荧光定量PCR仪(Bio-Rad)上进行，反应条件为：94℃,5min,(94℃,20s,68℃,20s),40个循环。

方法B(方案二):茎环poly(A)-tail RT-PCR的反应体系和反应条件：

(1)10μl反转录体系为：总RNA为0.5μg，0.1μM通用性的茎-环反转录引物，补充无RNA酶的灭菌水至1.75μl，震荡混匀，离心1min。加入8.25μl RT反应混合液：2μl 5x RT Buffer，1μl 10x PAP Buffer，2μl dNTP(10mmol each)，0.4μl Rnase inhibitor(40U/μl)，0.6μl M-MLV(RNase H-)或RTase(200U/μl)反转录酶，2.5μl MgCl2(25mM)，0.25μl ATP(100mM)，0.5μl poly(A)聚合酶PAP(2U/μl)(购自Takara公司)。

后续步骤同方法A的(2)，(3)，(4)，(5)，(6)。

方法C:线性poly(A)-tailed RT-PCR的反应体系和反应条件：

(1)10μl反转录体系为：总RNA为0.5μg，0.1μM通用型线性反转录引物，补充无RNA酶的灭菌水至1.75μl，震荡混匀，离心1min。加入8.25μl RT反应混合液：2μl 5x RT Buffer，1μl 10x PAP Buffer，2μl dNTP(10mmol each)，0.4μl Rnase inhibitor(40U/μl)，0.6μl M-MLV(RNase H-)或RTase(200U/μl)反转录酶(购自Promega公司)，2.5μl MgCl2(25mM)，0.25μl ATP(100mM)，0.5μl poly(A)聚合酶PAP(2U/μl)(购自Takara公司)。

(2)反转录在ABI7300PCR仪上进行，反应条件为：37℃,1h,85℃,5min,4℃保存。

后续步骤同方法A的(3)，(4)，(5)，(6)。

方法D:茎环RT-PCR的反应体系和反应条件：

(1)10μl反转录体系为：总RNA为0.5μg，0.1μM特异性的茎-环反转录引物，0.5μl随机引物，补充无RNA酶的灭菌水至2μl，震荡混匀，离心1min。加入8μl RT反应混合液：2μl 5x RT Buffer，2μl dNTP(10mmol each)，0.4μl Rnase inhibitor(40U/μl)，0.6μl M-MLV(RNase H-)或RTase(200U/μl)反转录酶，3μl无RNA酶的灭菌双蒸水。

后续步骤同方法A的(2)，(3)，(4)，(5)，(6)。

方法E:茎环poly(U)-tail RT-PCR的反应体系和反应条件：

(1)10μl反转录体系为：总RNA为0.5μg，0.1μM通用性的茎-环反转录引物，补充无RNA酶的灭菌水至1.75μl，震荡混匀，离心1min。加入8.25μl RT反应混合液：2μl 5x RT Buffer，1μl 10x PAP Buffer，2μl dNTP(10mmol each)，0.4μl Rnase inhibi tor(40U/μl)，0.6μl M-MLV(RNase H-)或RTase(200U/μl)反转录酶，2.5μl MgCl2(25mM)，0.25μl ATP(100mM)，0.5μl poly(U)聚合酶(2U/μl)(购自NEB公司)。

后续步骤同方法A的(2)，(3)，(4)，(5)，(6)。

步骤(IV)中，miRNA的琼脂糖凝胶电泳和荧光定量检测，具体步骤如下：(1)普通琼脂糖凝胶法检测PCR产物，需配置2.5％的琼脂糖，加微量的EB染料，电泳仪电压100V，电泳约20min，通过凝胶成像系统检测；(2)荧光定量PCR，通过SYBR Green染料法检测。

步骤(IV)中，miRNA普通琼脂糖凝胶和荧光定量检测。

(1)miRNA普通琼脂糖凝胶，制备2.5％的琼脂糖凝胶，添加EB染料染色，用凝胶成像系统检测PCR条带并拍照。

(2)荧光定量检测，定量PCR反应在CFX96 Touch^TM荧光定量PCR仪(Bio-Rad)上进行。

实施例2：新方法A和B可行性验证

方法A:茎环S-poly(A)-tail RT-PCR和方法B:poly(A)-tail RT-PCR:的验证实验流程如下：采集成年猪心、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和小肠等组织，利用TRIZOL试剂(Life Technologie)分别抽提不同组织总RNA并进行等量混合，再用反转录不同组织混合池的cDNA作为模板进行定量PCR扩增反应。其中反转录反应参考ReverTra(TOYOBO公司)试剂说明书进行,其中Oligo(dT)引物由特异或通用的miRNA的茎环反转录引物替换，poly(A)聚合酶(PAP)购自Takara公司。详细实验方法按照实施例1进行。依据本发明的引物设计规则，针对猪的ssc-let-7a(MIMAT0013865)设计的特异引物对如下:

>ssc-let-7a MIMAT0013865

UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU(SEQ ID NO.7)

方法A的反转录和PCR引物对如下：

反转录引物:

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTTTTTTTTTTAACTAT(SEQ ID NO.11，下划线为特异碱基对)

反向引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGT(SEQ ID NO.2),长度(bp):19bp,GC(％):57.89,Tm(℃):59.68

前向引物:AACACGCTGAGGTAGTAGGTT(SEQ ID NO.10),长度(bp):21bp,GC(％):47.62,Tm(℃):59.34

方法B的反转录和PCR引物对如下：

反转录引物:

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTTTTTTTTTTVN(SEQ ID NO.4，下划线为简并碱基对，VN＝V:A,C或G,N:A,C,G或T),

反向引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGT(SEQ ID NO.2),长度(bp):19bp,GC(％):57.89,Tm(℃):59.68

前向引物:AACACGCTGAGGTAGTAGGTTG(SEQ ID NO.9),长度(bp):22bp,GC(％):50.00,Tm(℃):60.61

以上引物送公司合成，公司返回的干粉。其中反转录引物用无RNA酶灭菌水溶解至终浓度1μm，PCR扩增引物对用TE溶液或灭菌双蒸水溶解至终浓度10μm备用。

定量PCR采用SYBR Green I染料(TOYOBO公司)，对实例6获得的cDNA混池模板进行倍比稀释，浓度梯度分别设置为1,10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，以灭菌水作为非模板对照。由图4可见，通过荧光定量PCR反应，两种新的检测方法均具有良好的扩增线性，能灵敏的检测猪的ssc-let-7a的浓度差异。相比而言，方法A:茎环S-poly(A)-tail RT-PCR在cDNA混池模板稀释为10^-5的条件下，扩增曲线依然非常好，而方法B:茎环poly(A)-tail RT-PCR在cDNA混池模板稀释为10^-5的条件下，扩增曲线紊乱。由此可见，方法A检测的灵敏度高于方法B。推测原因可能是，方法A采用的特异性的茎环反转录引物，在反转录时，仅特异针对目标miRNA反转录；而方法B采用的通用型的茎环反转录引物，在反转录时，能将组织中的所有表达的miRNA反转录，因此，在所有条件一致的前提条件下，方法A对目标miRNA的反转录效率将高于方法B。这就表现在，方法A对miRNA表达检测的灵敏度下限高于方法B。总之，方法A和B均可用于miRNA的表达检测。

实施例3：以猪的miRNA ssc-let-7a为例，比较各种miRNA荧光定量RT-PCR方法检测灵敏度，具体步骤如下：

挑选猪的miRNA ssc-let-7a，依据本发明引物设计规则针对不同的实验方法设计引物，序列如下：

>ssc-let-7a MIMAT0013865

UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU(SEQ ID NO.7)

方法A:茎环S-poly(A)-tail RT-PCR

反转录引物:

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTTTTTTTTTTAACTAT(SEQ ID NO.11)

反向引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGT(SEQ ID NO.2),长度(bp):19bp,GC(％):57.89,Tm(℃):59.68

前向引物:AACACGCTGAGGTAGTAGGTT(SEQ ID NO.10),长度(bp):21bp,GC(％):47.62,Tm(℃):59.34

方法B:茎环poly(A)-tail RT-PCR

反转录引物:

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTTTTTTTTTTVN,

VN＝V:A,C或G,N:A,C,G或T(SEQ ID NO.4)

反向引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGT(SEQ ID NO.2),长度(bp):19bp,GC(％):57.89,Tm(℃):59.68

前向引物:AACACGCTGAGGTAGTAGGTTG(SEQ ID NO.9),长度(bp):22bp,GC(％):50.00,Tm(℃):60.61

方法C:线性poly(A)-tailed RT-PCR

反转录引物:CAGTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTVN

VN＝V:A,C或G,N:A,C,G或T(SEQ ID NO.5)

反向引物:CAGTGCAGGGTCCGAGGTCA(SEQ ID NO.12),长度(bp):20bp,GC(％):65.00,Tm(℃):64.56

前向引物:ACGCCGTGAGGTAGTAGGTTGT(SEQ ID NO.13),长度(bp):22bp,GC(％):54.55,Tm(℃):63.95

方法D:茎环RT-PCR

反转录引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTAT(SEQ ID NO.14)

反向引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTC(SEQ ID NO.15),长度(bp):20bp,GC(％):65.00,Tm(℃):60.75

前向引物:AAGCGACCTGAGGTAGTAGGTT(SEQ ID NO.16),长度(bp):22bp,GC(％):50.00,Tm(℃):61.16

方法E:茎环poly(U)-tail RT-PCR

反转录引物:

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAAAAAAAAAAAAAAAAVN

VN＝V:A,C或G,N:A,C,G或T(SEQ ID NO.6)

反向引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTC(SEQ ID NO.15),长度(bp):20bp,GC(％):65.00,Tm(℃):60.75

前向引物:AACACGCTGAGGTAGTAGGTTG(SEQ ID NO.9),长度(bp):22bp,GC(％):50.00,Tm(℃):60.61

以上引物送公司合成，公司返回的干粉。其中反转录引物用无RNA酶灭菌水溶解至终浓度1μm，PCR扩增引物对用TE溶液或灭菌双蒸水溶解至终浓度10μm备用。

以实施例6获得的猪不同组织cDNA混池为模板，先通过半定量RT-PCR的方法评估引物对的特异性。实验操作按照实施例4进行。再利用荧光定量PCR方法比较不同方法检测的灵敏度。由图5可见，不同方法扩增曲线起峰时间不同，即PCR扩增的循环数不同，从而反映了不同检测方法灵敏度有差异，其灵敏度分别是：方法A>方法B>方法C>方法D>方法E。与其它方法相比本发明的方法A和方法B可大大提高miRNA的反转录效率，因此大幅度提高了其检测的灵敏度，而且，可靠性高。

实施例4：测试不同退火温度条件下，不同方法设计的引物的PCR扩增稳定性

测试不同退火温度条件(55-63℃)下，不同miRNA引物对的特异性和扩增效率。实验操作按照实施例4进行，其中不同方法选取相同猪的miRNA ssc-let-7g，依据本发明的引物设计规则设计的引物如下。

>ssc-let-7g MIMAT0013867

UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU(SEQ ID NO.8)

方法A:茎环S-poly(A)-tail RT-PCR

反转录引物:

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTTTTTTTTTTAACTGT(SEQ ID NO.21)

反向引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTC(SEQ ID NO.15),长度(bp):20bp,GC(％):60.00,Tm(℃):60.75

前向引物:AAGCGCCTTGAGGTAGTAGTTT(SEQ ID NO.17),长度(bp):22bp,GC(％):45.45,Tm(℃):60.29

方法B:茎环poly(A)-tail RT-PCR

反转录引物:

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTTTTTTTTTTVN

VN＝V:A,C或G,N:A,C,G或T(SEQ ID NO.4)

反向引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTC(SEQ ID NO.15),长度(bp):20bp,GC(％):60.00,Tm(℃):60.75

前向引物:AACGGCTGAGGTAGTAGTTTGT(SEQ ID NO.18),长度(bp):22bp,GC(％):45.45,Tm(℃):59.96

方法C:线性poly(A)-tailed RT-PCR

反转录引物:CAGTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTVN

VN＝V:A,C或G,N:A,C,G或T(SEQ ID NO.5)

反向引物:CAGTGCAGGGTCCGAGGTCA(SEQ ID NO.12),长度(bp):20bp,GC(％):65.00,Tm(℃):64.56

前向引物:CGCGGCCTGAGGTAGTAGTTTG(SEQ ID NO.19),长度(bp):22bp,GC(％):59.09,Tm(℃):63.79

方法D:茎环RT-PCR

反转录引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTGT(SEQ ID NO.20)

反向引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTC(SEQ ID NO.15),长度(bp):20bp,GC(％):60.00,Tm(℃):60.75

前向引物:AAGCGCCTTGAGGTAGTAGTTT(SEQ ID NO.17),长度(bp):22bp,GC(％):45.45,Tm(℃):60.29

方法E:茎环poly(U)-tail RT-PCR

反转录引物:

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAAAAAAAAAAAAAAAAVN，

其中VN＝V:A,C或G,N:A,C,G或T(SEQ ID NO.6)

反向引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTC(SEQ ID NO.15),长度(bp):20bp,GC(％):60.00,Tm(℃):60.75

前向引物:AACGGCTGAGGTAGTAGTTTGT(SEQ ID NO.18),长度(bp):22bp,GC(％):45.45,Tm(℃):59.96

以上引物送公司合成，公司返回的干粉。其中反转录引物用无RNA酶灭菌水溶解至终浓度1μm，PCR扩增引物对用TE溶液或灭菌双蒸水溶解至终浓度10μm备用。

由图6(方法A-方法E)可见，不同miRNA检测方法，在不同的退火温度条件下，均能特异性扩增出对应猪的miRNA ssc-let-7g，可见本发明miRNA引物设计方法可靠。

本发明实施例中的序列信息总结如下：

>ssc-let-7a MIMAT0013865

UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU(SEQ ID NO.7)

方法A:茎环S-poly(A)-tail RT-PCR

反转录引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTTTTTTTTTTAACTAT(SEQ ID NO.11)

反向引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGT(SEQ ID NO.2),长度(bp):19bp,GC(％):57.89,Tm(℃):59.68

前向引物:AACACGCTGAGGTAGTAGGTT(SEQ ID NO.10),长度(bp):21bp,GC(％):47.62,Tm(℃):59.34

方法B:茎环poly(A)-tail RT-PCR

反转录引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTTTTTTTTTTVN,(SEQ ID NO.4)

VN＝V:A,C或G,N:A,C,G或T

反向引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGT(SEQ ID NO.2),长度(bp):19bp,GC(％):57.89,Tm(℃):59.68

前向引物:AACACGCTGAGGTAGTAGGTTG(SEQ ID NO.9),长度(bp):22bp,GC(％):50.00,Tm(℃):60.61

方法C:线性poly(A)-tailed RT-PCR

反转录引物:CAGTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTVN

VN＝V:A,C或G,N:A,C,G或T(SEQ ID NO.5)

反向引物:CAGTGCAGGGTCCGAGGTCA(SEQ ID NO.12),长度(bp):20bp,GC(％):65.00,Tm(℃):64.56

前向引物:ACGCCGTGAGGTAGTAGGTTGT(SEQ ID NO.13),长度(bp):22bp,GC(％):54.55,Tm(℃):63.95

方法D:茎环RT-PCR

反转录引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTAT(SEQ ID NO.14)

反向引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTC(SEQ ID NO.15),长度(bp):20bp,GC(％):65.00,Tm(℃):60.75

前向引物:AAGCGACCTGAGGTAGTAGGTT(SEQ ID NO.16),长度(bp):22bp,GC(％):50.00,Tm(℃):61.16

方法E:茎环poly(U)-tail RT-PCR

反转录引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAAAAAAAAAAAAAAAAVN

VN＝V:A,C或G,N:A,C,G或T(SEQ ID NO.6)

反向引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTC(SEQ ID NO.15),长度(bp):20bp,GC(％):65.00,Tm(℃):60.75

前向引物:AACACGCTGAGGTAGTAGGTTG(SEQ ID NO.9),长度(bp):22bp,GC(％):50.00,Tm(℃):60.61

>ssc-let-7g MIMAT0013867

UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU(SEQ ID NO.8)

方法A:茎环S-poly(A)-tail RT-PCR

反转录引物:

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTTTTTTTTTTAACTGT(SEQ ID NO.21)

反向引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTC(SEQ ID NO.15),长度(bp):20bp,GC(％):60.00,Tm(℃):60.75

前向引物:AAGCGCCTTGAGGTAGTAGTTT(SEQ ID NO.17),长度(bp):22bp,GC(％):45.45,Tm(℃):60.29

方法B:茎环poly(A)-tail RT-PCR

反转录引物:

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTTTTTTTTTTVN(SEQ ID NO.4)

VN＝V:A,C或G,N:A,C,G或T

反向引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTC(SEQ ID NO.15),长度(bp):20bp,GC(％):60.00,Tm(℃):60.75

前向引物:AACGGCTGAGGTAGTAGTTTGT(SEQ ID NO.18),长度(bp):22bp,GC(％):45.45,Tm(℃):59.96

方法C:线性poly(A)-tailed RT-PCR

反转录引物:CAGTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTVN

VN＝V:A,C或G,N:A,C,G或T(SEQ ID NO.5)

反向引物:CAGTGCAGGGTCCGAGGTCA(SEQ ID NO.12),长度(bp):20bp,GC(％):65.00,Tm(℃):64.56

前向引物:CGCGGCCTGAGGTAGTAGTTTG(SEQ ID NO.19),长度(bp):22bp,GC(％):59.09,Tm(℃):63.79

方法D:茎环RT-PCR

反转录引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTGT(SEQ ID NO.20)

反向引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTC(SEQ ID NO.15),长度(bp):20bp,GC(％):60.00,Tm(℃):60.75

前向引物:AAGCGCCTTGAGGTAGTAGTTT(SEQ ID NO.17),长度(bp):22bp,GC(％):45.45,Tm(℃):60.29

方法E:茎环poly(U)-tail RT-PCR

反转录引物:

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAAAAAAAAAAAAAAAAVN，

其中VN＝V:A,C或G,N:A,C,G或T(SEQ ID NO.6)

反向引物:GTCGTATCCAGTGCAGGGTC(SEQ ID NO.15),长度(bp):20bp,GC(％):60.00,Tm(℃):60.75

前向引物:AACGGCTGAGGTAGTAGTTTGT(SEQ ID NO.18),长度(bp):22bp,GC(％):45.45,Tm(℃):59.96

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。