一株能使碳酸钙沉积的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌LZ1及其应用的利记博彩app

技术领域：

本发明属于微生物领域，具体涉及一株能使碳酸钙沉积的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)及其作为生物粘结剂在建筑物裂缝的修补、再生混凝土的胶结的应用。该菌已于2015年8月24日保藏于保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。地址：中国.北京.北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，电话：010-64807355，传真：010-64807288，e-mail：cgmcc@im.ac.cn，其保藏号为cgmccno.11271。

背景技术：
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传统岩土工程加固材料的高能耗，高污染问题成为了世界各国关注的焦点。研发能耗低、环境友好的岩土工程加固新技术，具有重要的现实意义。微生物和岩土工程交叉催生的微生物岩土工程学科，以其环境友好、能耗低的优点，目前已成为微生物岩土工程领域的研究热点，2006年被美国国家研究委员会确定为21世纪重要研究领域。岩土工程加固技术是世界各国研究的重点之一，也是岩土工程领域的重要课题之一。在节能环保的时代大背景下，水泥、水玻璃及其他有机材料作为传统的岩土工程加固材料所带来的高排放、高能耗、易造成污染等问题，越来越被人们所关注。微生物诱导碳酸钙沉积(micp)技术成为岩土工程加固领域的研究热点。

该技术的基于微生物诱导的钙沉积，利用产脲酶细菌代谢活动中产生大量的高活性脲酶，专性水解尿素产生co3^2-，并改变环境ph值，在外源ca²⁺引入下产生碳酸钙沉淀，起到胶结和封堵的作用。

本发明涉及一株具有高效产脲酶能力可诱导的钙沉积的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)，该菌株分离自果园土壤。现已于2015年8月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号是cgmccno.11271，名称为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillusfusiformis)。

本发明所述的lysinibacillusfusiformislz1的特征如下：

(1)形态特征：

该菌株为杆状，菌体大小约为1.0-2.0×0.4-1.0μm，革兰氏染色阴性菌。

(2)培养特征：

该菌株在nh4-ye平板培养基30℃培养2天后，出现乳白色圆形菌落，直径约1-2mm，菌落表面光滑湿润。

(3)菌株的生理生化特征：

氧化酶反应呈阳性，酯酶(c4)、类脂酯酶(c8)、a-糜蛋白酶、酸性磷酸酶、萘酚-as-bi-磷酸水解酶、β-半乳糖甙酶、a-葡萄糖苷酶呈阳性，水解明胶。

菌株可产生脲酶，分解尿素，形成co3^2-和nh4⁺。当溶液中含有一定浓度钙离子时，钙离子会被细胞吸附，从而以细胞为晶核，在细菌周围就会形成具有胶凝作用的碳酸钙结晶。

最适生长ph为6.0-9.5，最适生长温度为30-37℃。

(4)遗传学特征：

本发明公开的菌株的16srdna基因序列为：

tggcgcgcgctatacatgctagtcgagcgaacagagaaggagcttgctccttcgacgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctaccttatagtttgggataactccgggaaaccggggctaataccgaataatctgtttcacctcatggtgaaacactgaaagacggtttcggctgtcgctataggatgggcccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatgggcgaaagcctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggatttcggttcgtaaaactctgttgtaagggaagaacaagtacagtagtaactggctgtaccttgacggtaccttattagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggtggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactgggagacttgagtgcagaagaggatagtggaattccaagtgtagcggtgaaatgcgtagagatttggaggaacaccagtggcgaaggcgactatctggtctgtaactgacactgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcccgttgaccactgtagagatatggtttccccttcgggggcaacggtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccatcatttagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacgatacaaacggttgccaactcgcgagagggagctaatccgataaagtcgttctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagccggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttggagccagccgctcgaagtggatg

在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi上，用blast软件将纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)的16srdna基因序列与genbank的已知序列进行比较。结果表明纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)与赖氨酸芽孢杆菌属(lysinibacillussp.e416sribosomalrnagene,partialsequence)的序列同源性达到99％，证明所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)属于赖氨酸芽孢杆菌属。

本发明所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)可产生脲酶，分解尿素，形成co3^2-和nh⁴⁺。当溶液中含有一定浓度钙离子时，钙离子会被细胞吸附，从而以细胞为晶核，在细菌周围就会形成具有胶凝作用的碳酸钙结晶。该菌具有良好的碳酸钙沉积性能，与对照菌株巴氏芽孢杆菌(sporosarcinapasteurii，s.pasteuri，atcc11859)进行碳酸钙沉积量的比较，lz1为11.57g/l,s.pasteuri为10.55g/l.lz1比常用的碳酸盐矿化菌s.pasteurii高10﹪。可作为生物粘结剂，进行建筑物裂缝的修补、再生混凝土的胶结等。

附图说明

图1纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)革兰氏染色

图2纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)的透射电镜图(放大倍数:7000倍，标尺：200nm，电镜型号：feitecnaig2tf20)

图3纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)沉积碳酸钙晶体的x射线衍射图

图4纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)沉积碳酸钙晶体的扫描电镜图

图5纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)沉积晶体的edx图谱

图6纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)与对照菌株s.pasteurii的碳酸钙沉积量比较

具体实施方式：

实施例1从土壤中用稀释平板法分离纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)

(1)土壤样本的采集：土壤样本于2014年3月采集自山东省莱州市程郭镇的果园。

(2)样品稀释与培养：取土样10g，用无菌水稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6共6个浓度，取稀释液涂布于尿素平板(l^-1:5gnacl,2gkh2po4,1g葡萄糖,0.012g酚红,0.2g蛋白胨,20g尿素,15g琼脂,ph6.8)于30℃培养。

(3)菌株的分离、纯化：2-3天后，待平板长出菌落后，挑取颜色变红的单菌落于10ml尿素液体培养基中摇床上30℃恒温振荡培养。采用平板划线分离法纯化，将摇瓶培养物划线于尿素液体固体培养基上进行分离，固液交替培养2-3次，直至纯化得到单一的菌落，获得纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)。该菌培养物在nh4-ye固体培养上呈乳白色圆形菌落，直径约1-2mm，菌落表面光滑湿润。

(4)保藏方式：分离纯化的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)用20％甘油-80℃保藏。

该菌株已于2015年8月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号是cgmccno.11271，名称为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillusfusiformis)。

实施例2纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)的特征鉴定

菌体形态观察和染色反应：

将纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)接种于液体培养基30℃恒温培养适合时间后，染色镜检。

染色与镜检结果(图1)：纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)为杆状细菌，革兰氏染色结果显示为革兰氏阴性菌，菌体长度约为2.0-3.0×0.8-1.5μm(图2)。

(2)采用16srdna比对分析鉴定纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)：

扩增与测序引物：

正向引物：27f5’-agagtttgatcctggctcag-3’

反向引物：1492r5’-ggttaccttgttacgactt-3’

提取纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)菌株的总dna，用引物27f和1492r进行pcr扩增该菌株的16srdna基因，用引物27f和1492r进行测序，该菌株的16srdna基因序列为：

tggcgcgcgctatacatgctagtcgagcgaacagagaaggagcttgctccttcgacgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctaccttatagtttgggataactccgggaaaccggggctaataccgaataatctgtttcacctcatggtgaaacactgaaagacggtttcggctgtcgctataggatgggcccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatgggcgaaagcctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggatttcggttcgtaaaactctgttgtaagggaagaacaagtacagtagtaactggctgtaccttgacggtaccttattagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggtggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactgggagacttgagtgcagaagaggatagtggaattccaagtgtagcggtgaaatgcgtagagatttggaggaacaccagtggcgaaggcgactatctggtctgtaactgacactgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcccgttgaccactgtagagatatggtttccccttcgggggcaacggtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccatcatttagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacgatacaaacggttgccaactcgcgagagggagctaatccgataaagtcgttctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagccggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttggagccagccgctcgaagtggatg

在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi上，用blast软件将纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)的16srdna基因序列与genbank的已知序列进行比较。结果表明纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)与赖氨酸芽孢杆菌属16srdna基因(lysinibacillussp.e416sribosomalrnagene,partialsequence)的序列同源性达到99％，证明所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)属于赖氨酸芽孢杆菌属。

实施例3纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)的碳酸钙沉积性能

2％的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)菌液与对照菌株s.pasteurii，培养1天后，取菌液10ml，加入140mlurea-cacl2培养基(1l：3gnb；2.12gnahco3；20gnh4cl，余量为蒸馏水，调节ph至6.5，高压灭菌后，再加入过滤除菌的尿素和cacl2，终浓度均为1m)，于30-37℃摇床中150rpm培养7天，生成白色的沉淀。lz1产生的沉淀经干燥后进行xrd(图3)、sem(图4)和edx分析(图5)。结果表明该沉淀为碳酸钙，晶体类型为方解石。

进行lz1与s.pasteurii碳酸钙沉积量的比较(图6)，结果表明lz1为11.57g/l,s.pasteuri为10.55g/l.lz1比常用的碳酸盐矿化菌s.pasteurii高10﹪。钙沉积性能优于s.pasteurii.

综合上述实验结果可知，纺锤形赖氨酸芽孢杆菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)具有较强的碳酸钙沉积性能，在尿素和外源性ca²⁺存在下，可以生成碳酸钙，其晶体类型为最稳定的方解石，钙沉积性能高于对照菌株s.pasteurii，可作为生物粘结剂，进行建筑物裂缝的修补、再生混凝土的胶结等。

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