一种用于3D打印的生物墨水材料及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种生物墨水，尤其是涉及一种用于3D打印的生物墨水材料及其制备方法和应用。

背景技术：
3D打印技术用于临床医疗的案例已不再罕见，该技术与医疗的结合方式主要有以下几种：①术前诊断及手术预演模型；②植入物制备(骨骼、牙齿、软组织器官等)；③外用医疗耗材(颌面塑形支具等)。目前硬组织支架如骨、牙齿的打印技术目前已较为成熟，但软组织支架的打印仍有待进一步完善。现有可供软组织打印的生物墨水多为高分子水凝胶，包括人工合成高分子材料及胶原等天然水凝胶：(1)合成凝胶如聚富马酸二羟丙酯(PPF)、聚D，L-丙交酯(PDLLA)、聚ε-己内酯(PCL)、聚碳酸酯等作为打印墨水使用时成型速度快，但配制时需加入光敏树脂(主要由齐聚物、活性单体、光引发剂及其他助剂)，因此安全性尚需进一步谨慎评估；(2)天然水凝胶如明胶、明胶-壳聚糖、明胶-藻酸盐、藻酸盐等具有良好的生物相容性以及与人体软组织相似的生物力学性质。使用这些材料进行3D打印可获得大小在微米级别的彼此连通的孔隙结构。但围绕着这些材料开展的进一步研究结果显示：①打印支架对细胞的分化促进作用较弱；②接种于打印支架上的细胞在整个培养过程中都仅在原位生长，无法进一步与支架结合并降解支架。这些细胞与生物墨水、支架作用不良的问题，可能是由于3D打印精度仅在微米级别，无法重现ECM的纳米级结构所导致的(该结构对细胞的表型、功能具有至关重要的作用)。另外，猪、牛或羊的真皮结构与人相似，脱细胞处理后形成的真皮基质免疫原性低，可用于临床，但其内部纤维排列过于致密，材料营养渗透差，细胞化、血管化速度慢，移植成活率低，仅能作为创面临时覆盖物应用，无法作为软组织支架用于组织工程材料构建。综上所述，现有技术中的生物3D软组织打印技术尚不成熟，不能满足临床需要。

技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的之一旨在提供一种用于3D打印的生物墨水材料，该生物墨水材料在打印过程中容易挤出，不会堵塞打印针头，挤出后又容易定型；而且它在生物体内抗原性小，引起排斥反应小，具有生物降解性，对机体本身无毒害，安全性高。本发明的目的之二旨在提供一种用于3D打印的生物墨水材料的制备方法以及打印后的定型加固方法本发明的目的之三旨在提供一种用于3D打印的生物墨水材料的应用，用于制作3D打印软组织支架。为实现上述目的，本发明的第一个目的采用如下技术方案：一种用于3D打印的生物墨水材料，其特征在于，由按质量浓度百分比计的如下原料制备而成：生物大分子5％-18％水或者预交联剂76％-93.5％促凝剂1.5％-6％。上述原料的质量浓度百分比之和为100％。且上述生物墨水材料打印出来后将会进行水洗、交联以定型。作为优选，所述生物大分子为猪、牛或羊真皮源性细胞外基质(Extralcellularmatrix，ECM)纳米纤维微粉。猪、牛或羊脱细胞真皮基质纳米纤维微粉为猪、牛或羊真皮源性细胞外基质采用现有技术中的粉碎方法粉碎后制成的微粉，其主要成分为Ⅰ型及Ⅲ型胶原，该微粉D50为27.33±2.83μm。利用该微粉制备的生物墨水内保留真皮原有天然纳米结构，可进行快速打印成型，交联后成为设计结构的3D打印软组织支架。作为优选，所述水为蒸馏水或超纯水。作为优选，所述促凝剂为盐酸溶液，盐酸的摩尔浓度为0.5-6mol/L。作为优选，所述预交联剂为戊二醛溶液，戊二醛的质量浓度为0.01-0.2％。作为优选，所述生物墨水材料的终浓度为50-180mg/g本发明的第二个目的采用如下技术方案：一种用于3D打印的生物墨水材料的制备方法,其特征在于，按以下步骤进行：常温下，将配方量的猪、牛或羊真皮源性细胞外基质纳米纤维微粉、预交联剂或者超纯水，促凝剂混合，搅拌混合均匀，进行离心，得到凝胶，即生物墨水材料。作为优选，所述制备方法还包括以下步骤：3D生物打印：利用3D生物打印机将生物墨水材料按照建好的模型打印出来，打印后，冰冻1h-2h进行加固定型，得到定型的凝胶材料；交联：将定型的凝胶材料进行水洗，去除氢离子；然后加入交联剂，于4℃的条件下交联反应24h-48h；最后再进行水洗，洗去残余交联剂。作为优选，步骤1中，在磁力搅拌器中进行搅拌，搅拌速度为500-1500r/min，搅拌时间为30min；搅拌后置于离心管中，在离心机中进行离心，离心速度5000-10000r/min，离心时间5-15min；凝胶的pH值为1-5。作为优选，所述交联剂为戊二醛溶液，戊二醛的质量浓度为2％-10％。本发明的第三个目的采用如下技术方案：一种用于3D打印的生物墨水材料的应用，用于制作3D打印软组织支架。本发明的有益效果在于：1、本发明的凝胶在打印过程中容易喷出，不会堵塞打印针头，喷出后又容易定型，交联之后力学性质优良。2、本发明的生物墨水材料在人体内抗原性小，引起排斥反应小，生物可降解性高，对机体本身无毒害，安全性高。3、本发明中的凝胶材料有利于促进细胞的粘附生长，孔隙大小和孔隙率可以通过3D打印来进行调节，对材料血管化及整体性能提高有促进作用。4、本发明提供的软组织3D打印生物墨水材料，通过3D打印技术，可以实现个体针对性，为不同的病人可以有不同的设计，更加符合临床上的需要。5、本发明利用该微粉制备的生物墨水材料内保留真皮原有天然纳米结构，在特定温度下可进行快速打印成型，交联后成为设计结构的3D打印软组织支架。全过程需时短，步骤简单，全部掺入物均已有多年临床使用经验，安全性高。利用该生物墨水材料制备的3D打印软组织支架，具有纳米级天然纳米级孔隙及打印出的微米级别孔隙，其结构可依据不同应用目的进行优化调整，以该种支架为基础，加入细胞或其他成分后可实现组织工程材料/器官的个性化定制并用于医学用途上。附图说明图1a为微粉的照片，图1b、图1c为微粉在环境扫描电子显微镜的不同放大倍数下的拓扑结构图。图2a为生物墨水材料的粘滞度-温度变化曲线图，图2b为流动状态的凝胶的照片，图2c为定型的凝胶材料的照片。图3：利用该生物墨水材料制备的3D打印软组织支架，并进行移植复合植皮实验的过程图。具体实施方式本发明所采用原料均可由市场购得，本发明所采用3D生物打印机使用的德国GeSIMBioscaffolder3.13D生物打印机。本发明所述生物大分子为猪、牛或羊真皮源性细胞外基质(Extralcellularmatrix，ECM)纳米纤维微粉。猪、牛或羊脱细胞真皮基质纳米纤维微粉为猪、牛或羊真皮源性细胞外基质采用现有技术中的粉碎方法粉碎后制成的微粉，其主要成分为Ⅰ型及Ⅲ型胶原，该微粉D50为27.33±2.83μm。利用该微粉制备的生物墨水内保留真皮原有天然纳米结构，可进行快速打印成型，交联后成为设计结构的3D打印软组织支架。本发明所述水为超纯水。本发明所述促凝剂为盐酸溶液，盐酸的摩尔浓度为0.5-6mol/L。。本发明所述预交联剂为戊二醛溶液，戊二醛的质量浓度为0.01-0.2％。本发明所述交联剂为戊二醛溶液，戊二醛的质量浓度为2％-10％。下面通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是不局限于下述实施例。实施例1本实施例所述的用于3D打印的生物墨水材料，由按质量浓度百分比计的如下原料制备而成：生物大分子5％水93.5％促凝剂1.5％。且上述生物墨水材料打印出来后将会进行水洗、交联以定型。所述生物大分子为猪真皮源性细胞外基质纳米纤维微粉。所述水为超纯水。所述促凝剂为盐酸溶液，盐酸的摩尔浓度为3mol/L。一种用于3D打印的生物墨水材料的制备方法,按以下步骤进行：常温下，使用电子分析天平称取配方量的生物大分子(即猪真皮源性ECM纳米纤维微粉)置于烧杯中，加入配方量的超纯水，再加入一颗小磁珠，整个烧杯置于磁力搅拌器上，调整转速为800rpm，充分搅拌均匀，再用胶头滴管逐滴添加配方量的促凝剂(即盐酸溶液，盐酸的摩尔浓度为3mol/L)，以调节pH至，搅拌后置于离心管中，在离心机中进行离心，离心速度5000-10000r/min，离心时间5-15min；得到凝胶(即生物墨水材料)。该制备方法还包括如下步骤：3D生物打印：利用3D生物打印机将凝胶(即生物墨水材料)按照建好的模型打印出来，打印后，冰冻2h进行加固定型，得到定型的凝胶材料；交联：将定型的凝胶材料用第一部分水进行水洗，水洗的水洗次数为5-6次，去除氢离子，为交联提供条件；然后加入配方量的交联剂(即戊二醛溶液，戊二醛的质量浓度为10％)，于4℃的条件下交联反应48h；最后用第二部分水进行水洗，洗去残余交联剂。所述交联剂为戊二醛溶液，戊二醛的质量浓度为10％。参照图1a、图1b、图1c，猪真皮源性细胞外基质纳米纤维微粉经粒径分析检测D50为27.33±2.83μm，微粉内仍保留着原有的纳米级天然拓扑结构。参照图2a、图2b、图2c,该墨水随温度改变可由流动转为半流动状态并最终凝固，其状态变化速度依温度变化速度而定，可保证3D打印在简单的温度调控下进行，打印物无需添加光敏剂或其他化学物质即可成型。凝胶在打印过程中容易挤出，不会堵塞打印针头，挤出后又容易定型。可以看出，本实施例的凝胶在打印过程中容易挤出，不会堵塞打印针头，挤出后又容易定型，交联之后力学性质优良。参照图3，植皮处无明显排斥反应发生，切开植皮片周围皮肤观察，植皮片已血管化。可以看出，本实施例的生物墨水材料在人体内抗原性小，引起排斥反应小，生物可降解性高，对机体本身无毒害，安全性高。实施例2本实施例的特点是：本实施例所述的用于3D打印的生物墨水材料，由按质量浓度百分比计的如下原料制备而成：生物大分子18％水76％促凝剂6％。且上述生物墨水材料墨水打印出来后将会进行水洗、交联以定型。所述生物大分子为猪真皮源性细胞外基质纳米纤维微粉。所述水为超纯水。所述促凝剂为盐酸溶液，盐酸的摩尔浓度为3mol/L。所述交联剂为戊二醛溶液，戊二醛的质量浓度为10％。其制备方法的不同之处在于：凝胶时调节PH至1，其它具体操作步骤同实施例1。实施例3：本实施例的特点是：本实施例所述的用于3D打印的生物墨水材料，由按质量浓度百分比计的如下原料制备而成：生物大分子8.5％水90％促凝剂1.5％。且上述生物墨水材料墨水打印出来后将会进行水洗、交联以定型。所述生物大分子为猪真皮源性细胞外基质纳米纤维微粉。所述水为超纯水。所述促凝剂为盐酸溶液，盐酸的摩尔浓度为3mol/L。所述交联剂为戊二醛溶液，戊二醛的质量浓度为10％。其它具体操作步骤同实施例1。实施例4：本实施例的特点是：本实施例所述的用于3D打印的生物墨水材料，由按质量浓度百分比计的如下原料制备而成：生物大分子8.5％预交联剂90％促凝剂1.5％。且上述生物墨水材料墨水打印出来后将会进行水洗、交联以定型。所述生物大分子为猪真皮源性细胞外基质纳米纤维微粉。所述促凝剂为盐酸溶液，盐酸的摩尔浓度为3mol/L。所述预交联剂为戊二醛溶液，戊二醛的质量浓度为0.01％。所述交联剂为戊二醛溶液，戊二醛的质量浓度为10％。其它具体操作步骤同实施例1。实施例:5：本实施例的特点是：本实施例所述的用于3D打印的生物墨水材料，由按质量浓度百分比计的如下原料制备而成：生物大分子8.5％水90％促凝剂1.5％；且上述生物墨水材料墨水打印出来后将会进行水洗、交联以定型。所述生物大分子为牛真皮源性细胞外基质纳米纤维微粉。所述水为超纯水。所述促凝剂为盐酸溶液，盐酸的摩尔浓度为3mol/L。所述交联剂为戊二醛溶液，戊二醛的质量浓度为5％。其制备方法的不同之处在于：凝胶时调节PH至4，其它具体操作步骤同实施例1。实施例6：本实施例的特点是：本实施例所述的用于3D打印的生物墨水材料，由按质量浓度百分比计的如下原料制备而成：生物大分子8.5％水85.5％促凝剂6％。且上述生物墨水材料墨水打印出来后将会进行水洗、交联以定型。所述生物大分子为猪真皮源性细胞外基质纳米纤维微粉。所述水为超纯水。所述促凝剂为盐酸溶液，盐酸的摩尔浓度为3mol/L。所述交联剂为戊二醛溶液，戊二醛的质量浓度为10％。其制备方法的不同之处在于：凝胶时调节PH至1，其它具体操作步骤同实施例1。实施例7：本实施例的特点是：本实施例所述的用于3D打印的生物墨水材料，由按质量浓度百分比计的如下原料制备而成：生物大分子8.5％水90％促凝剂1.5％。且上述生物墨水材料墨水打印出来后将会进行水洗、交联以定型。所述生物大分子为猪真皮源性细胞外基质纳米纤维微粉。所述水为超纯水。所述促凝剂为盐酸溶液，盐酸的摩尔浓度为3mol/L。所述交联剂为戊二醛溶液，戊二醛的质量浓度为2％。其它具体操作步骤同实施例1。实施例8：本实施例的特点是：本实施例所述的用于3D打印的生物墨水材料，由按质量浓度百分比计的如下原料制备而成：生物大分子8.5％水90％促凝剂1.5％。且上述生物墨水材料墨水打印出来后将会进行水洗、交联以定型。所述生物大分子为羊真皮源性细胞外基质纳米纤维微粉。所述水为超纯水。所述促凝剂为盐酸溶液，盐酸的摩尔浓度为3mol/L。所述交联剂为戊二醛溶液，戊二醛的质量浓度为10％。其它具体操作步骤同实施例1。实施例9：本实施例的特点是：本实施例所述的用于3D打印的生物墨水材料，由按质量浓度百分比计的如下原料制备而成：生物大分子8.5％水90％促凝剂1.5％。且上述生物墨水材料墨水打印出来后将会进行水洗、交联以定型。所述生物大分子为羊真皮源性细胞外基质纳米纤维微粉。所述水为超纯水。所述促凝剂为盐酸溶液，盐酸的摩尔浓度为0.5mol/L。所述交联剂为戊二醛溶液，戊二醛的质量浓度为10％。其它具体操作步骤同实施例1。实施例10：本实施例的特点是：本实施例所述的用于3D打印的生物墨水材料，由按质量浓度百分比计的如下原料制备而成：生物大分子8.5％水90％促凝剂1.5％。且上述生物墨水材料墨水打印出来后将会进行水洗、交联以定型。所述生物大分子为羊真皮源性细胞外基质纳米纤维微粉。所述水为超纯水。所述促凝剂为盐酸溶液，盐酸的摩尔浓度为6mol/L。所述交联剂为戊二醛溶液，戊二醛的质量浓度为10％。其它具体操作步骤同实施例1。对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。