双特异性T细胞活化性抗原结合分子的利记博彩app

本发明一般涉及用于活化T细胞的双特异性抗原结合分子。另外，本发明涉及编码此类双特异性抗原结合分子的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明进一步涉及用于生成本发明的双特异性抗原结合分子的方法，以及在疾病的治疗中使用这些双特异性抗原结合分子的方法。发明背景在多种临床背景中常常期望选择性破坏个别细胞或特定细胞类型。例如，特异性破坏肿瘤细胞而使健康细胞和组织保持完整且不受损是癌症疗法的首要目的。实现这点的一种有吸引力的方式是通过诱导针对肿瘤的免疫应答，使得免疫效应细胞诸如天然杀伤(NK)细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)攻击并破坏肿瘤细胞。CTL构成免疫系统最有力的效应细胞，然而它们不能通过由常规治疗性抗体的Fc域介导的效应器机制来激活。在此点上，最近数年对双特异性抗体变得感兴趣，其设计为用一个“臂”结合靶细胞上的表面抗原，而用第二个“臂”结合T细胞受体(TCR)复合物的活化性的，不变的组分。此类抗体对其两种靶物的同时结合会迫使靶细胞和T细胞之间的暂时相互作用，引起任何细胞毒性T细胞活化和随后的靶细胞裂解。因此，免疫应答重定向于靶细胞，而且不依赖于靶细胞的肽抗原呈递或T细胞的特异性，其对于CTL的正常MHC限制性活化会是相关的。在此背景中，至关重要的是CTL仅在靶细胞向其呈递双特异性抗体时活化，即模拟免疫突触。特别期望的是不需要淋巴细胞预条件化或共刺激来引发靶细胞有效裂解的双特异性抗体。已开发出数种双特异性抗体型式并研究了它们对调查中的T细胞介导的免疫疗法的适宜性。其中，所谓的BiTE(双特异性T细胞衔接物(engager))分子已得到非常好的表征，而且在临床中已显示出一些前景(综述见Nagorsen和ExpCellRes317,1255-1260(2011))。BiTE是串联scFv分子，其中两个scFv分子通过柔性接头融合。针对T细胞衔接评估的其它双特异性型式包括双抗体(Holliger等,ProtEng9,299-305(1996))及其衍生物，诸如串联双抗体(Kipriyanov等,JMolBiol293,41-66(1999))。一项最近的进展是所谓的DART(双重亲和力重靶向)分子，它们基于双抗体型式但特征在于实现额外稳定化的C端二硫桥(Moore等,Blood117,4542-51(2011))。所谓的triomab(它们是完整杂合小鼠/大鼠IgG分子，而且目前亦在临床试验中进行评估)代表了尺寸更大的型式(综述见Seimetz等,CancerTreatRev36,458-467(2010))。正在开发的多种型式显示免疫疗法中归因于T细胞重定向和活化的极大潜力。然而，生成对此合适的双特异性抗体的任务绝不是微不足道的，而是牵涉到许多必须满足的与抗体功效，毒性，适用性和生产能力有关的挑战。小构建体诸如例如BiTE分子(尽管能够有效交联效应器和靶细胞)具有非常短的血清半衰期，从而需要通过连续输注对患者施用它们。另一方面，IgG样型式(尽管具有长半衰期的极大益处)受制于与IgG分子固有的天然效应器功能有关的毒性。它们的免疫原性潜力构成了成功治疗性开发的IgG样双特异性抗体(尤其是非人型式)的另一个不利特征。最后，双特异性抗体的一般开发中的一项主要挑战是以临床充足的数量和纯度生产双特异性抗体构建体，原因在于具有不同特异性的抗体重和轻链在共表达后的错配，这降低了正确装配的构建体的产量且导致许多无功能的副产物，而期望的双特异性抗体可能难以与之分开。已经采取了不同的办法来克服双特异性抗体中的链联合问题(参见例如Klein等,mAbs6,653-663(2012))。例如，‘节-入-穴’策略的目标在于通过在CH3域中引入突变以修饰接触界面来推动两条不同抗体重链的配对。在一条链上将大氨基酸用具有短侧链的氨基酸替换以创建‘穴’。相反，在另一个CH3域中引入具有大侧链的氨基酸以创建‘节’。通过共表达这两种重链(和两条相同轻链，它们必须是对于两种重链都是适宜的)，观察到异二聚体(‘节-穴’)对同二聚体(‘穴-穴’或‘节-节’)的高产量(Ridgway,J.B.等,ProteinEng.9(1996)617-621；及WO96/027011)。通过使用噬菌体展示办法重新塑造两个CH3域的相互作用表面及引入二硫桥以稳定化异二聚体能进一步提高异二聚体的百分比(Merchant,A.M.等,NatureBiotech.16(1998)677-681；Atwell,S.等,J.Mol.Biol.270(1997)26-35)。节-入-穴技术的新办法记载于例如EP1870459A1。然而，‘节-入-穴’策略没有解决包含不同轻链来结合不同靶抗原的双特异性抗体中发生的重链-轻链错配的问题。防止重链-轻链错配的一种策略是在双特异性抗体的结合臂之一的重和轻链之间交换域(参见WO2009/080251,WO2009/080252,WO2009/080253,WO2009/080254及Schaefer,W.等,PNAS,108(2011)11187-11191，其涉及具有域交换的双特异性IgG抗体)。交换双特异性抗体的结合臂之一中的重和轻链可变域VH和VL(WO2009/080252，还可参见Schaefer,W.等,PNAS,108(2011)11187-11191)明显减少由针对第一抗原的轻链与错误的针对第二抗原的重链的错配引起的副产物(与没有此类域交换的办法相比)。不过，这些抗体制备物并非完全不含副产物。主要的副产物基于BenceJones型相互作用(Schaefer,W.etal,PNAS,108(2011)11187-11191；附录中的图S1I)。因而想要进一步减少此类副产物以提高例如此类双特异性抗体的产量。鉴于与目前可获得用于T细胞介导的免疫疗法的双特异性抗体有关的难点和缺点，仍然存在对此类分子的新的改进型式的需要。本发明提供设计用于T细胞活化和重定向的双特异性抗原结合分子，其组合了优良的功效和生产能力与较低的毒性和有利的药动学特性。发明概述依照本发明，通过在CH1和CL域中的特定氨基酸位置处引入具有相反电荷的带电荷的氨基酸，能提高想要的双特异性抗体与不想要的副产物(特别是在它们的结合臂之一中具有VH/VL域交换的双特异性抗体中发生的BenceJones型副产物)相比的比率。如此，在第一个方面，本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含(a)特异性结合第一抗原的第一Fab分子；(b)特异性结合第二抗原的第二Fab分子，且其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的；其中所述第一抗原是活化性T细胞抗原且所述第二抗原是靶细胞抗原，或所述第一抗原是靶细胞抗原且所述第二抗原是活化性T细胞抗原；且其中i)在a)下的第一Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)，且其中在a)下的第一Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照KabatEU索引)；或ii)在b)下的第二Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)，且其中在b)下的第二Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照KabatEU索引)。依照本发明，所述第二Fab分子是交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区是交换的。在特定的实施方案中，所述第一Fab分子(和所述第三Fab分子，如果有的话)是常规Fab分子。在又一个特定的实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子中存在不超过一个能够特异性结合活化性T细胞抗原的Fab分子(即所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子提供对所述活化性T细胞抗原的单价结合)。在一个特定的实施方案中，所述第一抗原是靶细胞抗原且所述第二抗原是活化性T细胞抗原。在一个更加具体的实施方案中，所述活化性T细胞抗原是CD3，特别是CD3ε。在一个实施方案中，所述靶细胞抗原是CD20。在依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个实施方案中，在a)下的第一Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个优选的实施方案中用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代)，且在a)下的第一Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照KabatEU索引)。在又一个实施方案中，在a)下的第一Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)，且在a)下的第一Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照KabatEU索引)。在还有另一个实施方案中，在a)下的第一Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个优选的实施方案中，用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个优选的实施方案中，用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代)，且在a)下的第一Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照KabatEU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照KabatEU索引)。在一个特定的实施方案中，在a)下的第一Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)，且在a)下的第一Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)。在另一个特定的实施方案中，在a)下的第一Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)，且在a)下的第一Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)。在一个实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含(a)特异性结合第一抗原的第一Fab分子；(b)特异性结合第二抗原的第二Fab分子，且其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的；其中所述第一抗原是靶细胞抗原且所述第二抗原是活化性T细胞抗原；且其中在a)下的第一Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个优选的实施方案中，用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个优选的实施方案中，用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代)，且在a)下的第一Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照KabatEU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照KabatEU索引)。在依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个备选的实施方案中，在b)下的第二Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个优选的实施方案中，用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代)，且在b)下的第二Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照KabatEU索引)。在又一个实施方案中，在b)下的第二Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)，且在b)下的第二Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照KabatEU索引)。在仍有另一个实施方案中，在b)下的第二Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个优选的实施方案中，用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个优选的实施方案中，用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代)，且在b)下的第二Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照KabatEU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照KabatEU索引)。在一个实施方案中，在b)下的第二Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)，且在b)下的第二Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)。在另一个实施方案中，在b)下的第二Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)，且在b)下的第二Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)。在一些实施方案中，依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含特异性结合所述第一抗原的第三Fab分子。在特定的实施方案中，所述第三Fab分子与所述第一Fab分子相同。在这些实施方案中，所述第三Fab分子如此包含与所述第一Fab分子相同的氨基酸替代。像所述第一Fab分子一样，所述第三Fab分子特别是常规Fab分子。如果存在第三Fab分子的话，在一个特定的实施方案中，所述第一Fab分子和所述第三Fab分子特异性结合靶细胞抗原，且所述第二Fab分子特异性结合活化性T细胞抗原，特别是CD3，更加特别是CD3ε。在依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一些实施方案中，a)下的第一Fab分子和b)下的第二Fab分子彼此融合，任选经由肽接头。在一个具体的实施方案中，所述第二Fab分子在Fab重链的C端融合至所述第一Fab分子的Fab重链的N端。在一个备选的实施方案中，所述第一Fab分子在Fab重链的C端融合至所述第二Fab分子的Fab重链的N端。在其中(i)所述第二Fab分子在Fab重链的C端融合至所述第一Fab分子的Fab重链的N端或(ii)所述第一Fab分子在Fab重链的C端融合至所述第二Fab分子的Fab重链的N端任一的实施方案中，另外地所述第一Fab分子的Fab轻链和所述第二Fab分子的Fab轻链可以彼此融合，任选经由肽接头。在特定的实施方案中，依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子另外地包含由能够稳定联合的第一亚基和第二亚基构成的Fc域。依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以具有不同的构造，即所述第一Fab分子，所述第二Fab分子(和任选的所述第三Fab分子)可以以不同方式彼此融合及融合至所述Fc域。各构件可以直接地或优选经由一个或多个合适的肽接头彼此融合。在融合至所述Fc域的一个亚基的N端的情况中，融合典型地经由免疫球蛋白铰链区。在一个实施方案中，所述第二Fab分子在Fab重链的C端融合至所述Fc域的第一亚基或第二亚基的N端。在此类实施方案中，所述第一Fab分子可以在Fab重链的C端融合至所述第二Fab分子的Fab重链的N端或所述Fc域的亚基之另一的N端。在一个实施方案中，所述第一Fab分子和所述第二Fab分子各自在Fab重链的C端融合至所述Fc域的亚基之一的N端。在这个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本上构成免疫球蛋白分子，其中在Fab臂之一中重和轻链可变区VH和VL是彼此交换/替换的(见图1A，D)。在备选的实施方案中，所述第三Fab分子在Fab重链的C端融合至所述Fc域的第一亚基或第二亚基的N端。在一个特定的此类实施方案中，所述第二Fab分子和所述第三Fab分子各自在Fab重链的C端融合至所述Fc域的亚基之一的N端，且所述第一Fab分子在Fab重链的C端融合至所述第二Fab分子的Fab重链的N端。在这个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本上构成免疫球蛋白分子，其中在Fab臂之一中重和轻链可变区VH和VL是彼此交换/替换的，且其中一个另外的(常规)Fab分子在N端融合至所述Fab臂(见图1B，E)。在另一个此类实施方案中，所述第一Fab分子和所述第三Fab分子各自在Fab重链的C端融合至所述Fc域的亚基之一的N端，且所述第二Fab分子在Fab重链的C端融合至所述第一Fab分子的Fab重链的N端。在这个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本上构成免疫球蛋白分子，有一个另外的Fab分子在N端融合至免疫球蛋白Fab臂之一，其中在所述另外的Fab分子中重和轻链可变区VH和VL是彼此交换/替换的(见图1C，F)。在依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的所有不同构造中，本文所述氨基酸替代可以在所述第一Fab分子(和所述第三Fab分子，如果存在的话)的CH1和CL域中，或者在所述第二Fab分子的CH1和CL域中。优选地，它们在所述第一Fab分子(和所述第三Fab分子，如果存在的话)的CH1和CL域中。依照本发明的概念，如果在所述第一Fab分子(和所述第三Fab分子，如果存在的话)中进行本文所述氨基酸替代，那么在所述第二Fab分子中不进行此类氨基酸替代。反之，如果在所述第二Fab分子中进行本文所述氨基酸替代，那么在所述第一Fab分子(和所述第三Fab分子，如果存在的话)中不进行此类氨基酸替代。在依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的特定的实施方案中，特别是其中在所述第一Fab分子(和所述第三Fab分子，如果存在的话)中进行本文所述氨基酸替代的情况，所述第一Fab分子(和所述第三Fab分子，如果存在的话)的恒定域CL是卡帕同种型的。在依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的其它实施方案中，特别是其中在所述第二Fab分子中进行本文所述氨基酸替代的情况，所述第二Fab分子的恒定域CL是卡帕同种型的。在一些实施方案中，所述第一Fab分子(和所述第三Fab分子，如果存在的话)的恒定域CL和所述第二Fab分子的恒定域CL是卡帕同种型的。在一个特定的实施方案中，依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子中包含的免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更加特定的实施方案中，所述免疫球蛋白是IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施方案中，所述免疫球蛋白是IgG4亚类免疫球蛋白。在一个特定的实施方案中，本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含a)特异性结合第一抗原的第一Fab分子；b)特异性结合第二抗原的第二Fab分子，且其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的；c)特异性结合所述第一抗原的第三Fab分子；和d)由能够稳定联合的第一亚基和第二亚基构成的Fc域；其中所述第一抗原是靶细胞抗原且所述第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，更加特别是CD3ε；其中c)下的第三Fab分子与a)下的第一Fab分子相同；其中在a)下的第一Fab分子和c)下的第三Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)，且其中在a)下的第一Fab分子和c)下的第三Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)；且其中(i)a)下的第一Fab分子在Fab重链的C端融合至b)下的第二Fab分子的Fab重链的N端，且b)下的第二Fab分子和c)下的第三Fab分子各自在Fab重链的C端融合至d)下的Fc域的亚基之一的N端，或(ii)b)下的第二Fab分子在Fab重链的C端融合至a)下的第一Fab分子的Fab重链的N端，且a)下的第一Fab分子和c)下的第三Fab分子各自在Fab重链的C端融合至d)下的Fc域的亚基之一的N端。在一个甚至更加特定的实施方案中，本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含a)特异性结合第一抗原的第一Fab分子；b)特异性结合第二抗原的第二Fab分子，且其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的；c)特异性结合所述第一抗原的第三Fab分子；和d)由能够稳定联合的第一亚基和第二亚基构成的Fc域；其中所述第一抗原是靶细胞抗原且所述第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，更加特别是CD3ε；其中c)下的第三Fab分子与a)下的第一Fab分子相同；其中在a)下的第一Fab分子和c)下的第三Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)，且其中在a)下的第一Fab分子和c)下的第三Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)；且其中a)下的第一Fab分子在Fab重链的C端融合至b)下的第二Fab分子的Fab重链的N端，且b)下的第二Fab分子和c)下的第三Fab分子各自在Fab重链的C端融合至d)下的Fc域的亚基之一的N端。在又一个实施方案中，本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含a)特异性结合第一抗原的第一Fab分子；b)特异性结合第二抗原的第二Fab分子，且其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的；和c)由能够稳定联合的第一亚基和第二亚基构成的Fc域；其中(i)所述第一抗原是靶细胞抗原且所述第二抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，更加特别是CD3ε；或(ii)所述第二抗原是靶细胞抗原且所述第一抗原是活化性T细胞抗原，特别是CD3，更加特别是CD3ε；其中在a)下的第一Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)，且其中在a)下的第一Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)；且其中a)下的第一Fab分子和b)下的第二Fab分子各自在Fab重链的C端融合至c)下的Fc域的亚基之一的N端。在T细胞活化性双特异性抗原结合分子的特定的实施方案中，所述Fc域是IgGFc域。在一个具体的实施方案中，所述Fc域是IgG1Fc域。在另一个具体的实施方案中，所述Fc域是IgG4Fc域。在一个甚至更加具体的实施方案中，所述Fc域是包含氨基酸替代S228P的IgG4Fc域(Kabat编号方式)。在特定的实施方案中，所述Fc域是人Fc域。在特定的实施方案中，所述Fc域包含促进所述第一Fc域亚基和所述第二Fc域亚基联合的修饰。在一个具体的此类实施方案中，所述Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第一亚基的CH3域内生成隆起，所述隆起可安置于第二亚基的CH3域内的空腔中，且所述Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二亚基的CH3域内生成空腔，所述空腔内可安置第一亚基的CH3域内的隆起。在一个特定的实施方案中，所述Fc域展现与天然IgG1Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在某些实施方案中，所述Fc域工程化改造成具有与非工程化改造的Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个实施方案中，所述Fc域包含一处或多处降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代。在一个实施方案中，所述Fc域中一处或多处降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代处于一个或多个选自下组的位置：L234，L235和P329(KabatEU索引编号方式)。在特定的实施方案中，所述Fc域的每个亚基包含三处降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代为L234A，L235A和P329G(KabatEU索引编号方式)。在一个此类实施方案中，所述Fc域是IgG1Fc域，特别是人IgG1Fc域。在其它实施方案中，所述Fc域的每个亚基包含两处降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代为L235E和P329G(KabatEU索引编号方式)。在一个此类实施方案中，所述Fc域是IgG4Fc域，特别是人IgG4Fc域。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc域是IgG4Fc域且包含氨基酸替代L235E和S228P(SPLE)(KabatEU索引编号方式)。在一个实施方案中，所述Fc受体是Fcγ受体。在一个实施方案中，所述Fc受体是人Fc受体。在一个实施方案中，所述Fc受体是活化性Fc受体。在一个具体的实施方案中，所述Fc受体是人FcγRIIa，FcγRI，和/或FcγRIIIa。在一个实施方案中，所述效应器功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个具体的实施方案中，所述特异性结合活化性T细胞抗原，特别是CD3，更加特别是CD3ε的Fab分子包含SEQIDNO：4的重链互补决定区(CDR)1，SEQIDNO：5的重链CDR2，SEQIDNO：6的重链CDR3，SEQIDNO：8的轻链CDR1，SEQIDNO：9的轻链CDR2和SEQIDNO：10的轻链CDR3。在一个甚至更加具体的实施方案中，所述特异性结合活化性T细胞抗原，特别是CD3，更加特别是CD3ε的Fab分子包含包含与SEQIDNO：3的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQIDNO：7的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。在一个具体的实施方案中，依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子中包含的第二Fab分子特异性结合CD3，更加特别是CD3ε，且包含SEQIDNO：4的重链互补决定区(CDR)1，SEQIDNO：5的重链CDR2，SEQIDNO：6的重链CDR3，SEQIDNO：8的轻链CDR1，SEQIDNO：9的轻链CDR2和SEQIDNO：10的轻链CDR3。在一个甚至更加具体的实施方案中，所述第二Fab分子包含包含SEQIDNO：3的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO：7的氨基酸序列的轻链可变区。在依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的又一个具体的实施方案中，所述特异性结合靶细胞抗原，特别是CD20的Fab分子包含SEQIDNO：46的重链互补决定区(CDR)1，SEQIDNO：47的重链CDR2，SEQIDNO：48的重链CDR3，SEQIDNO：49的轻链CDR1，SEQIDNO：50的轻链CDR2和SEQIDNO：51的轻链CDR3。在一个甚至更加具体的实施方案中，所述特异性结合靶细胞抗原，特别是CD20的Fab分子包含包含与SEQIDNO：30的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQIDNO：31的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。在一个具体的实施方案中，依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子中包含的第一Fab分子(和第三Fab分子，如果存在的话)特异性结合CD20，且包含SEQIDNO：46的重链互补决定区(CDR)1，SEQIDNO：47的重链CDR2，SEQIDNO：48的重链CDR3，SEQIDNO：49的轻链CDR1，SEQIDNO：50的轻链CDR2和SEQIDNO：51的轻链CDR3。在一个甚至更加具体的实施方案中，所述第一Fab分子(和所述第三Fab分子，如果存在的话)包含包含SEQIDNO：30的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO：31的氨基酸序列的轻链可变区。在一个特定的方面，本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含a)特异性结合第一抗原的第一Fab分子；b)特异性结合第二抗原的第二Fab分子，且其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的；c)特异性结合所述第一抗原的第三Fab分子；和d)由能够稳定联合的第一亚基和第二亚基构成的Fc域；其中(i)所述第一抗原是CD20且所述第二抗原是CD3，特别是CD3ε；(ii)a)下的第一Fab分子和c)下的第三Fab分子各自包含SEQIDNO：46的重链互补决定区(CDR)1，SEQIDNO：47的重链CDR2，SEQIDNO：48的重链CDR3，SEQIDNO：49的轻链CDR1，SEQIDNO：50的轻链CDR2和SEQIDNO：51的轻链CDR3，且b)下的第二Fab分子包含SEQIDNO：4的重链CDR1，SEQIDNO：5的重链CDR2，SEQIDNO：6的重链CDR3，SEQIDNO：8的轻链CDR1，SEQIDNO：9的轻链CDR2和SEQIDNO：10的轻链CDR3；(iii)在a)下的第一Fab分子和c)下的第三Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代，特别是用精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)，且其中在a)下的第一Fab分子和c)下的第三Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)；且(iv)a)下的第一Fab分子在Fab重链的C端融合至b)下的第二Fab分子的Fab重链的N端，且b)下的第二Fab分子和c)下的第三Fab分子各自在Fab重链的C端融合至d)下的Fc域的亚基之一的N端。在又一个方面，本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含a)特异性结合第一抗原的第一Fab分子；b)特异性结合第二抗原的第二Fab分子，且其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的；c)特异性结合所述第一抗原的第三Fab分子；和d)由能够稳定联合的第一亚基和第二亚基构成的Fc域；其中(i)所述第一抗原是CD20且所述第二抗原是CD3，特别是CD3ε；(ii)a)下的第一Fab分子和c)下的第三Fab分子各自包含SEQIDNO：46的重链互补决定区(CDR)1，SEQIDNO：47的重链CDR2，SEQIDNO：48的重链CDR3，SEQIDNO：49的轻链CDR1，SEQIDNO：50的轻链CDR2和SEQIDNO：51的轻链CDR3，且b)下的第二Fab分子包含SEQIDNO：4的重链CDR1，SEQIDNO：67的重链CDR2，SEQIDNO：6的重链CDR3，SEQIDNO：68的轻链CDR1，SEQIDNO：9的轻链CDR2和SEQIDNO：10的轻链CDR3；(iii)在a)下的第一Fab分子和c)下的第三Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代，特别是用精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)，且其中在a)下的第一Fab分子和c)下的第三Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)；且(iv)a)下的第一Fab分子在Fab重链的C端融合至b)下的第二Fab分子的Fab重链的N端，且b)下的第二Fab分子和c)下的第三Fab分子各自在Fab重链的C端融合至d)下的Fc域的亚基之一的N端。依照本发明的另一个方面，提供一种或多种分离的多核苷酸，其编码本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。本发明进一步提供一种或多种包含本发明的分离的多核苷酸的表达载体，以及包含本发明的分离的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞，特别是哺乳动物细胞。在另一个方面，提供一种生成本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的方法，其包括下述步骤：a)在适合于表达所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子的条件下培养本发明的宿主细胞，并b)回收所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子。本发明还涵盖通过本发明的方法生成的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。本发明进一步提供一种药物组合物，其包含本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子和药学可接受载剂。本发明还涵盖使用本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子和药物组合物的方法。在一个方面，本发明提供本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或药物组合物，其用作药物。在一个方面，提供依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或药物组合物，其用于治疗有所需要的个体中的疾病。在一个具体的实施方案中，所述疾病是癌症。还提供本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子制造用于治疗有所需要的个体中的疾病的药物的用途；以及一种治疗个体中的疾病的方法，其包括对所述个体施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含药学可接受形式的依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在一个具体的实施方案中，所述疾病是癌症。在任何上述实施方案中，所述个体优选是哺乳动物，特别是人。本发明还提供一种用于诱导靶细胞(特别是肿瘤细胞)裂解的方法，其包括在T细胞(特别是细胞毒性T细胞)存在下使靶细胞与本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子接触。附图简述图1。本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子(TCB)的例示性构造。(A，D)“1+1CrossMab”分子的示图。(B，E)“2+1IgGCrossfab”分子的示图，其具有Crossfab和Fab构件(“倒转的”)的交替(alternative)次序。(C，F)“2+1IgGCrossfab”分子的示图。(G，K)“1+1IgGCrossfab”分子的示图，其具有Crossfab和Fab构件(“倒转的”)的交替(alternative)次序。(H，L)“1+1IgGCrossfab”分子的示图。(I，M)“2+1IgGCrossfab”分子的示图，其具有两个CrossFabs。(J，N)“2+1IgGCrossfab”分子的示图，其具有两个CrossFabs和Crossfab和Fab构件(“倒转的”)的交替(alternative)次序。(O，S)“Fab-Crossfab”分子的示图。(P，T)“Crossfab-Fab”分子的示图。(Q，U)“(Fab)2-Crossfab”分子的示图。(R，V)“Crossfab-(Fab)2”分子的示图。(W，Y)“Fab-(Crossfab)2”分子的示图。(X，Z)“(Crossfab)2-Fab”分子的示图。黑点：任选的Fc域中促进异二聚化的修饰。++，--：CH和CL域中引入的相反电荷的氨基酸。图2。实施例1中制备的TCB的示图。(A)无电荷修饰的“2+1IgGCrossFab，倒转的”(CD3结合物中的CH1/CL交换)，(B)有电荷修饰的“2+1IgGCrossFab，倒转的”(CD3结合物中的VH/VL交换，CD20结合物中的电荷修饰，EE＝147E，213E；RK＝123R，124K)，(C)有电荷修饰的“2+1IgGCrossFab”(CD3结合物中的VH/VL交换，CD20结合物中的电荷修饰，EE＝147E，213E；RK＝123R，124K)，(D)无电荷修饰的“2+1IgGCrossFab，倒转的”(CD3结合物中的VH/VL交换)，(E)无电荷修饰的“2+1IgGCrossFab，倒转的”(CD3结合物中的VH-CH1/VL-CL交换)，(F)有电荷修饰的“2+1IgGCrossFab，倒转的”(CD20结合物中的VH/VL交换，CD3结合物中的电荷修饰，EE＝147E，213E；KK＝123K，124K)，(G)有电荷修饰和Fc区中的DDKK突变的“2+1IgGCrossFab，倒转的”(CD3结合物中的VH/VL交换，CD20结合物中的电荷修饰，EE＝147E，213E；RK＝123R，124K)，(H)有电荷修饰的“1+1CrossMab”(CD3结合物中的VH/VL交换，CD20结合物中的电荷修饰，EE＝147E，213E；RK＝123R，124K)，(I)有电荷修饰的“1+1CrossMab”(CD3结合物中的VH/VL交换，CD20结合物中的电荷修饰，EE＝147E，213E；RK＝123R，124K，不同的CD20结合物)，(J)有电荷修饰213E，123R的“2+1IgGCrossFab，倒转的”(CD3结合物中的VH/VL交换，CD20结合物中的电荷修饰，E＝213E；R＝123R)，(K)有电荷修饰的“2+1IgGCrossFab，倒转的”(CD3结合物中的VH/VL交换和电荷修饰)。图3。(A-I，N，O)实施例1中制备的TCB的CE-SDS分析(最终的经过纯化的制备物)。(A)图2A中所示分子“A”的电泳图，(B)图2B中所示分子“B”的电泳图，(C)图2C中所示分子“C”的电泳图，(D)图2D中所示分子“D”的电泳图，(E)图2E中所示分子“E”的电泳图，(F)图2F中所示分子“F”的电泳图，(G)图2G中所示分子“G”的电泳图电泳图，(H)图2H中所示分子“H”的电泳图，(I)图2I中所示分子“I”的电泳图，(N)图2J中所示分子“J”的电泳图，(O)图2K中所示分子“K”的电泳图。道A＝非还原的，道B＝还原的。(J-L，P，Q)实施例1中制备的TCB在第一个纯化步骤(蛋白A亲和层析)后的SDS-PAGE分析。(J)4-12％Bis-TrisSDS-PAGE，非还原的；道1＝标志物(Mark12，未染色的标准品，Invitrogen)；道2-11＝来自分子B的蛋白A亲和层析的级分，(K)3-8％Tris-乙酸盐SDS-PAGE，非还原的；道1＝标志物(HiMark，Invitrogen)；道2-12＝来自分子C的蛋白A亲和层析的级分，(L)4-12％Bis-TrisSDS-PAGE，非还原的；道1＝标志物(Mark12，未染色的标准品，Invitrogen)；道2-14＝来自分子D的蛋白A亲和层析的级分，(P)4-12％Bis/TrisSDSPAGE，非还原的；道1＝标志物(Mark12，Invitrogen)；道2-10＝来自分子J的蛋白A亲和层析的级分，(Q)4-12％Bis/TrisSDSPAGE，非还原的；道1＝标志物(Mark12，Invitrogen)；道2-12＝来自分子K的蛋白A亲和层析的级分。(M)实施例1中制备的TCB(分子A(第一个SEC步骤)，B和D，如标注的)的制备性大小排阻层析(SEC；第一个纯化步骤)。图4。有或无电荷修饰(“电荷残基”)的抗CD3/抗CD20T细胞双特异性(TCB)抗体(“CD20TCB”)的CD3和CD20结合(参见实施例1)。图5。与人PBMC一起温育22小时后由有或无电荷修饰(“电荷残基”)的抗CD3/抗CD20T细胞双特异性(TCB)抗体(“CD20TCB”)诱导的肿瘤细胞裂解(参见实施例1)。图6。由有或无电荷修饰(“电荷残基”)的抗CD3/抗CD20T细胞双特异性(TCB)抗体(“CD20TCB”)诱导的T细胞介导的对表达CD20的肿瘤靶细胞(Nalm-6)的杀伤后CD8+T细胞(A)或CD4+T细胞(B)的活化(参见实施例1)。图7。由有或无电荷修饰(“电荷残基”)的抗CD3/抗CD20T细胞双特异性(TCB)抗体(“CD20TCB”)诱导的T细胞介导的对表达CD20的肿瘤靶细胞(Z-138)的杀伤后CD8+T细胞(A)或CD4+T细胞(B)的活化(参见实施例1)。图8。与有或无电荷修饰(“电荷残基”)的抗CD3/抗CD20T细胞双特异性(TCB)抗体(“CD20TCB”)一起温育后健康人全血中的B细胞消减；22小时测定法(参见实施例1)。图9。由有或无电荷修饰(“电荷残基”)的抗CD3/抗CD20T细胞双特异性(TCB)抗体(“CD20TCB”)诱导的T细胞介导的对人健康全血中表达CD20的B细胞的杀伤后CD8+T细胞(A)或CD4+T细胞(B)的活化(参见实施例1)。图10。抗CD20/抗CD3TCB(图2B中所示分子“B”)对表达人CD20(A)和CD3(B)的靶细胞的结合。图11。抗CD20/抗CD3TCB(图2B中所示分子“B”)对表达人和食蟹猴CD20和CD3的靶细胞的结合。(A)B细胞，(B)CD4T细胞，(C)CD8T细胞。图12。由不同抗CD20/抗CD3TCB抗体型式介导的肿瘤细胞裂解。图13。由不同抗CD20/抗CD3TCB抗体型式介导的肿瘤细胞裂解和后续T细胞活化。(A-C)来自三名不同人供体的PBMC效应细胞对Z138肿瘤靶细胞的裂解。(D)所标注的一组DLBCL肿瘤细胞系的裂解。图14。由不同抗CD20/抗CD3TCB抗体型式介导的人全血中的B细胞消减。图15。不同抗CD20/抗CD3TCB抗体型式对T细胞的活化，是通过使用Jurkat-NFAT报告物测定法量化CD3下游信号传导强度来评估的。图16。0.5mg/kgi.v.推注施用抗CD20/抗CD3TCB抗体(图2B中所示分子“B”)的药动学参数，来自NOG小鼠中的稀疏采样数据。图17。评估抗CD20/抗CD3TCB抗体(图2B中所示分子“B”)在完全人源化NOG小鼠中的B细胞消减活性的研究设计的示意图。图18。用(B)抗CD20/抗CD3TCB抗体(图2B中所示分子“B”)或(A)媒介对照处理的完全人源化NOG小鼠的血液中B细胞和T细胞频率的动力学。D0，D7：疗法注射的日子。图19。完全人源化小鼠中媒介(黑色柱)或抗CD20/抗CD3TCB抗体(图2B中所示分子“B”)(白色柱)注射后3天(D3)和10天(D10)外周T细胞上不同表面标志物表达的分析。图20。研究终止时(第一次治疗剂注射后D10)媒介(黑色柱)或抗CD20/抗CD3TCB抗体(图2B中所示分子“B”)(白色柱)处理的完全人源化小鼠的脾中B细胞频率(A)，T细胞频率(B)和T细胞上表面标志物表达(C)的分析。图21。抗CD20/抗CD3TCB抗体(图2B中所示分子“B”)(0.5mg/kg，一周一次)在具有huPBMC转移的NOG小鼠中的WSU-DLCL2模型中的抗肿瘤活性。图22。实施例2中制备的“2+1IgGCrossFab，倒转的”分子的示图。(1)无电荷修饰的分子，(2)有特异性结合BCMA的Fab分子的CH1和CL域中的电荷修饰(EE＝147E，213E；KK＝123K，124K)的分子。图23。实施例2中使用的“2+1IgGCrossFab，倒转的”分子的CE-SDS分析(道A＝非还原的，道B＝还原的，道A的峰的表)。将不同纯化方法(蛋白A亲和层析(PA)，大小排阻层析(SEC)，阳离子交换层析(cIEX)，和最终的大小排阻层析步骤(re-SEC))应用于无电荷修饰的分子(83A10-TCB)和有电荷修饰的分子(83A10-TCBcv)。图24。实施例2中使用的“2+1IgGCrossFab，倒转的”分子的CE-SDS分析(道A＝非还原的，道B＝还原的，道A的峰的表)，蛋白A亲和层析(PA)和大小排阻层析(SEC)纯化步骤后的头-对-头(H2H)比较。图25。抗BCMA/抗CD3T细胞双特异性抗体对BCMA阳性多发性骨髓瘤细胞系的结合的流式细胞术分析。(A)H929细胞和MKN45细胞上的83A10-TCB，(B)H929细胞和MKN45细胞上的83A10-TCBcv，(C)H929细胞上的83A10-TCB和83A10-TCBcv的比较。图26。抗BCMA/抗CD3TCB抗体((A)83A10-TCB，(B)83A10-TCBcv)对BCMA阳性H929骨髓瘤细胞的杀伤，如通过LDH释放测量的。图27。实施例3中制备的TCB的示图。(A)有电荷修饰的“2+1IgGCrossFab，倒转的”(CD3结合物中的VH/VL交换，Her2结合物中的电荷修饰，EE＝147E，213E；RK＝123R，124K)，(B)有电荷修饰的“2+1IgGCrossFab”(CD3结合物中的VH/VL交换，Her3结合物中的电荷修饰，EE＝147E，213E；RK＝123R，124K)。图28。实施例3中制备的TCB(最终的经过纯化的制备物)的CE-SDS分析。(A)图27A中所示Her2TCB的电泳图，(B)图27B中所示Her3TCB的电泳图。道A＝非还原的，道B＝还原的。图29。Her2TCB(A)和Her3TCB(B)对细胞的结合，如通过FACS测定的。Her2TCB分子对Jurkat细胞上的人CD3(左)或KPL-4细胞上的人Her2(A)或Her3(B)(右)的结合的中值荧光强度，如通过流式细胞术测量的。所描绘的是基于一式三份的中值荧光值，包括SD。图30。Her3TCB对T细胞的活化。在人PBMC效应细胞，KPL-4靶细胞和渐增浓度的Her3TCB的共温育后，通过48小时后的FACS测量CD69阳性CD8T细胞的百分比。所显示的是一式三份及SD。图31。5小时后Jurkat细胞经由CD3的活化，如通过发光测定的。将KPL4肿瘤细胞与Jurkat-NFAT报告细胞(E:T5:1(A)或2.5:1(B))和渐增浓度的Her2TCB(A)或Her3TCB(B)一起温育后，通过5小时后的相对发光信号(RLUS)测定Jurkats的活化。通过GraphPadPrism计算EC50值(34.4pM(A)和22pM(B))。所描绘的是来自一式三份的平均值，误差柱指示SD。图32。(A，B)将Her2阳性KPL4，N87，T47D或MDA-MB-231靶细胞与人PBMC效应细胞(E:T10:1)和渐增浓度的Her2TCB分子一起温育25小时(A)或46小时(B)后的肿瘤细胞裂解，如通过LDH释放测量的。所描绘的是来自一式三份的平均值，误差柱指示SD。通过GraphPadPrism计算EC50值：7.5pM(KPL4细胞)，25.6pM(N87细胞)，30.6pM(T47D细胞)，和59.9pM(MDA-MB-231细胞)。(C)将Her3阳性KPL4靶细胞与人PBMC效应细胞(E:T10:1)和所标注的渐增浓度的Her3TCB分子一起温育24小时或48小时后的肿瘤细胞裂解，如通过LDH释放测量的。所描绘的是来自一式三份的平均值，误差柱指示SD。通过GraphPadPrism计算EC50值：2.54pM(24h)和0.53pM(48h)。图33。由Her3TCB诱导的肿瘤细胞裂解，如通过胱天蛋白酶3/7活性(发光)测定的。所显示的是相对发光信号，是作为与PBMC(E:T＝10:1)和所标注的不同浓度的Her3TCB共温育6.5小时后KPL-4-胱天蛋白酶-3/7GloSensor靶细胞中胱天蛋白酶3/7活性的后果测量的。所显示的是一式三份及SD。通过GraphPadPrism计算EC50值：0.7pM。图34。实施例4中制备的TCB的示图。(A)有电荷修饰的“(Fab)2-CrossFab”(CD3结合物中的VH/VL交换，MCSP结合物中的电荷修饰，EE＝147E，213E；RK＝123R，124K)，(B)无电荷修饰的“(Fab)2-CrossFab”(CD3结合物中的VH/VL交换)。图35。实施例4中制备的有电荷修饰的TCB(最终的经过纯化的制备物)的CE-SDS分析：图34A中所示(Fab)2-XFab-LC007cv的电泳图。道A＝非还原的，道B＝还原的。图36。TCB分子对MV-3细胞上的人MCSP(左)或Jurkat细胞上的人CD3(右)的结合的中值荧光强度，如通过流式细胞术测量的。所描绘的是基于一式三份的中值荧光值，包括SD。图37。将人MCSP阳性MV-3细胞与人PBMC效应细胞(E:T10:1)和渐增浓度的TCB分子一起温育24小时(左)或48小时(右)后的肿瘤细胞裂解，如通过LDH释放测量的。所描绘的是来自一式三份的平均值，误差柱指示SD。发明详述定义除非在下文另外定义，术语在本文中如本领域中一般使用的那样使用。如本文中使用的，术语“抗原结合分子”在其最广义上指特异性结合抗原性决定簇的分子。抗原结合分子的例子是免疫球蛋白及其衍生物，例如片段。术语“双特异性”意指抗原结合分子能够特异性结合至少两种不同的抗原性决定簇。通常，双特异性抗原结合分子包含两种抗原结合位点，其中每种特异于不同的抗原性决定簇。在某些实施方案中，所述双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原性决定簇，特别是在两种不同的细胞上表达的两种抗原性决定簇。如本文中使用的，术语“价”指抗原结合分子中规定数目的抗原结合位点的存在。因而，术语“对抗原的单价结合”指抗原结合分子中一个(且不超过一个)特异于抗原的抗原结合位点的存在。“抗原结合位点”指抗原结合分子上提供与抗原相互作用的位点，即一个或多个氨基酸残基。例如，抗体的抗原结合位点包含来自互补性决定区(CDR)的氨基酸残基。天然的免疫球蛋白分子通常具有两个抗原结合位点，Fab分子通常具有单个抗原结合位点。如本文中使用的，术语“抗原结合模块”指特异性结合抗原性决定簇的多肽分子。在一个实施方案中，抗原结合模块能够将与其附接的实体(例如第二抗原结合模块)引导至靶部位，例如至特定类型的肿瘤细胞或携有抗原性决定簇的肿瘤基质。在另一个实施方案中，抗原结合模块能够经由其靶抗原例如T细胞受体复合物抗原来激活信号传导。抗原结合模块包括如本文中另外定义的抗体及其片段。具体的抗原结合模块包括抗体的抗原结合域，其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。在某些实施方案中，抗原结合模块可以包含抗体恒定区，如本文中另外定义和本领域中已知的。可用的重链恒定区包括以下5种同种型中的任何一种：α，δ，ε，γ或μ。可用的轻链恒定区包括以下2种同种型中的任何一种：κ和λ。如本文中使用的，术语“抗原性决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且指多肽大分子上与抗原结合模块结合，从而形成抗原结合模块-抗原复合物的位点(例如氨基酸的连续区段或由不连续氨基酸的不同区构成的构象性构造)。可用的抗原性决定簇可以在例如肿瘤细胞表面上，病毒感染的细胞的表面上，其它患病细胞的表面上，免疫细胞的表面上，游离在血液血清中和/或在胞外基质(ECM)中找到。除非另外指示，本文中称作抗原的蛋白质(例如CD3)可以是来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然形式蛋白质。在一个具体的实施方案中，抗原是人蛋白。在对本文中的特定蛋白质进行提述的情况下，该术语涵盖“全长”，未加工的蛋白质以及起因于细胞中加工的蛋白质的任何形式。该术语还涵盖蛋白质的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。可用作抗原的一种例示性人蛋白是CD3，特别是CD3的ε亚基(对于人序列，参见UniProtno.P07766(版本130)，NCBIRefSeqno.NP_000724.1，SEQIDNO:1；或对于食蟹猴[Macacafascicularis]序列，参见UniProtno.Q95LI5(版本49)，NCBIGenBankno.BAB71849.1，SEQIDNO:2)。在某些实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子结合在来自不同物种的CD3或靶细胞抗原间保守的CD3或靶细胞抗原的表位。“特异性结合”意指结合对于抗原是选择性的，并且能与不想要的或非特异性的相互作用区别开来。抗原结合模块结合特定抗原性决定簇的能力能经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟知的其它技术，例如表面等离振子共振技术(在BIAcore仪上分析)(Liljeblad等,GlycoJ17,323-329(2000))，以及传统的结合测定法(Heeley,EndocrRes28,217-229(2002))来测量。在一个实施方案中，抗原结合模块对无关蛋白的结合程度是该抗原结合模块对抗原结合的小于约10％，如例如通过SPR测量的。在某些实施方案中，结合抗原的抗原结合模块，或包含该抗原结合模块的抗原结合分子具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(KD)。“亲和力”指分子(例如受体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如配体)之间非共价相互作用总和的强度。除非另外指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗原结合模块和抗原，或受体及其配体)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以以解离常数(KD)来表述，其为解离与结合速率常数(分别为K解离和K结合)的比率。如此，相等的亲和力可能包含不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同。亲和力可以通过本领域知道的确立方法来测量，包括本文中描述的那些方法。用于测量亲和力的一种具体方法是表面等离振子共振(SPR)。“降低的结合”，例如降低的对Fc受体的结合，指相应相互作用的亲和力降低，如例如通过SPR测量的。为了清楚，该术语还包括亲和力降低至0(或低于分析方法的检测限)，即完全消除相互作用。相反，“升高的结合”指相应相互作用的结合亲和力升高。如本文中使用的，“活化性T细胞抗原”指在T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的表面上表达的抗原性决定簇，其在与抗原结合分子相互作用后能诱导T细胞活化。特定地，抗原结合分子与活化性T细胞抗原的相互作用可诱导T细胞活化，其通过触发T细胞受体复合物的信号传导级联进行。在一个具体的实施方案中，所述活化性T细胞抗原是CD3，特别是CD3的ε亚基(对于人序列，参见UniProtno.P07766(版本130)，NCBIRefSeqno.NP_000724.1，SEQIDNO:1；或对于食蟹猴[Macacafascicularis]序列，参见UniProtno.Q95LI5(版本49)，NCBIGenBankno.BAB71849.1，SEQIDNO:2)。。如本文中使用的，“T细胞活化”指T淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞的一种或多种细胞应答，其选自：增殖，分化，细胞因子分泌，细胞毒性效应分子释放，细胞毒性活性和活化标志物的表达。本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子能够诱导T细胞活化。合适的测量T细胞活化的测定法是本文中所述
技术领域：
中已知的。如本文中使用的，“靶细胞抗原”指靶细胞表面上呈现的抗原性决定簇，所述靶细胞例如肿瘤中的细胞如癌细胞或肿瘤基质的细胞。在一个特别的实施方案中，所述靶细胞抗原是CD20，特别是人CD20(见UniProtno.P11836)。如本文中使用的，术语“第一”，“第二”或“第三”就Fab分子等而言为了在有超过一个每类模块时便于区分而使用。除非明确如此陈述，这些术语的使用不意图赋予T细胞活化性双特异性抗原结合分子的特定次序或取向。“Fab分子”指由免疫球蛋白的重链(“Fab重链”)的VH和CH1域以及轻链(“Fab轻链”)的VL和CL域组成的蛋白质。“融合”意指组分(例如Fab分子和Fc域亚基)直接地或经由一种或多种肽接头通过肽键连接。如本文中使用的，术语“单链”指包含通过肽键线性连接的氨基酸单体的分子。在某些实施方案中，抗原结合模块之一是单链Fab分子，即其中通过肽接头连接Fab轻链和Fab重链以形成单一肽链的Fab分子。在一个具体的此类实施方案中，在单链Fab分子中Fab轻链的C端连接于Fab重链的N端。“交换”Fab分子(也称作“Crossfab”)意指其中Fab重链和轻链的可变域交换(即彼此替换)的Fab分子，即交换Fab分子包含由轻链可变域VL和重链恒定域1CH1构成的肽链(VL-CH1，N至C端方向)，和由重链可变域VH和轻链恒定域CL构成的肽链(VH-CL，N至C端方向)。为了清楚，在其中Fab轻链和Fab重链的可变域交换的交换Fab分子中，包含重链恒定域1CH1的肽链在本文中称作交换Fab分子的“重链”。与之相反，“常规”Fab分子意指处于它的天然型式的Fab分子，即包含由重链可变和恒定域构成的重链(VH-CH1，N至C端方向)，和由轻链可变和恒定域构成的轻链(VL-CL，N至C端方向)。术语“免疫球蛋白分子”指具有天然存在的抗体结构的蛋白质。例如，IgG类的免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由二硫键连接的两条轻链和两条重链构成。从N端至C端，每条重链具有可变域(VH)，也称作可变重域或重链可变区，接着是3个恒定域(CH1，CH2和CH3)，也称作重链恒定区。类似地，从N端至C端，每条轻链具有可变域(VL)，也称作可变轻域或轻链可变区，接着是恒定轻(CL)域(也称作轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可以归入称作α(IgA)，δ(IgD)，ε(IgE)，γ(IgG)或μ(IgM)的5类之一，其中一些可以进一步分成亚类，例如γ1(IgG1)，γ2(IgG2)，γ3(IgG3)，γ4(IgG4)，α1(IgA1)和α2(IgA2)。基于其恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白的轻链可以归入称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)的两类之一。免疫球蛋白基本由经由免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和Fc域组成。术语“抗体”在本文中以最广义使用且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。“抗体片段”指完整抗体外的分子，其包含完整抗体中结合与完整抗体结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2，双抗体，线性抗体，单链抗体分子(例如scFv)，和单域抗体。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson等,NatMed9,129-134(2003)。对于scFv片段的综述，参见例如Plückthun,于ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,vol.113,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994)；亦参见WO93/16185；和美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的论述，参见美国专利No.5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见例如EP404,097；WO1993/01161；Hudson等,NatMed9,129-134(2003)；和Hollinger等,ProcNatlAcadSciUSA90,6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson等,NatMed9,129-134(2003)。单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域，或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利No.6,248,516B1)。可以通过各种技术来制备抗体片段，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文中描述的。术语“抗原结合域”指包含特异性结合部分或整个抗原且与其互补的区域的抗体部分。抗原结合域可由例如一个或多个抗体可变域(也称作抗体可变区)提供。具体地，抗原结合域包含抗体轻链可变域(VL)和抗体重链可变域(VH)。术语“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链中牵涉使抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构，每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)。参见例如Kindt等,KubyImmunology,第6版,W.H.FreemanandCo.,第91页(2007)。单个VH或VL域可能足以赋予抗原结合特异性。如本文中使用的，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中序列中高度可变和/或形成结构上定义的环(“高变环”)的每个区域。通常，天然的四链抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1，H2，H3)，三个在VL中(L1，L2，L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自互补性决定区(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列变异性和/或涉及抗原识别。除了VH中CDR1外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVR)也称作“互补性决定区”(CDR)，并且在述及形成抗原结合区的可变区部分时，这些术语在本文中可交换使用。此特定区域已由Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)及Chothiaetal.,JMolBiol196:901-917(1987)描述，其中定义包括在彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一种定义来指抗体或其变体的CDR意图在如本文中定义和使用的术语的范围内。涵盖如由上文引用的每篇参考文献定义的CDR的适宜的氨基酸残基在下表1中列出作为比较。涵盖特定CDR的确切残基数将随着CDR的序列和大小而变化。鉴于抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规确定哪些残基构成特定CDR。本文中给出的CDR序列一般是依照Kabat定义的。表1：CDR定义11表1中所有CDR定义的编号方式依照由Kabat等提出的编号惯例(见下文)。2如表1中使用的具有小写字母“b”的“AbM”指由OxfordMolecular的“AbM”抗体建模软件定义的CDR。Kabat等还定义针对可变区序列的编号系统，其可应用于任何抗体。本领域的普通技术人员可以明确地将此“Kabat编号”系统归入任何可变区序列，不依赖于序列本身外的任何实验数据。如本文中结合可变区序列使用的，“Kabat编号方式”指由Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)提出的编号系统。除非另外说明，提及抗体可变区中特定氨基酸残基位置的编号方式依照Kabat编号系统。如本文中使用的，所有重和轻链的恒定区和域的氨基酸位置是依照Kabat,etal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thed.,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号系统编号的且在本文中称作“依照Kabat的编号方式”或“Kabat编号方式”。具体而言，将Kabat编号系统(参见Kabat,etal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thed.,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)的第647-660页)用于卡帕和拉姆达同种型的轻链恒定域CL并将KabatEU索引编号系统(参见第661-723页)用于重链恒定域(CH1，铰链，CH2和CH3)，在这种情况中在本文中通过提到“依照KabatEU索引的编号方式”来进一步澄清。序列表的多肽序列并不依照Kabat编号系统编号。然而，本领域中普通技术人员完全能将序列表的序列编号方式转变成Kabat编号方式。“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。可变域的FR一般由4个FR域组成：FR1，FR2，FR3和FR4。因而，HVR和FR序列一般以下列顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。抗体或免疫球蛋白的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5种主要的类：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且这些中数种可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2。对应于不同免疫球蛋白类的重链恒定域分别称作α，δ，ε，γ和μ。本文中术语“Fc域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区的一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然IgG重链的Fc区的边界可以略微变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为自Cys226或Pro230延伸至重链的羧基端。然而，由宿主细胞生成的抗体可能经历翻译后切割，自重链的C端切除一个或多个，特别是一个或两个氨基酸。因此，通过表达编码全长重链的特定核酸分子由宿主细胞生成的抗体可包括全长重链，或者它可包括全长重链的切割变体(在本文中也称作“切割变体重链”)。当重链的最终两个C端氨基酸是甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447，编号方式依照KabatEU索引)时可能就是这种情况。因此，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)，或C端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(K447)可以存在或不存在。如果没有另外指明的话，包括Fc域(或本文中定义的Fc域的亚基)的重链的氨基酸序列在本文中表示无C端甘氨酸-赖氨酸二肽的。在本发明的一个实施方案中，依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子中包含的包括本文中规定的Fc域的一个亚基的重链包含另外的C端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，编号方式依照Kabat的EU索引)。在本发明的一个实施方案中，依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子中包含的包括本文中规定的Fc域的一个亚基的重链包含另外的C端甘氨酸残基(G446，编号方式依照Kabat的EU索引)。本发明的组合物，诸如本文所述药物组合物，包含本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的群体。T细胞活化性双特异性抗原结合分子的群体可包含具有全长重链的分子和具有切割变体重链的分子。T细胞活化性双特异性抗原结合分子的群体可以由具有全长重链的分子和具有切割变体重链的分子的混合物组成，其中至少50％，至少60％，至少70％，至少80％或至少90％的T细胞活化性双特异性抗原结合分子具有切割变体重链。在本发明的一个实施方案中，包含本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的群体的组合物包含如下的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含包括本文中规定的Fc域的一个亚基及另外的C端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，编号方式依照Kabat的EU索引)的重链。在本发明的一个实施方案中，包含本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的群体的组合物包含如下的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含包括本文中规定的Fc域的一个亚基及另外的C端甘氨酸残基(G446，编号方式依照Kabat的EU索引)的重链。在本发明的一个实施方案中，此类组合物包含由如下分子构成的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的群体：包含包括本文中规定的Fc域的一个亚基的重链的分子；包含包括本文中规定的Fc域的一个亚基及另外的C端甘氨酸残基(G446，编号方式依照Kabat的EU索引)的重链的分子，和包含包括本文中规定的Fc域的一个亚基及另外的C端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，编号方式依照Kabat的EU索引)的重链的分子。除非本文中另外指定，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，也称作EU索引，如记载于Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD,1991(也参见上文)。如本文中使用的，Fc域的“亚基”指形成二聚体Fc域的两个多肽之一，即包含免疫球蛋白重链中能够稳定自身联合的C端恒定区的多肽。例如，IgGFc域的亚基包含IgGCH2和IgGCH3恒定域。“促进Fc域的第一亚基和第二亚基联合的修饰”是降低或防止包含Fc域亚基的多肽与相同多肽联合以形成同二聚体的肽主链操作或Fc域亚基的翻译后修饰。如本文中使用的，具体地，促进联合的修饰包括对期望联合的两个Fc域亚基(即Fc域的第一亚基和第二亚基)中的每一个进行的分开的修饰，其中所述修饰彼此互补，从而促进两个Fc域亚基的联合。例如，促进联合的修饰可以改变一种或两种Fc域亚基的结构或电荷，从而在立体或静电上分别促进它们的联合。如此，异二聚化在包含第一Fc域亚基的多肽和包含第二Fc域亚基的多肽之间发生，其在融合至每个亚基的别的组分(例如抗原结合模块)不同这一意义上讲可能是不相同的。在一些实施方案中，促进联合的修饰包含在Fc域中的氨基酸突变，具体为氨基酸替代。在一个具体的实施方案中，促进联合的修饰包含Fc域的两个亚基的每一个中分开的氨基酸突变，具体为氨基酸替代。术语“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)，Fc受体结合，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，细胞因子分泌，免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取，细胞表面受体(例如B细胞受体)下调和B细胞活化。如本文中使用的，术语“工程化”视为包括对肽主链的任何操作或对天然存在或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程化包括对氨基酸序列，糖基化模式或各氨基酸侧链基团的修饰，以及这些办法的组合。如本文中使用的，术语“氨基酸突变”意为涵盖氨基酸替代，缺失，插入和修饰。可以进行取代，缺失，插入和修饰的任意组合来实现最终构建体，只要最终构建体拥有期望的特性，例如降低的对Fc受体的结合，或与另一种肽的增加的联合。氨基酸序列缺失和插入包括氨基和/或羧基端缺失和氨基酸插入。具体的氨基酸突变是氨基酸替代。为了改变例如Fc区的结合特征，特别优选非保守性的氨基酸替代，即将一个氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换。氨基酸替代包括由非天然存在的氨基酸或由20种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟脯氨酸，3-甲基组氨酸，鸟氨酸，高丝氨酸，5-羟赖氨酸)替换。可以使用本领域中公知的遗传或化学方法生成氨基酸突变。遗传方法可以包括定点诱变，PCR，基因合成等。通过与遗传工程化不同的方法如化学修饰来改变氨基酸侧链基团的方法也可能可用。本文中可使用各种名称来指示同一氨基酸突变。例如，从Fc域第329位脯氨酸到甘氨酸的取代可指示为329G，G329，G329，P329G或Pro329Gly。如本文中使用的，术语“多肽”指由通过酰胺键(也称作肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”指具有两个或更多个氨基酸的任何链，并且不指特定长度的产物。如此，肽，二肽，三肽，寡肽，“蛋白质”，“氨基酸链”或任何其它用于指具有两个或更多个氨基酸的链的术语均包括在“多肽”的定义中，而且术语“多肽”可以代替这些术语中任一个或与其交换使用。术语“多肽”还意图指多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化，乙酰化，磷酸化，酰化，通过已知的保护性/封闭性基团衍生化，蛋白水解切割，或通过非天然存在的氨基酸的修饰。多肽可以自天然的生物学来源衍生或通过重组技术生成，但不必从指定的核酸序列翻译。它可以以任何方式来生成，包括通过化学合成。本发明的多肽大小可以是约3个以上，5个以上，10个以上，20个以上，25个以上，50个以上，75个以上，100个以上，200个以上，500个以上，1,000个以上，或2,000个以上的氨基酸。多肽可以具有限定的三维结构，尽管它们不必具有此类结构。具有限定的三维结构的多肽被称作折叠的，而不具有限定的三维结构而可以采用大量不同构象的多肽被称作未折叠的。“分离的”多肽或其变体或衍生物意图为不处于其天然环境中的多肽。不需要特定水平的纯化。例如，分离的多肽可以是从其天然或自然环境中取出。就本发明的目的而言，在宿主细胞中表达的重组生成的多肽和蛋白质被视为分离的，已通过任何合适的技术分开，分级，或部分或基本上纯化的天然的或重组的多肽也是如此。关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为测定百分比氨基酸序列同一性目的比对可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于比对序列的适宜参数，包括在比较序列的全长里获得最大比对需要的任何算法。然而，就本文中目的而言，使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.创作，并且源代码已与用户文档一起提交到美国版权局(U.S.CopyrightOffice)，WashingtonD.C.，20559，其在美国版权注册No.TXU510087下注册。ALIGN-2程序可从Genentech，Inc.，SouthSanFrancisco，California公开获得，或可从源代码汇编。ALIGN-2程序应当汇编用于UNIX操作系统，包括数字UNIXV4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设定且不改变。在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定的氨基酸序列A对/与/相对给定的氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或其可以用短语表示为对/与/相对给定的氨基酸序列B具有或包含特定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：分数X/Y的100倍其中X是由序列比对程序ALIGN-2在所述程序对A和B的比对中评为相同匹配的氨基酸残基数，而其中Y是B中氨基酸残基的总数。会领会的是，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A对B的％氨基酸序列同一性将不等于B对A的％氨基酸序列同一性。除非另外明确说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值如在上一段中描述的那样使用ALIGN-2计算机程序获得。术语“多核苷酸”指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)，病毒衍生的RNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如酰胺键，如在肽核酸(PNA)中发现的)。术语“核酸分子”指任何一种或多种存在于多核苷酸中的核酸区段，例如DNA或RNA片段。“分离的”核酸分子或多核苷酸意指已从其天然环境取出的核酸分子，DNA或RNA。例如，就本发明的目的而言，包含在载体中的编码多肽的重组多核苷酸被视为分离的。分离的多核苷酸的别的例子包括在异源宿主细胞中保持的重组多核苷酸或溶液中的(部分或基本上)纯化的多核苷酸。分离的多核苷酸包括在普遍含有该多核苷酸分子的细胞中含有的多核苷酸分子，但该多核苷酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置处。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录本，以及正链和负链形式，和双链形式。依照本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合成生成的此类分子。另外，多核苷酸或核酸可以为或可以包括调节元件如启动子，核糖体结合位点或转录终止子。与本发明的参照核苷酸序列具有至少例如95％“相同的”核苷酸序列的核酸或多核苷酸意指该多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相同，只不过按照参照核苷酸序列的每100个核苷酸，该多核苷酸序列可以包含多达5处点突变。换言之，为了获得与参照核苷酸序列具有至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，可以删除或用另一种核苷酸取代参照序列中高达5％的核苷酸，或者可以将参照序列中占总核苷酸的高达5％的数目的核苷酸插入到参照序列中。参照序列的这些变更可以发生在参照核苷酸序列的5’或3’端位置或那些末端位置之间的任何地方，个别分散在参照序列中的残基中或分散在参照序列内的一或多个连续组中。作为一个实际问题，可以使用已知的计算机程序，如上文针对多肽论述的程序(例如ALIGN-2)来常规确定任何特定的多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列为至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同。术语“表达盒”指重组或合成生成的，具有一系列允许特定核酸在靶细胞中转录的指定核酸元件的多核苷酸。可以将重组表达盒掺入质粒，染色体，线粒体DNA，质体DNA，病毒或核酸片段中。通常，表达载体的重组表达盒部分包含要转录的核酸序列和启动子等。在某些实施方案中，本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。术语“载体”或“表达载体”与“表达构建体”同义，并指用于在靶细胞中导入与其可操作联合的特定基因及指导表达的DNA分子。该术语包括作为自主复制核酸结构的载体以及掺入到已经接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许转录大量稳定的mRNA。一旦表达载体在靶细胞内，就通过细胞转录和/或翻译装置生成基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施方案中，本发明的表达载体包含表达盒，其包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。术语“宿主细胞”，“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换使用并指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括初始转化的细胞和自其衍生的后代(不考虑传代数)。后代在核酸内含物上可能与亲本细胞不完全相同，但可以含有突变。本文中包括具有如原始转化细胞中筛选或选择的相同的功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞是能用于生成本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养细胞如CHO细胞，BHK细胞，NS0细胞，SP2/0细胞，YO骨髓瘤细胞，P3X63小鼠骨髓瘤细胞，PER细胞，PER.C6细胞或杂交瘤细胞，酵母细胞，昆虫细胞和植物细胞等，而且还包括在转基因动物，转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。“激活Fc受体”是一种在抗体的Fc域衔接后，引发刺激携带该受体的细胞实施效应器功能的信号传导事件的Fc受体。人激活Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)，FcγRI(CD64)，FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是一种导致通过免疫效应器细胞对抗体包被的靶细胞裂解的免疫机制。靶细胞是包含Fc区的抗体或其衍生物一般经由Fc区的N端的蛋白质部分特异性结合的细胞。如本文中使用的，术语“降低的ADCC”定义为通过上文定义的ADCC机制，以靶细胞周围介质中给定浓度的抗体，在给定的时间内裂解的靶细胞数目的降低，和/或通过ADCC机制，实现给定时间内给定数目的靶细胞裂解需要的靶细胞周围介质中抗体浓度的增加。ADCC的降低相对于使用相同的标准生产，纯化，配制和贮存方法(其是本领域技术人员已知的)，由同一类型的宿主细胞生成但尚未工程化改造的相同抗体介导的ADCC。例如，由在其Fc域包含降低ADCC的氨基酸替代的抗体所介导的ADCC中的降低，是相对于由在Fc域中无此氨基酸替代的相同抗体介导的ADCC而言。测量ADCC的合适测定法是本领域中公知的(参见例如PCT公开文本no.WO2006/082515或PCT公开文本no.WO2012/130831)。药剂的“有效量”指引起接受其施用的细胞或组织中的生理学变化必需的量。药剂例如药物组合物的“治疗有效量”指有效实现期望的治疗或预防结果的量(以必要的剂量且持续必要的时间)。治疗有效量的药剂例如消除，降低，延迟，最小化或预防疾病的不良作用。“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛，绵羊，猫，犬和马)，灵长类(例如人和非人灵长类如猴)，家兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。优选地，所述个体或受试者是人。术语“药物组合物”指其形式使得容许其中含有的活性成分的生物学活性有效，且不含对会接受配制剂施用的受试者有不可接受的毒性的别的成分的制剂。“药学可接受载体”指药物组合物中活性成分以外对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂，赋形剂，稳定剂或防腐剂。如本文中使用的，“治疗/处理”(及其语法变体)指试图改变治疗个体中疾病的自然进程，并且可以是为了预防或在临床病理学的过程期间实施的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发，缓解症状，降低疾病的任何直接或间接病理学后果，预防转移，减缓疾病进展率，改善或减轻疾病状态，及消退或改善的预后。在一些实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子用于延迟疾病的形成或延缓病症的进展。术语“包装插页”用于指治疗产品的商业化包装中通常含有的说明书，其含有关于适应症，使用，剂量，施用，组合疗法，禁忌症的信息和/或关于使用此类治疗产品的警告。实施方案的详细描述本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其具有对于治疗性应用有利的特性，特别是改善的生产力(例如就纯度，产量而言)。本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子中包含的Fab分子中的氨基酸替代特别有效地减少轻链与非匹配重链的错配(Bence-Jones型副产物)，在它们的一个(或多个，在分子包含超过两个抗原结合Fab分子的情况中)结合臂具有VH/VL交换的基于Fab的双/多特异性抗原结合分子的生产中可发生所述错配(还可参见PCT申请No.PCT/EP2015/057165，特别是其中的实施例，通过援引完整收入本文)。在本发明的第一个方面，本发明提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含(a)特异性结合第一抗原的第一Fab分子，(b)特异性结合第二抗原的第二Fab分子，且其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的，其中第一抗原是活化性T细胞抗原且第二抗原是靶细胞抗原，或第一抗原是靶细胞抗原且第二抗原是活化性T细胞抗原；且其中i)在a)下的第一Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用带正电荷的氨基酸替代(编号方式依照Kabat)，且其中在a)下的第一Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸用带负电荷的氨基酸替代(编号方式依照KabatEU索引)；或ii)在b)下的第二Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用带正电荷的氨基酸替代(编号方式依照Kabat)，且其中在b)下的第二Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸用带负电荷的氨基酸替代(编号方式依照KabatEU索引)。依照本发明，T细胞活化性双特异性抗原结合分子没有同时包含i)和ii)下提到的修饰。第二Fab分子的恒定域CL和CH1没有彼此替换(即保持不交换)。在依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个实施方案中，在a)下的第一Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个优选的实施方案中用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代)，且在a)下的第一Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照KabatEU索引)。在又一个实施方案中，在a)下的第一Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)，且在a)下的第一Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照KabatEU索引)。在一个具体的实施方案中，在a)下的第一Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个优选的实施方案中用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个优选的实施方案中用赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立替代)，且在a)下的第一Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照KabatEU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照KabatEU索引)。在一个更加具体的实施方案中，在a)下的第一Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)或精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)，且在a)下的第一Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)。在一个甚至更加具体的实施方案中，在a)下的第一Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)，且在a)下的第一Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)。在具体的实施方案中，a)下的第一Fab分子的恒定域CL是卡帕同种型的。或者，依照上文实施方案的氨基酸替代可以在b)下的第二Fab分子的恒定域CL和恒定域CH1中进行，代替在a)下的第一Fab分子的恒定域CL和恒定域CH1中进行。在特定的此类实施方案中，b)下的第二Fab分子的恒定域CL是卡帕同种型的。依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以进一步包含特异性结合所述第一抗原的第三Fab分子。在具体的实施方案中，所述第三Fab分子与a)下的第一Fab分子相同。在这些实施方案中，依照上文实施方案的氨基酸替代会在第一Fab分子和第三Fab分子每一个的恒定域CL和恒定域CH1中进行。或者，依照上文实施方案的氨基酸替代可以在b)下的第二Fab分子的恒定域CL和恒定域CH1中进行，但是不在第一Fab分子和第三Fab分子的恒定域CL和恒定域CH1中进行。在具体的实施方案中，依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含由能够稳定联合的第一亚基和第二亚基构成的Fc域。T细胞活化性双特异性抗原结合分子型式T细胞活化性双特异性抗原结合分子的各组分可以以多种构造彼此融合。例示性的构造绘于图1中。在具体的实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含由能够稳定联合的第一亚基和第二亚基构成的Fc域。在一些实施方案中，第二Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第一或第二亚基的N端。在一个此类类实施方案中，第一Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端。在一个特定的此类实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本由以下组成：第一和第二Fab分子，由第一亚基和第二亚基构成的Fc域，和任选的一个或多个肽接头，其中第一Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端，且第二Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第一或第二亚基的N端。此类构造示意性描绘于图1G和1K。任选地，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。在另一个此类实施方案中，第一Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第一或第二亚基的N端。在一个特定的此类实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本由以下组成：第一和第二Fab分子，由第一和第二亚基构成的Fc域和任选地一个或多个肽接头，其中第一和第二Fab分子各自在Fab重链的C端融合至Fc域的亚基之一的N端。此类构造示意性描绘于图1A和1D。第一和第二Fab分子可以直接或经由肽接头融合至Fc域。在一个具体的实施方案中，第一和第二Fab分子各自经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域。在一个具体的实施方案中，所述免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区，特别是在Fc域是IgG1Fc域的情况中。在其它实施方案中，第一Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第一或第二亚基的N端。在一个此类实施方案中，第二Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端。在一个具体的此类实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本由以下组成：第一和第二Fab分子，由第一和第二亚基构成的Fc域和任选地一个或多个肽接头，其中第二Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端，且第一Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第一或第二亚基的N端。此类构造示意性描绘于图1H和1L。任选地，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。Fab分子可以直接或经由肽接头融合至Fc域或彼此融合，所述肽接头包含一个或多个氨基酸，通常约2-20个氨基酸。肽接头是本领域中已知且本文中记载的。合适的，非免疫原性的肽接头包括例如(G4S)n，(SG4)n，(G4S)n或G4(SG4)n肽接头。“n”一般是1至10，通常是2至4的整数。在一个实施方案中，所述肽接头具有至少5个氨基酸的长度，在一个实施方案中5至100个氨基酸的长度，在又一个实施方案中10至50个氨基酸的长度。在一个实施方案中，所述肽接头是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，且(x＝3，n＝3，4，5或6，和m＝0，1，2或3)或(x＝4，n＝2，3，4或5和m＝0，1，2或3)，在一个实施方案中，x＝4和n＝2或3，在又一个实施方案中，x＝4和n＝2。在一个实施方案中，所述肽接头是(G4S)2。一种特别适合于将第一和第二Fab分子的Fab轻链彼此融合的肽接头是(G4S)2。一种适合于连接第一和第二Fab分子的Fab重链的例示性肽接头包含序列(D)-(G4S)2(SEQIDNO11和12)。另外，接头可包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。特别地，当Fab分子融合至Fc域亚基的N端时，其可以在有或无另外的肽接头的情况下经由免疫球蛋白铰链区或其部分融合。具有单个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合模块(诸如Fab分子)的T细胞活化性双特异性抗原结合分子(例如如图1A，D，G，H，K，L中显示的)是有用的，特别是在高亲和力抗原结合模块结合后预期靶细胞抗原内在化的情况中。在此类情况中，存在超过一个特异于靶细胞抗原的抗原结合模块可能增强靶细胞抗原的内在化，由此降低其利用度。然而，在许多其它情况中，会有利的是具有包含两个或更多个特异于靶细胞抗原的抗原结合模块(诸如Fab分子)的T细胞活化性双特异性抗原结合分子(见图1B，1C，1E，1F，1I，1J，1M或1N中所示例子)，从而例如优化对靶部位的靶向或允许靶细胞抗原的交联。因而，在特定的实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含特异性结合第一抗原的第三Fab分子。第一抗原优选是靶细胞抗原。在一个实施方案中，第三Fab分子是常规Fab分子。在一个实施方案中，第三Fab分子与第一Fab分子相同(即第一和第三Fab分子包含相同的重和轻链氨基酸序列且具有相同的域布局(即常规或交换))。在一个特定的实施方案中，第二Fab分子特异性结合活化性T细胞抗原，特别是CD3，且第一和第三Fab分子特异性结合靶细胞抗原。在备选实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含特异性结合第二抗原的第三Fab分子。在这些实施方案中，第二抗原优选是靶细胞抗原。在一个此类实施方案中，第三Fab分子是交换Fab分子(其中Fab重和轻链的可变域VH和VL彼此交换/替换的Fab分子)。在一个此类实施方案中，第三Fab分子与第二Fab分子相同(即第二和第三Fab分子包含相同的重和轻链氨基酸序列且具有相同的域布局(即常规或交换))。在一个此类实施方案中，第一Fab分子特异性结合活化性T细胞抗原，特别是CD3，且第二和第三Fab分子特异性结合靶细胞抗原。在一个实施方案中，第三Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第一或第二亚基的N端。在一个具体的实施方案中，第二和第三Fab分子各自在Fab重链的C端融合至Fc域的亚基之一的N端，且第一Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端。在一个具体的此类实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本上由以下组成：第一，第二和第三Fab分子，由第一亚基和第二亚基构成的Fc域，和任选的一个或多个肽接头，其中第一Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端，且第二Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第一亚基的N端，且其中第三Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第二亚基的N端。此类构造示意性描绘于图1B和1E(特定的实施方案，其中第三Fab分子是常规Fab分子且优选与第一Fab分子相同)，和图1I和1M(备选的实施方案，其中第三Fab分子是交换Fab分子且优选与第二Fab分子相同)。第二和第三Fab分子可以直接或经由肽接头融合至Fc域。在一个具体的实施方案中，第二和第三Fab分子各自经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域。在一个特定的实施方案中，免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区，特别是Fc域是人IgG1Fc域的情况。任选地，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。在另一个实施方案中，第一和第三Fab分子各自在Fab重链的C端融合至Fc域的亚基之一的N端，且第二Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端。在一个具体的此类实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本上由以下组成：第一，第二和第三Fab分子，由第一亚基和第二亚基构成的Fc域，和任选的一个或多个肽接头，其中第二Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端，且第一Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第一亚基的N端，且其中第三Fab分子在Fab重链的C端融合至Fc域的第二亚基的N端。此类构造示意性描绘于图1C和1F(特定的实施方案，其中第三Fab分子是常规Fab分子且优选与第一Fab分子相同)和图1J和1N(备选的实施方案，其中第三Fab分子是交换Fab分子且优选与第二Fab分子相同)。第一和第三Fab分子可以直接或经由肽接头融合至Fc域。在一个特定的实施方案中，第一和第三Fab分子各自经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域。在一个具体的实施方案中，免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区，特别是Fc域是IgG1Fc域的情况。任选地，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链可以另外彼此融合。在其中一个Fab分子在Fab重链的C端经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域的每个亚基的N端的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的构造中，所述两个Fab分子，所述铰链区和所述Fc域基本上形成免疫球蛋白分子。在一个具体的实施方案中，免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更具体的实施方案中，免疫球蛋白是IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施方案中，免疫球蛋白是IgG4亚类免疫球蛋白。在又一个具体的实施方案中，免疫球蛋白是人免疫球蛋白。在其它实施方案中，免疫球蛋白是嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。在本发明的一些T细胞活化性双特异性抗原结合分子中，第一Fab分子的Fab轻链和第二Fab分子的Fab轻链彼此融合，任选地经由肽接头。根据第一和第二Fab分子的构造，第一Fab分子的Fab轻链可在其C端融合至第二Fab分子的Fab轻链的N端，或者第二Fab分子的Fab轻链可在其C端融合至第一Fab分子的Fab轻链的N端。第一和第二Fab分子的Fab轻链的融合进一步降低不匹配的Fab重链和轻链的错配，并且还降低表达本发明的一些T细胞活化性双特异性抗原结合分子需要的质粒数。在某些实施方案中，依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含其中的第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交换Fab重链，其中重链可变区用轻链可变区替换)，第二Fab分子的Fab重链恒定区继而与Fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))，和其中的第一Fab分子的Fab重链与Fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在一些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VH(2)-CL(2))和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。在某些实施方案中，所述多肽共价连接，例如通过二硫键。在一些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含其中的第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交换Fab重链，其中重链可变区用轻链可变区替换)，第二Fab分子的Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，第一Fab分子的Fab重链继而与Fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))。在其它实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含其中的第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，第二Fab分子的Fab轻链可变区继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交换Fab重链，其中重链可变区用轻链可变区替换)，第二Fab分子的Fab重链恒定区继而与Fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))。在这些中的一些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含第二Fab分子的交换Fab轻链多肽，其中第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键(VH(2)-CL(2))，和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。在这些中的其它实施方案中，在适当时，T细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含其中的第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键，第二Fab分子的Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab轻链多肽共享羧基末端肽键的多肽(VL(2)-CH1(2)-VL(1)-CL(1))，或其中的第一Fab分子的Fab轻链多肽与第二Fab分子的Fab重链可变区共享羧基末端肽键，第二Fab分子的Fab重链可变区继而与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VL(1)-CL(1)-VH(2)-CL(2))。依照这些实施方案的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以进一步包含(i)Fc域亚基多肽(CH2-CH3(-CH4))，或(ii)其中的第三Fab分子的Fab重链与Fc域亚基共享羧基末端肽键的多肽(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4))和第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。在某些实施方案中，所述多肽共价连接，例如通过二硫键。在一些实施方案中，第一Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端。在某些此类实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子不包含Fc域。在某些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本上由以下组成：第一和第二Fab分子，和任选的一个或多个肽接头，其中第一Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端。此类构造示意性描绘于图1O和1S。在其它实施方案中，第二Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端。在某些此类实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子不包含Fc域。在某些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本上由以下组成：第一和第二Fab分子，和任选的一个或多个肽接头，其中第二Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端。此类构造示意性描绘于图1P和1T。在一些实施方案中，第一Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端，且T细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含第三Fab分子，其中所述第三Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端。在特定的此类实施方案中，所述第三Fab分子是常规Fab分子。在其它此类实施方案中，所述第三Fab分子是本文所述交换Fab分子，即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL彼此交换/替换的Fab分子。在某些此类实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本上由以下组成：第一，第二和第三Fab分子，和任选的一个或多个肽接头，其中第一Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端，且第三Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端。此类构造示意性描绘于图1Q和1U(具体的实施方案，其中第三Fab分子是常规Fab分子且优选与第一Fab分子相同)。在一些实施方案中，第一Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端，且T细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含第三Fab分子，其中所述第三Fab分子在Fab重链的N端融合至第二Fab分子的Fab重链的C端。在特定的此类实施方案中，所述第三Fab分子是本文所述交换Fab分子，即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL彼此交换/替换的Fab分子。在其它此类实施方案中，所述第三Fab分子是常规Fab分子。在某些此类实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本上由以下组成：第一，第二和第三Fab分子，和任选的一个或多个肽接头，其中第一Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端，且第三Fab分子在Fab重链的N端融合至第二Fab分子的Fab重链的C端。此类构造示意性描绘于图1W和1Y(具体的实施方案，其中第三Fab分子是交换Fab分子且优选与第二Fab分子相同)。在一些实施方案中，第二Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端，且T细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含第三Fab分子，其中所述第三Fab分子在Fab重链的N端融合至第一Fab分子的Fab重链的C端。在特定的此类实施方案中，所述第三Fab分子是常规Fab分子。在其它此类实施方案中，所述第三Fab分子是本文所述交换Fab分子，即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL彼此交换/替换的Fab分子。在某些此类实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本上由以下组成：第一，第二和第三Fab分子，和任选的一个或多个肽接头，其中第二Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端，且第三Fab分子在Fab重链的N端融合至第一Fab分子的Fab重链的C端。此类构造示意性描绘于图1R和1V(具体的实施方案，其中第三Fab分子是常规Fab分子且优选与第一Fab分子相同)。在一些实施方案中，第二Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端，且T细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含第三Fab分子，其中所述第三Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端。在特定的此类实施方案中，所述第三Fab分子是本文所述交换Fab分子，即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL彼此交换/替换的Fab分子。在其它此类实施方案中，所述第三Fab分子是常规Fab分子。在某些此类实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子基本上由以下组成：第一，第二和第三Fab分子，和任选的一个或多个肽接头，其中第二Fab分子在Fab重链的C端融合至第一Fab分子的Fab重链的N端，且第三Fab分子在Fab重链的C端融合至第二Fab分子的Fab重链的N端。此类构造示意性描绘于图1X和1Z(具体的实施方案，其中第三Fab分子是交换Fab分子且优选与第一Fab分子相同)。在某些实施方案中，依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含其中的第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，第二Fab分子的Fab轻链可变区继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交换Fab重链，其中重链可变区用轻链可变区替换)的多肽(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))。在一些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含其中的第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VH(2)-CL(2))和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。在某些实施方案中，依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含其中的第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交换Fab重链，其中重链可变区用轻链可变区替换)，第二Fab分子的Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键的多肽(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含其中的第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VH(2)-CL(2))和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。在某些实施方案中，依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含其中的第三Fab分子的Fab重链与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，第一Fab分子的Fab重链继而与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，第二Fab分子的Fab轻链可变区继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交换Fab重链，其中重链可变区用轻链可变区替换)的多肽(VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))。在一些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含其中的第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VH(2)-CL(2))和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。在一些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。在某些实施方案中，依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含其中的第二Fab分子的Fab轻链可变区与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交换Fab重链，其中重链可变区用轻链可变区替换)，第二Fab分子的Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键，第一Fab分子的Fab重链继而与第三Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键的多肽(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3))。在一些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含其中的第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VH(2)-CL(2))和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。在一些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含第三Fab分子的Fab轻链多肽(VL(3)-CL(3))。在某些实施方案中，依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含其中的第一Fab分子的Fab重链与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，第二Fab分子的Fab轻链可变区继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交换Fab重链，其中重链可变区用轻链可变区替换)，第二Fab分子的Fab重链恒定区继而与第三Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，第三Fab分子的Fab轻链可变区继而与第三Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含交换Fab重链，其中重链可变区用轻链可变区替换)的多肽(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-VL(3)-CH1(3))。在一些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含其中的第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VH(2)-CL(2))和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。在一些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含其中的第三Fab分子的Fab重链可变区与第三Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VH(3)-CL(3))。在某些实施方案中，依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含其中的第三Fab分子的Fab轻链可变区与第三Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第三Fab分子包含交换Fab重链，其中重链可变区用轻链可变区替换)，第三Fab分子的Fab重链恒定区继而与第二Fab分子的Fab轻链可变区共享羧基末端肽键，第二Fab分子的Fab轻链可变区继而与第二Fab分子的Fab重链恒定区共享羧基末端肽键(即第二Fab分子包含交换Fab重链，其中重链可变区用轻链可变区替换)，第二Fab分子的Fab重链恒定区继而与第一Fab分子的Fab重链共享羧基末端肽键的多肽(VL(3)-CH1(3)-VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))。在一些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含其中的第二Fab分子的Fab重链可变区与第二Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VH(2)-CL(2))和第一Fab分子的Fab轻链多肽(VL(1)-CL(1))。在一些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子进一步包含其中的第三Fab分子的Fab重链可变区与第三Fab分子的Fab轻链恒定区共享羧基末端肽键的多肽(VH(3)-CL(3))。依照任何上述实施方案，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的各组分(例如Fab分子，Fc域)可直接地或经由本文中描述或本领域已知的各种接头(特别是包含一个或多个氨基酸，通常约2-20个氨基酸的肽接头)融合。合适的，非免疫原性的肽接头包括例如(G4S)n，(SG4)n，(G4S)n或G4(SG4)n肽接头，其中n一般是1至10，通常是2至4的整数。Fc域T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc域由一对包含免疫球蛋白分子重链域的多肽链组成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc域是二聚体，其每个亚基包含CH2和CH3IgG重链恒定域。Fc域的两个亚基能够彼此稳定联合。在一个实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含不超过一个Fc域。在依照本发明的一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc域是IgGFc域。在一个具体的实施方案中，Fc域是IgG1Fc域。在另一个实施方案中，Fc域是IgG4Fc域。在一个更加具体的实施方案中，Fc域是包含位置S228(Kabat编号方式)处的氨基酸替代，特别是氨基酸替代S228P的IgG4Fc域。此氨基酸替代降低IgG4抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等,DrugMetabolismandDisposition38,84-91(2010))。在又一个具体的实施方案中，Fc域是人的。人IgG1Fc区的一种例示性序列在SEQIDNO:13中给出。促进异二聚化的Fc域修饰依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含不同的Fab分子，其融合至Fc域的两个亚基之一个或另一个，如此Fc域的两个亚基通常包含在两条不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后二聚化导致两种多肽的数种可能组合。为了改进重组生产中T细胞活化性双特异性抗原结合分子的产量和纯度，如此在T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc域中引入促进期望多肽联合的修饰会是有利的。因而，在具体的实施方案中，依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc域包含促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰。人IgGFc域的两个亚基之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点在Fc域的CH3域中。如此，在一个实施方案中，所述修饰在Fc域的CH3域中。有数种办法来修饰Fc域的CH3域以加强异二聚化，它们详细记载于例如WO96/27011，WO98/050431，EP1870459，WO2007/110205，WO2007/147901，WO2009/089004，WO2010/129304，WO2011/90754，WO2011/143545，WO2012058768，WO2013157954，WO2013096291。典型地，在所有此类办法中，Fc域的第一亚基的CH3域和Fc域的第二亚基的CH3域二者以互补方式进行工程化改造使得每个CH3域(或包含它的重链)不再能与其自身同二聚化但被迫与互补工程化改造的其它CH3域异二聚化(使得第一和第二CH3域异二聚化且两个第一CH3域或两个第二CH3域之间不形成同二聚体)。涵盖这些用于改善重链异二聚化的不同办法作为不同备选，与依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子中的减少轻链错配和BenceJones型副产物的重-轻链修饰(一个结合臂中的VH和VL交换/替换及在CH1/CL界面中引入具有相反电荷的带电荷的氨基酸的替代)组合。在一个特定的实施方案中，所述促进Fc域的第一亚基和第二亚基联合的修饰是所谓的“节-入-穴”修饰，其包含在Fc域的两个亚基之一中的“节”修饰和在Fc域的两个亚基之另一中的“穴”修饰。节-入-穴技术记载于例如US5,731,168；US7,695,936；Ridgway等,ProtEng9,617-621(1996)和Carter,JImmunolMeth248,7-15(2001)。一般地，该方法牵涉在第一多肽的界面处引入隆起(“节”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“穴”)，使得隆起可以置于空腔中从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽界面的小氨基酸侧链用更大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建隆起。在第二多肽的界面中创建具有与隆起相同或相似大小的互补性空腔，其通过将大氨基酸侧链用更小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换进行。因而，在一个具体的实施方案中，在T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc域的第一亚基的CH3域中，一个氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第一亚基的CH3域内生成隆起，其可安置于第二亚基的CH3域内的空腔中，而且在Fc域的第二亚基的CH3域中，一个氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二亚基的CH3域内生成空腔，其中可安置第一亚基的CH3域内的隆起。优选地，所述具有更大侧链体积的氨基酸残基选自下组：精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，和色氨酸(W)。优选地，所述具有更小侧链体积的氨基酸残基选自下组：丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，和缬氨酸(V)。可以通过改变编码多肽的核酸，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成来生成隆起和空腔。在一个特定的实施方案中，在Fc域第一亚基的CH3域(“节”亚基)中，第366位的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(T366W)，而在Fc域第二亚基的CH3域(“穴”亚基)中，第407位的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(Y407V)。在一个实施方案中，在Fc域第二亚基中，另外，第366位的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(T366S)且第368位的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L368A)(编号方式依照KabatEU索引)。在还有又一个实施方案中，在Fc域的第一亚基中，另外，第354位的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换(S354C)或第356位的谷氨酸残基用半胱氨酸残基替换(E356C)，而在Fc域的第二亚基中，另外，第349位的酪氨酸残基用半胱氨酸残基替换(Y349C)(编号方式依照KabatEU索引)。这两个半胱氨酸残基的引入导致在Fc域的两个亚基之间形成二硫桥，进一步稳定了二聚体(Carter,JImmunolMethods248,7-15(2001))。在一个具体的实施方案中，Fc域的第一亚基包含氨基酸替代S354C和T366W，且Fc域的第二亚基包含氨基酸替代Y349C，T366S，L368A和Y407V(编号方式依照KabatEU索引)。在一个具体的实施方案中，将特异性结合活化性T细胞抗原的Fab分子融合(任选地经由特异性结合靶细胞抗原的Fab分子)至Fc域的第一亚基(其包含“节”修饰)。不希望受理论束缚，特异性结合活化性T细胞抗原的Fab分子与Fc域的含节的亚基的融合会(进一步)使包含两个结合活化性T细胞抗原的Fab分子的抗原结合分子的生成最小化(两条含节的多肽的空间碰撞)。涵盖修饰CH3以增强异二聚化的其它技术作为依照本发明的备选，它们记载于例如WO96/27011，WO98/050431，EP1870459，WO2007/110205，WO2007/147901，WO2009/089004，WO2010/129304，WO2011/90754，WO2011/143545，WO2012/058768，WO2013/157954，WO2013/096291。在一个实施方案中，备选地使用EP1870459A1中记载的异二聚化办法。这种办法基于在Fc域的两个亚基之间的CH3/CH3域界面中的特定氨基酸位置引入具有相反电荷的带电荷的氨基酸。本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个优选的实施方案是(Fc域的)两个CH3域之一中的氨基酸突变R409D；K370E和Fc域的CH3域之另一中的氨基酸突变D399K；E357K(编号方式依照KabatEU索引)。在另一个实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变T366W和Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变T366S，L368A，Y407V，和另外的Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变R409D；K370E和Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变D399K；E357K(编号方式依照KabatEU索引)。在另一个实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变S354C，T366W和Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变Y349C，T366S，L368A，Y407V，或所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变Y349C，T366W和Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变354C，T366S，L368A，Y407V和另外的Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变R409D；K370E和Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变D399K；E357K(所有编号方式依照KabatEU索引)。在一个实施方案中，备选地使用WO2013/157953中记载的异二聚化办法。在一个实施方案中，第一CH3域包含氨基酸突变T366K且第二CH3域包含氨基酸突变L351D(编号方式依照KabatEU索引)。在又一个实施方案中，第一CH3域进一步包含氨基酸突变L351K。在又一个实施方案中，第二CH3域进一步包含选自Y349E，Y349D和L368E的氨基酸突变(优选L368E)(编号方式依照KabatEU索引)。在一个实施方案中，备选地使用WO2012/058768中记载的异二聚化办法。在一个实施方案中，第一CH3域包含氨基酸突变L351Y，Y407A且第二CH3域包含氨基酸突变T366A，K409F。在又一个实施方案中，第二CH3域进一步包含位置T411，D399，S400，F405，N390，或K392处的氨基酸突变，例如选自a)T411N，T411R，T411Q，T411K，T411D，T411E或T411W，b)D399R，D399W，D399Y或D399K，c)S400E，S400D，S400R，或S400K，d)F405I，F405M，F405T，F405S，F405V或F405W，e)N390R，N390K或N390D，f)K392V，K392M，K392R，K392L，K392F或K392E(编号方式依照KabatEU索引)。在又一个实施方案中，第一CH3域包含氨基酸突变L351Y，Y407A且第二CH3域包含氨基酸突变T366V，K409F。在又一个实施方案中，第一CH3域包含氨基酸突变Y407A且第二CH3域包含氨基酸突变T366A，K409F。在又一个实施方案中，第二CH3域进一步包含氨基酸突变K392E，T411E，D399R和S400R(编号方式依照KabatEU索引)。在一个实施方案中，备选地使用WO2011/143545中记载的异二聚化办法，例如进行选自下组的位置处的氨基酸修饰：368和409(编号方式依照KabatEU索引)。在一个实施方案中，备选地使用WO2011/090762中记载的异二聚化办法，它也使用上文所述节-入-穴技术。在一个实施方案中，第一CH3域包含氨基酸突变T366W且第二CH3域包含氨基酸突变Y407A。在一个实施方案中，第一CH3域包含氨基酸突变T366Y且第二CH3域包含氨基酸突变Y407T(编号方式依照KabatEU索引)。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子或它的Fc域是IgG2亚类的且备选地使用WO2010/129304记载的异二聚化办法。在一个备选的实施方案中，促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰包含介导静电操纵效应(electrostaticsteeringeffect)的修饰，例如如记载于PCT公开文本WO2009/089004的。一般地，此方法涉及将在两个Fc域亚基界面处的一个或多个氨基酸残基替换为带电荷的氨基酸残基，从而在静电上不利于同二聚体形成而在静电上有利于异二聚化。在一个此类实施方案中，第一CH3域包含带负电荷的氨基酸(例如谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D))对K392或N392的氨基酸替代(优选K392D或N392D)且第二CH3域包含带正电荷的氨基酸(例如赖氨酸(K)或精氨酸(R))对D399，E356，D356，或E357的氨基酸替代(优选D399K，E356K，D356K，或E357K，更优选D399K和E356K)。在又一个实施方案中，第一CH3域进一步包含带负电荷的氨基酸(例如谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D))对K409或R409的氨基酸替代，优选K409D或R409D。在又一个实施方案中，第一CH3域进一步或二选一地包含带负电荷的氨基酸(例如谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D))对K439和/或K370的氨基酸替代(所有编号方式依照KabatEU索引)。在还有又一个实施方案中，备选地使用WO2007/147901中记载的异二聚化办法。在一个实施方案中，第一CH3域包含氨基酸突变K253E，D282K，和K322D且第二CH3域包含氨基酸突变D239K，E240K，和K292D(编号方式依照KabatEU索引)。在仍有另一个实施方案中，可以备选地使用WO2007/110205中记载的异二聚化办法。在一个实施方案中，Fc域的第一亚基包含氨基酸替代K392D和K409D，且Fc域的第二亚基包含氨基酸替代D356K和D399K(编号方式依照KabatEU索引)。降低Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域修饰Fc域赋予T细胞活化性双特异性抗原结合分子以有利的药动学特性，包括长血清半衰期，其有助于在靶组织中的较好积累和有利的组织-血液分配比。然而，同时它可能导致不想要的T细胞活化性双特异性抗原结合分子对表达Fc受体的细胞而非优选的携带抗原的细胞的靶向。此外，Fc受体信号传导途径的共激活可能导致细胞因子释放，其与抗原结合分子的T细胞活化特性和长半衰期组合，在系统性施用后引起细胞因子受体的过度活化和严重的副作用。(携带Fc受体的)免疫细胞而非T细胞的活化甚至可能降低T细胞活化性双特异性抗原结合分子的功效，原因是例如通过NK细胞对T细胞的潜在破坏。因而，在具体的实施方案中，依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc域展现出与天然IgG1Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个此类实施方案中，Fc域(或包含所述Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)展现出与天然IgG1Fc域(或包含天然IgG1Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)相比少于50％，优选少于20％，更优选少于10％且最优选少于5％的对Fc受体的结合亲和力，和/或与天然IgG1Fc域(或包含天然IgG1Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)相比少于50％，优选少于20％，更优选少于10％且最优选少于5％的效应器功能。在一个实施方案中，Fc域(或包含所述Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)没有实质性结合Fc受体和/或诱导效应器功能。在一个具体的实施方案中，所述Fc受体是Fcγ受体。在一个实施方案中，所述Fc受体是人Fc受体。在一个实施方案中，所述Fc受体是活化性Fc受体。在一个特定的实施方案中，所述Fc受体是活化性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIa，FcγRI或FcγRIIa，最具体地是人FcγRIIIa。在一个实施方案中，效应器功能是选自下组的一项或多项：CDC，ADCC，ADCP，和细胞因子分泌。在一个具体的实施方案中，所述效应器功能是ADCC。在一个实施方案中，所述Fc域展现出与天然IgG1Fc域相比基本相似的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力。当Fc域(或包含所述Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)展现出超过约70％，特别是超过约80％，更特别是超过约90％的天然IgG1Fc域(或包含天然IgG1Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力时，实现基本相似的对FcRn的结合。在某些实施方案中，Fc域工程化改造为具有与非工程化Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在具体的实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc域包含一处或多处降低Fc域对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变。通常，Fc域的两个亚基的每一个中存在相同的一处或多处氨基酸突变。在一个实施方案中，所述氨基酸突变降低Fc域对Fc受体的结合亲和力。在一个实施方案中，所述氨基酸突变将Fc域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍，至少5倍，或至少10倍。在有超过一处降低Fc域对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施方案中，这些氨基酸突变的组合可以将Fc域对Fc受体的结合亲和力降低至少10倍，至少20倍，或甚至至少50倍。在一个实施方案中，包含工程化Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子展现出与包含非工程化Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子相比少于20％，特别是少于10％，更特别是少于5％的对Fc受体的结合亲和力。在一个具体的实施方案中，Fc受体是Fcγ受体。在一些实施方案中，所述Fc受体是人Fc受体。在一些实施方案中，Fc受体是活化性Fc受体。在一个特定的实施方案中，Fc受体是活化性人Fcγ受体，更特别是人FcγRIIIa，FcγRI或FcγRIIa，最特别是人FcγRIIIa。优选地，对这些受体的每一种的结合是降低的。在一些实施方案中，对补体成分的结合亲和力，特别是对C1q的结合亲和力也是降低的。在一个实施方案中，对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力没有降低。当Fc域(或包含所述Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)展现出非工程化形式的Fc域(或包含所述非工程化形式的Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力的超过约70％时，实现基本相似的对FcRn的结合，即保留该Fc域对所述受体的结合亲和力。Fc域或包含所述Fc域的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以展现出超过约80％和甚至超过约90％的此类亲和力。在某些实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc域工程化改造为具有与非工程化Fc域相比降低的效应器功能。所述降低的效应器功能可包括但不限于下列一项或多项：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)，降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，降低的细胞因子分泌，降低的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取，降低的对NK细胞的结合，降低的对巨噬细胞的结合，降低的对单核细胞的结合，降低的对多形核细胞的结合，降低的诱导凋亡的直接信号传导，降低的靶物结合的抗体的交联，降低的树突细胞成熟，或降低的T细胞引发。在一个实施方案中，所述降低的效应器功能是选自下组的一项或多项：降低的CDC，降低的ADCC，降低的ADCP，和降低的细胞因子分泌。在一个具体的实施方案中，所述降低的效应器功能是降低的ADCC。在一个实施方案中，所述降低的ADCC小于20％的由非工程化Fc域(或包含非工程化Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)诱导的ADCC。在一个实施方案中，所述降低Fc域对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变是氨基酸替代。在一个实施方案中，Fc域包含在选自下组的位置处的氨基酸替代：E233，L234，L235，N297，P331和P329(编号方式依照KabatEU索引)。在一个更特定的实施方案中，Fc域包含在选自下组的位置处的氨基酸替代：L234，L235和P329(编号方式依照KabatEU索引)。在一些实施方案中，Fc域包含氨基酸替代L234A和L235A(编号方式依照KabatEU索引)。在一个此类实施方案中，Fc域是IgG1Fc域，特别是人IgG1Fc域。在一个实施方案中，Fc域包含在位置P329处的氨基酸替代。在一个更加特定的实施方案中，氨基酸替代是P329A或P329G，特别是P329G(编号方式依照KabatEU索引)。在一个实施方案中，Fc域包含在位置P329处的氨基酸替代和又一处在选自以下位置处的氨基酸替代：E233，L234，L235，N297和P331(编号方式依照KabatEU索引)。在一个更加特定的实施方案中，所述又一处氨基酸替代是E233P，L234A，L235A，L235E，N297A，N297D或P331S。在具体的实施方案中，所述Fc域包含在位置P329，L234和L235处的氨基酸替代(编号方式依照KabatEU索引)。在更具体的实施方案中，所述Fc域包含氨基酸突变L234A，L235A和P329G(“P329GLALA”)。在一个此类实施方案中，Fc域是IgG1Fc域，特别是人IgG1Fc域。氨基酸替代组合“P329GLALA”几乎完全消除了人IgG1Fc域的Fcγ受体(以及补体)结合，如记载于PCT公开文本no.WO2012/130831，其通过提述完整并入本文。WO2012/130831还描述了制备此类突变体Fc域的方法和用于测定其特性(诸如Fc受体结合或效应器功能)的方法。IgG4抗体展现出与IgG1抗体相比降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应器功能。因此，在一些实施方案中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的Fc域是IgG4Fc域，特别是人IgG4Fc域。在一个实施方案中，所述IgG4Fc域包含在位置S228处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代S228P(编号方式依照KabatEU索引)。为了进一步降低其对Fc受体的结合亲和力和/或其效应器功能，在一个实施方案中，所述IgG4Fc域包含在位置L235处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代L235E(编号方式依照KabatEU索引)。在另一个实施方案中，所述IgG4Fc域包含在位置P329处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代P329G(编号方式依照KabatEU索引)。在一个具体的实施方案中，所述IgG4Fc域包含在位置S228，L235和P329处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代S228P，L235E和P329G(编号方式依照KabatEU索引)。此类IgG4Fc域突变体及其Fcγ受体结合特性记载于PCT公开文本No.WO2012/130831，其通过提述完整并入本文。在一个具体的实施方案中，展现出与天然IgG1Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能的Fc域是包含氨基酸替代L234A，L235A和任选地P329G的人IgG1Fc域，或包含氨基酸替代S228P，L235E和任选地P329G的人IgG4Fc域(编号方式依照KabatEU索引)。在某些实施方案中，已消除Fc域的N-糖基化。在一个此类实施方案中，所述Fc域包含在位置N297处的氨基酸突变，特别是用丙氨酸(N297A)或天冬氨酸(N297D)替换天冬酰胺的氨基酸替代(编号方式依照KabatEU索引)。在上文和PCT公开文本no.WO2012/130831中描述的Fc域以外，具有降低的Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域还包括那些具有Fc域残基238，265，269，270，297，327和329中一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)(编号方式依照KabatEU索引)。此类Fc突变体包括具有在氨基酸位置265，269，270，297和327的两个或更多个处的替代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其具有残基265和297到丙氨酸的替代(美国专利No.7,332,581)。可以使用本领域中公知的遗传或化学方法通过氨基酸删除，替代，插入或修饰来制备突变体Fc域。遗传方法可以包括编码DNA序列的位点特异性诱变，PCR，基因合成等。正确的核苷酸变化可以通过例如测序来验证。可以容易地测定对Fc受体的结合，例如通过ELISA或通过使用标准仪器诸如BIAcore仪(GEHealthcare)的表面等离振子共振(SPR)进行，并且Fc受体诸如可通过重组表达获得。本文中描述了一种合适的此类结合测定法。或者，可使用已知表达特定Fc受体的细胞系，如表达FcγIIIa受体的人NK细胞来估测Fc域或包含Fc域的细胞活化性双特异性抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力。可通过本领域中已知的方法来测量Fc域或包含Fc域的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的效应器功能。本文中描述了用于测量ADCC的一种合适的测定法。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的其它例子记载于美国专利No.5,500,362；Hellstrom等，ProcNatlAcadSciUSA83,7059-7063(1986)和Hellstrom等,ProcNatlAcadSciUSA82,1499-1502(1985)；美国专利No.5,821,337；Bruggemann等,JExpMed166,1351-1361(1987)。或者，可采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.MountainView,CA)；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clynes等,ProcNatlAcadSciUSA95,652-656(1998)的。在一些实施方案中，Fc域对补体成分(特别是对C1q)的结合是降低的。因而，在其中Fc域工程化为具有降低的效应器功能的一些实施方案中，所述降低的效应器功能包括降低的CDC。可实施C1q结合测定法来测定T细胞活化性双特异性抗原结合分子是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可实施CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro等,JImmunolMethods202,163(1996)；Cragg等,Blood101,1045-1052(2003)；以及Cragg和Glennie,Blood103,2738-2743(2004))。抗原结合模块本发明的抗原结合分子是双特异性的，即它包含至少两种能够特异性结合两种不同抗原性决定簇的抗原结合模块。依照本发明，所述抗原结合模块是Fab分子(即由各自包含可变域和恒定域的重链和轻链构成的抗原结合域)。在一个实施方案中，所述Fab分子是人的。在另一个实施方案中，所述Fab分子是人源化的。在再一个实施方案中，所述Fab分子包含人重链和轻链恒定域。抗原结合模块中至少一个是交换Fab分子。此类修饰减少来自不同Fab分子的重链和轻链的错误配对，由此改进了重组生产中本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的产量和纯度。在可用于本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一种具体的交换Fab分子中，Fab轻链和Fab重链的可变域(分别是VL和VH)是交换的。然而，甚至在有这种域交换的情况下，由于错配的重和轻链之间所谓的BenceJones型相互作用，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的制备物仍然可能包含某些副产物(参见Schaeferetal,PNAS,108(2011)11187-11191)。为了进一步减少来自不同Fab分子的重和轻链的错配及如此提高想要的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的纯度和产量，依照本发明，在特异性结合靶细胞抗原的Fab分子或特异性结合活化性T细胞抗原的Fab分子任一的CH1和CL域中的特定氨基酸位置引入具有相反电荷的带电荷的氨基酸。在T细胞活化性双特异性抗原结合分子中包含的常规Fab分子中(诸如例如图1A-C，G-J中所示)或在T细胞活化性双特异性抗原结合分子中包含的交换Fab分子中(诸如例如图1D-F，K-N中所示)(但不限于此二者)进行电荷修饰。在具体的实施方案中，在T细胞活化性双特异性抗原结合分子中包含的常规Fab分子(它在具体的实施方案中特异性结合靶细胞抗原)中进行电荷修饰。在依照本发明的一个具体的实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子能够同时结合靶细胞抗原(特别是肿瘤细胞抗原)和活化性T细胞抗原，特别是CD3。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子能够通过同时结合靶细胞抗原和活化性T细胞抗原来交联T细胞和靶细胞。在一个甚至更具体的实施方案中，此类同时结合导致靶细胞(特别是肿瘤细胞)的裂解。在一个实施方案中，此类同时结合导致T细胞的活化。在其它实施方案中，此类同时结合导致T淋巴细胞(特别是细胞毒性T淋巴细胞)的细胞应答，其选自下组：增殖，分化，细胞因子分泌，细胞毒性效应分子释放，细胞毒性活性，和活化标志物的表达。在一个实施方案中，在没有同时结合靶细胞抗原的情况下T细胞活化性双特异性抗原结合分子对活化性T细胞抗原，特别是CD3的结合不导致T细胞活化。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子能够将T细胞的细胞毒性活性重定向于靶细胞。在一个具体的实施方案中，所述重定向不依赖于靶细胞的MHC介导的肽抗原呈递和/或T细胞的特异性。具体地，依照本发明任何实施方案的T细胞是细胞毒性T细胞。在一些实施方案中，所述T细胞是CD4+或CD8+T细胞，特别是CD8+T细胞。活化性T细胞抗原结合Fab分子本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个特异性结合活化性T细胞抗原的Fab分子(本文中也称作“活化性T细胞抗原结合Fab分子”)。在一个具体的实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含不超过一个能够特异性结合活化性T细胞抗原的Fab分子(或其它Fab分子)。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子提供对活化性T细胞抗原的单价结合。在具体的实施方案中，特异性结合活化性T细胞抗原的Fab分子是本文所述交换Fab分子，即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL彼此交换/替换的Fab分子。在此类实施方案中，特异性结合靶细胞抗原的Fab分子是常规Fab分子。在T细胞活化性双特异性抗原结合分子中包含超过一个特异性结合靶细胞抗原的Fab分子的实施方案中，特异性结合活化性T细胞抗原的Fab分子优选是交换Fab分子且特异性结合靶细胞抗原的Fab分子是常规Fab分子。在备选实施方案中，特异性结合活化性T细胞抗原的Fab分子是常规Fab分子。在此类实施方案中，特异性结合靶细胞抗原的Fab分子是本文所述交换Fab分子，即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL彼此交换/替换的Fab分子。在一个具体的实施方案中，所述活化性T细胞抗原是CD3，特别是人CD3(SEQIDNO:1)或食蟹猴CD3(SEQIDNO:2)，最特别是人CD3。在一个具体的实施方案中，活化性T细胞抗原结合Fab分子对于人和食蟹猴CD3是交叉反应性的(即特异性结合)。在一些实施方案中，所述活化性T细胞抗原是CD3的ε亚基(CD3ε)。在一些实施方案中，活化性T细胞抗原结合Fab分子特异性结合CD3，特别是CD3ε，且包含至少一个选自下组的重链互补决定区(CDR)：SEQIDNO：4，SEQIDNO：5和SEQIDNO：6和至少一个选自下组的轻链CDR：SEQIDNO：8，SEQIDNO：9，SEQIDNO：10。在一个实施方案中，所述CD3结合Fab分子包含包含SEQIDNO：4的重链CDR1，SEQIDNO：5的重链CDR2，SEQIDNO：6的重链CDR3的重链可变区，和包含SEQIDNO：8的轻链CDR1，SEQIDNO：9的轻链CDR2，和SEQIDNO：10的轻链CDR3的轻链可变区。在另一个实施方案中，所述CD3结合Fab分子包含包含SEQIDNO：4的重链CDR1，SEQIDNO：67的重链CDR2，SEQIDNO：6的重链CDR3的重链可变区，和包含SEQIDNO：68的轻链CDR1，SEQIDNO：9的轻链CDR2，和SEQIDNO：10的轻链CDR3的轻链可变区。在一个实施方案中，所述CD3结合Fab分子包含与SEQIDNO：3至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的重链可变区序列和与SEQIDNO：7至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的轻链可变区序列。在一个实施方案中，所述CD3结合Fab分子包含包含SEQIDNO：3的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO：7的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，所述CD3结合Fab分子包含SEQIDNO：3的重链可变区序列和SEQIDNO：7的轻链可变区序列。靶细胞抗原结合Fab分子本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含至少一个特异性结合靶细胞抗原的Fab分子(本文中也称作“靶细胞抗原结合Fab分子”)。在某些实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含两个特异性结合靶细胞抗原的Fab分子。在一个具体的此类实施方案中，这些Fab分子中的每一个特异性结合相同抗原性决定簇。在一个甚至更加具体的实施方案中，这些Fab分子都是相同的，即它们包含相同的氨基酸序列，包括相同的本文所述CH1和CL域中的氨基酸替代(如果有的话)。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含特异性结合靶细胞抗原的免疫球蛋白分子。在一个实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含不超过两个特异性结合靶细胞抗原的Fab分子。在具体的实施方案中，特异性结合靶细胞抗原的Fab分子是常规Fab分子。在此类实施方案中，特异性结合活化性T细胞抗原的Fab分子是本文所述交换Fab分子，即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL彼此交换/替换的Fab分子。在备选实施方案中，特异性结合靶细胞抗原的Fab分子是本文所述交换Fab分子，即其中Fab重和轻链的可变域VH和VL彼此交换/替换的Fab分子。在此类实施方案中，特异性结合活化性T细胞抗原的Fab分子是常规Fab分子。所述靶细胞抗原结合Fab分子结合特定抗原性决定簇且能够将T细胞活化性双特异性抗原结合分子引导至靶部位(例如携带抗原性决定簇的特定类型肿瘤细胞)。在某些实施方案中，所述靶细胞抗原结合Fab分子特异性结合细胞表面抗原。在某些实施方案中，所述靶细胞抗原结合Fab分子针对与病理学状况有关的抗原，诸如肿瘤细胞或病毒感染细胞上呈现的抗原。合适的靶细胞抗原是细胞表面抗原，例如但不限于细胞表面受体。在具体的实施方案中，所述靶细胞抗原是人抗原。例示性的靶细胞抗原包括CD20，Her2，Her3，MCSP(黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖，也称作硫酸软骨素蛋白聚糖4)，或BCMA(人B细胞成熟靶，也称作肿瘤坏死因子受体超家族成员17(UniProtQ02223))。在具体的实施方案中，所述靶细胞抗原是CD20，特别是人CD20。在一个实施方案中，所述靶细胞抗原是CD20且特异性结合所述靶细胞抗原的Fab分子包含包含SEQIDNO：46的重链互补决定区(CDR)1，SEQIDNO：47的重链CDR2，和SEQIDNO：48的重链CDR3的重链可变区，和包含SEQIDNO：49的轻链CDR1，SEQIDNO：50的轻链CDR2和SEQIDNO：51的轻链CDR3的轻链可变区。在又一个实施方案中，所述靶细胞抗原是CD20且特异性结合所述靶细胞抗原的Fab分子包含与SEQIDNO：30的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的重链可变区，和与SEQIDNO：31的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的轻链可变区。在仍有又一个实施方案中，所述靶细胞抗原是CD20且特异性结合所述靶细胞抗原的Fab分子包含SEQIDNO：30的重链可变区序列，和SEQIDNO：31的轻链可变区序列。在一个具体的实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含与SEQIDNO：18的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的多肽，与SEQIDNO：19的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的多肽，与SEQIDNO：20的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的多肽，和与SEQIDNO：21的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的多肽。在又一个具体的实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO：18的多肽序列，SEQIDNO：19的多肽序列，SEQIDNO：20的多肽序列和SEQIDNO：21的多肽序列。在另一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含与SEQIDNO：32的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的多肽，与SEQIDNO：19的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的多肽，与SEQIDNO：20的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的多肽，和与SEQIDNO：21的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的多肽。在又一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO：32的多肽序列，SEQIDNO：19的多肽序列，SEQIDNO：20的多肽序列和SEQIDNO：21的多肽序列。在仍有另一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含与SEQIDNO：36的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的多肽，与SEQIDNO：37的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的多肽，与SEQIDNO：38的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的多肽，和与SEQIDNO：39的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的多肽。在又一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO：36的多肽序列，SEQIDNO：37的多肽序列，SEQIDNO：38的多肽序列和SEQIDNO：39的多肽序列。在又一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含与SEQIDNO：40的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的多肽，与SEQIDNO：41的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的多肽，与SEQIDNO：20的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的多肽，和与SEQIDNO：21的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的多肽。在又一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO：40的多肽序列，SEQIDNO：41的多肽序列，SEQIDNO：20的多肽序列和SEQIDNO：21的多肽序列。在其它实施方案中，所述靶抗原是Her2，特别是人Her2。在一个实施方案中，所述靶细胞抗原是Her2且特异性结合所述靶细胞抗原的Fab分子包含与SEQIDNO：61的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的重链可变区，和与SEQIDNO：62的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的轻链可变区，在又一个实施方案中，所述靶细胞抗原是Her2且特异性结合所述靶细胞抗原的Fab分子包含SEQIDNO：61的重链可变区序列，和SEQIDNO：62的轻链可变区序列。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含与SEQIDNO：21的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的多肽，与SEQIDNO：52的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的多肽，与SEQIDNO：53的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的多肽，和与SEQIDNO：54的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的多肽。在又一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO：21的多肽序列，SEQIDNO：52的多肽序列，SEQIDNO：53的多肽序列和SEQIDNO：54的多肽序列。在其它实施方案中，所述靶抗原是Her3，特别是人Her3。在一个实施方案中，所述靶细胞抗原是Her3且特异性结合所述靶细胞抗原的Fab分子包含与SEQIDNO：63的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的重链可变区，和与SEQIDNO：64的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的轻链可变区，在又一个实施方案中，所述靶细胞抗原是Her3且特异性结合所述靶细胞抗原的Fab分子包含SEQIDNO：63的重链可变区序列，和SEQIDNO：64的轻链可变区序列。在一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含与SEQIDNO：21的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的多肽，与SEQIDNO：55的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的多肽，与SEQIDNO：56的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的多肽，和与SEQIDNO：57的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的多肽。在又一个实施方案中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子包含SEQIDNO：21的多肽序列，SEQIDNO：55的多肽序列，SEQIDNO：56的多肽序列和SEQIDNO：57的多肽序列。在其它实施方案中，所述靶抗原是黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，特别是人MCSP。在一个实施方案中，所述靶细胞抗原是MCSP且特异性结合所述靶细胞抗原的Fab分子包含与SEQIDNO：65的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的重链可变区，和与SEQIDNO：66的序列至少95％，96％，97％，98％，或99％相同的轻链可变区，在又一个实施方案中，所述靶抗原是Her2且特异性结合所述靶细胞抗原的Fab分子包含SEQIDNO：65的重链可变区序列，和SEQIDNO：66的轻链可变区序列。在一些实施方案中，所述靶抗原是BCMA。在其它实施方案中，所述靶细胞抗原不是BCMA。多核苷酸本发明还提供分离的多核苷酸，其编码如本文中描述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段。在一些实施方案中，所述片段是抗原结合片段。可以将编码本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的多核苷酸以编码完整T细胞活化性双特异性抗原结合分子的单一多核苷酸表达，或以共表达的多种(例如两种或更多种)多核苷酸表达。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其它手段联合以形成功能性T细胞活化性双特异性抗原结合分子。例如，Fab分子的轻链部分可以与T细胞活化性双特异性抗原结合分子中包含Fab分子重链部分，Fc域亚基和任选地(部分的)另一个Fab分子的部分由分开的多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽会与轻链多肽联合以形成Fab分子。在另一个例子中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子中包含两个Fc域亚基之一和任选地(部分的)一个或多个Fab分子的部分可以与T细胞活化性双特异性抗原结合分子中包含两个Fc域亚基中另一个和任选地(部分的)Fab分子的部分由分开的多核苷酸编码。当共表达时，Fc域亚基会联合以形成Fc域。在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸编码整个依照本文所述发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在其它实施方案中，所述分离的多核苷酸编码依照本文所述发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子中包含的多肽。在某些实施方案中，所述多核苷酸或核酸是DNA。在其它实施方案中，本发明的多核苷酸是RNA，例如以信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。重组方法可以获得本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，例如通过固相肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生成进行。对于重组生成，分离一种或多种编码所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子(片段)的多核苷酸(例如如上文描述的)，并将其插入一种或多种载体中用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规规程容易分离并测序此类多核苷酸。在一个实施方案中，提供包含一种或多种本发明的多核苷酸的载体(优选为表达载体)。可以使用本领域技术人员公知的方法来构建含有T细胞活化性双特异性抗原结合分子(片段)的编码序列以及适宜的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如记载于Maniatis等,MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,ColdSpringHarborLaboratory,N.Y.(1989)；和Ausubel等,CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,GreenePublishingAssociatesandWileyInterscience,N.Y(1989)的技术。表达载体可以是质粒，病毒的一部分或可以是核酸片段。表达载体包含表达盒，其中在与启动子和/或其它转录或翻译控制元件的可操作联合中克隆编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子(片段)的多核苷酸(即编码区)。如本文中使用的，“编码区”是核酸中由翻译成氨基酸的密码子组成的一部分。尽管“终止密码子”(TAG，TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但可将其视为编码区的一部分(若存在的话)，但任何侧翼序列例如启动子，核糖体结合位点，转录终止子，内含子，5’和3’非翻译区等，不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可以存在于单一多核苷酸构建体中(例如单一载体上)，或存在于分开的多核苷酸构建体中，例如在分开的(不同的)载体上。此外，任何载体可含有单个编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽，其经由蛋白水解切割在翻译后或共翻译分开成最终蛋白质。另外，本发明的载体，多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，其与编码本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子(片段)或其变体或衍生物的多核苷酸融合或未融合。异源编码区包括但不限于特殊化的元件或基序，如分泌信号肽或异源功能域。当基因产物例如多肽的编码区与一种或多种调节序列以某种方式联合从而使得该基因产物的表达置于该调节序列的影响或控制下时，即为可操作联合。若诱导启动子功能导致编码期望的基因产物的mRNA的转录并且如果两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调节序列指导该基因产物表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力，则两个DNA片段(如多肽编码区和与其联合的启动子)为“可操作联合的”。如此，如果启动子能够实现编码多肽的核酸的转录，那么该启动子区将是与该核酸可操作联合。所述启动子可以是细胞特异性启动子，其仅在预先确定的细胞中指导DNA的实质性转录。除启动子以外，其它转录控制元件例如增强子，操纵基因，阻遏物和转录终止信号能与多核苷酸可操作联合以指导细胞特异性转录。在本文中公开了合适的启动子和其它转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中发挥功能的转录控制区，如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子，以及内含子-A)，猿病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(如例如劳斯(Rous)肉瘤病毒)。其它转录控制区包括那些自脊椎动物基因如肌动蛋白，热休克蛋白，牛生长激素和家兔a球蛋白衍生的，以及能够控制真核细胞中基因表达的其它序列。另外的合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地，多种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点，翻译起始和终止密码子以及自病毒系统衍生的元件(具体地，内部核糖体进入位点或IRES，也称作CITE序列)。表达盒还可以包含其它特征，如复制起点和/或染色体整合元件，如逆转录病毒长末端重复(LTR)或腺伴随病毒(AAV)反向末端重复(ITR)。本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌或信号肽的另外的编码区联合，所述分泌或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果期望分泌所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子，那么可以将编码信号序列的DNA置于编码本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的核酸上游。依照信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦启动将生长的蛋白质链跨越粗面内质网输出，就将该信号肽或分泌前导序列从成熟的蛋白质切去。本领域中普通技术人员知晓由脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有融合至多肽N端的信号肽，其从所翻译的多肽切去以生成分泌性或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中，使用天然的信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或该序列的保留指导与其可操作联合的多肽分泌的能力的功能性衍生物。或者，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，可以将野生型前导序列用人组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列取代。可以将编码能用于促进后期纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记T细胞活化性双特异性抗原结合分子的短蛋白序列的DNA纳入T细胞活化性双特异性抗原结合分子(片段)编码多核苷酸内或其末端。在一个别的实施方案中，提供包含本发明的一种或多种多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中，提供包含本发明的一种或多种载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独地或组合地掺入本文中分别关于多核苷酸和载体所描述的任何特征。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含载体(例如已用该载体转化或转染)，所述载体包含编码本发明T细胞活化性双特异性抗原结合分子(的部分)的多核苷酸。如本文中使用的，术语“宿主细胞”指任何能工程化以生成本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子或其片段的细胞系统种类。适用于复制并支持T细胞活化性双特异性抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域中公知的。在适当时，可用特定的表达载体转染或转导此类细胞，并且可以培养大量的含载体细胞以用于接种大规模发酵罐，从而获得充足量的T细胞活化性双特异性抗原结合分子用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物如大肠杆菌，或各种真核细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，昆虫细胞等。例如，可以在细菌中生成多肽，尤其在不需要糖基化时。在表达后，可以将多肽在可溶性级分中从细菌细胞糊分离并可以进一步纯化。除了原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适合编码多肽的载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化模式的多肽的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,NatBiotech22,1409-1414(2004)，和Li等,NatBiotech24,210-215(2006)。适用于表达(糖基化)多肽的宿主细胞还自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已鉴定出可与昆虫细胞一起使用的大量杆状病毒株，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞。也可以将植物细胞培养物用作宿主。参见例如美国专利No.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适应于在悬液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。可用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如例如记载于Graham等,JGenVirol36,59(1977))，幼仓鼠肾细胞(BHK)，小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如例如记载于Mather,BiolReprod23,243-251(1980)的)，猴肾细胞(CV1)，非洲绿猴肾细胞(VERO-76)，人宫颈癌细胞(HELA)，犬肾细胞(MDCK)，牛鼠(buffalorat)肝细胞(BRL3A)，人肺细胞(W138)，人肝细胞(HepG2)，小鼠乳房肿瘤细胞(MMT060562)，TRI细胞(如例如记载于Mather等,AnnalsN.Y.AcadSci383,44-68(1982)的)，MRC5细胞和FS4细胞。其它可用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等,ProcNatlAcadSciUSA77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如YO，NS0，P3X63和Sp2/0。对于某些适用于蛋白质生产的哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu,MethodsinMolecularBiology,第248卷(B.K.C.Lo编,HumanaPress,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养细胞，酵母细胞，昆虫细胞，细菌细胞和植物细胞等，但还包括在转基因动物，转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，优选为哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，人胚肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如Y0，NS0，Sp20细胞)。本领域中已知在这些系统中表达外来基因的标准技术。可以将表达包含抗原结合域如抗体的重链或轻链的多肽的细胞工程化改造为使得还表达另一抗体链，从而使得表达的产物是具有重链和轻链两者的抗体。在一个实施方案中，提供了生成依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的方法，其中所述方法包括在适合于所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子表达的条件下培养包含编码T细胞活化性双特异性抗原结合分子的多核苷酸的宿主细胞(如本文中提供的)，并从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子。所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子的组分彼此遗传融合。T细胞活化性双特异性抗原结合分子可设计为使其组分直接彼此融合或经由接头序列间接融合。可依照本领域中公知的方法测定接头的组成和长度，并可以测试功效。T细胞活化性双特异性抗原结合分子不同组分之间的接头序列的例子见于本文中提供的序列。还包含另外的序列以纳入切割位点来分开融合的各个组分(若期望的话)，例如内肽酶识别序列。在某些实施方案中，所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一个或多个抗原结合模块至少包含能结合抗原性决定簇的抗体可变区。可变区可形成天然或非天然存在的抗体及其片段的一部分和自其衍生。生成多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域中公知的(参见例如Harlow和Lane,“Antibodies,alaboratorymanual”,ColdSpringHarborLaboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成构建生成，可以重组生成(例如如记载于美国专利No.4,186,567的)或可通过例如筛选包含可变重链和可变轻链的组合库获得(参见例如McCafferty的美国专利No.5,969,108)。可以将抗体，抗体片段，抗原结合域或可变区的任何动物种类用于本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。可用于本发明的非限制性抗体，抗体片段，抗原结合域或可变区可以是鼠，灵长类或人起源的。如果T细胞活化性双特异性抗原结合分子意图供人使用，那么可以使用嵌合形式的抗体，其中抗体的恒定区来自人。也可以依照本领域中公知的方法制备人源化或全人形式的抗体(参见例如Winter的美国专利No.5,565,332)。人源化可以通过各种方法实现，包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)CDR嫁接到人(例如受体抗体)框架和恒定区上，保留或不保留关键的框架残基(例如那些对于保留较好的抗原结合亲和力或抗体功能重要的残基)，(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR；对于抗体-抗原相互作用关键的残基)嫁接到人框架和恒定区上，或(c)移植完整的非人可变域，但通过替换表面残基用人样部分来“掩饰(cloak)”它们。人源化的抗体及其制备方法综述于例如Almagro和Fransson,FrontBiosci13,1619-1633(2008)，并且还记载于例如Riechmann等,Nature332,323-329(1988)；Queen等,ProcNatlAcadSciUSA86,10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；Jones等,Nature321,522-525(1986)；Morrison等,ProcNatlAcadSci81,6851-6855(1984)；Morrison和Oi,AdvImmunol44,65-92(1988)；Verhoeyen等,Science239,1534-1536(1988)；Padlan,MolecImmun31(3),169-217(1994)；Kashmiri等,Methods36,25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan,MolImmunol28,489-498(1991)(描述“表面重建”)；Dall’Acqua等,Methods36,43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等,Methods36,61-68(2005)以及Klimka等,BrJCancer83,252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”办法)。可以使用本领域中已知的各种技术来生成人抗体和人可变区。人抗体一般记载于vanDijk和vandeWinkel,CurrOpinPharmacol5,368-74(2001)以及Lonberg,CurrOpinImmunol20,450-459(2008)。人可变区能形成通过杂交瘤方法制备的人单克隆抗体的一部分和自其衍生(参见例如MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,pp.51-63(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987))。还可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体和人可变区，所述转基因动物已经过修饰以应答抗原激发而生成完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体(参见例如Lonberg,NatBiotech23,1117-1125(2005)。还可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示库的Fv克隆可变区序列来生成人抗体和人可变区(参见例如Hoogenboom等，于MethodsinMolecularBiology178,1-37(O’Brien等编,HumanPress,Totowa,NJ,2001)；和McCafferty等,Nature348,552-554；Clackson等,Nature352,624-628(1991))。噬菌体通常展示抗体片段，作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段。在某些实施方案中，将可用于本发明的抗原结合模块工程化改造为具有增强的结合亲和力，其依照例如公开于美国专利申请公开文本No.2004/0132066的方法进行，其完整内容通过提述据此并入。可以经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟知的其它技术来测量本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子结合特定抗原性决定簇的能力，所述其它技术例如表面等离振子共振技术(在BIACORET100系统上分析)(Liljeblad等,GlycoJ17,323-329(2000))和传统的结合测定法(Heeley,EndocrRes28,217-229(2002))。可以使用竞争测定法来鉴定与参照抗体竞争对特定抗原的结合的抗体，抗体片段，抗原结合域或可变域，例如与V9抗体竞争对CD3的结合的抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合由参照抗体结合的相同表位(例如线性或构象性表位)。用于定位抗体结合的表位的详细的例示性方法在Morris(1996)“EpitopeMappingProtocols,”于MethodsinMolecularBiologyvol.66(HumanaPress,Totowa,NJ)中提供。在一种例示性竞争测定法中，将固定化的抗原(例如CD3)在溶液中温育，所述溶液包含结合该抗原的第一标记抗体(例如V9抗体，记载于US6,054,297)和测试其与第一抗体竞争对抗原的结合的能力的第二未标记抗体。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化的抗原在溶液中温育，所述溶液包含第一标记抗体但没有第二未标记抗体。在允许第一抗体结合抗原的条件下温育后，除去过量的未结合的抗体，并测量与固定化抗原联合的标记物的量。如果与固定化抗原联合的标记物的量在测试样品中相对于对照样品实质性降低，那么这指示第二抗体在与第一抗体竞争对抗原的结合。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:ALaboratoryManualch.14(ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY)。可以通过本领域已知的技术来纯化如本文中描述的那样制备的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，所述技术如高效液相层析，离子交换层析，凝胶电泳，亲和层析，大小排阻层析等。用于纯化具体蛋白质的实际条件将部分取决于因素，如净电荷，疏水性，亲水性等，而且对于本领域中的技术人员将是明显的。对于亲和层析纯化，能使用T细胞活化性双特异性抗原结合分子结合的抗体，配体，受体或抗原。例如，对于本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的亲和层析纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。可以使用连续的蛋白A或G亲和层析和大小排阻层析来分离T细胞活化性双特异性抗原结合分子，基本如实施例中描述的。可以通过多种公知的分析方法中的任一种来测定T细胞活化性双特异性抗原结合分子的纯度，包括凝胶电泳，高压液相层析等。例如，如实施例中所描述的那样表达的重链融合蛋白显示为完整且正确装配的，如通过还原性SDS-PAGE证明的(见例如图3)。在约Mr25,000,Mr50,000和Mr75,000处解析出三条条带，其对应于预测的T细胞活化性双特异性抗原结合分子轻链，重链和重链/轻链融合蛋白的分子量。测定法通过本领域中已知的各种测定法，可以鉴定，筛选或表征本文中提供的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的物理/化学特性和/或生物学活性。亲和力测定法可以依照实施例中提出的方法使用标准的仪器如BIAcore仪(GEHealthcare)通过表面等离振子共振(SPR)测定T细胞活化性双特异性抗原结合分子对Fc受体或靶抗原的亲和力，而且可以诸如通过重组表达获得受体或靶蛋白。或者，可以例如通过流式细胞术(FACS)，使用表达特定受体或靶抗原的细胞系来评估T细胞活化性双特异性抗原结合分子对不同受体或靶抗原的结合。一个用于测量结合亲和力的特定的说明性和例示性实施方案记载于下文和下文实施例。依照一个实施方案，通过表面等离振子共振使用T100仪(GEHealthcare)于25℃测量KD。为了分析Fc部分与Fc受体之间的相互作用，通过固定化于CM5芯片上的抗五His抗体(Qiagen)来捕捉带His标签的重组Fc受体并将双特异性构建体用作分析物。简言之，将羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5,GEHealthcare)依照供应商说明书用N-乙基-N’-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺氢氯化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。将抗五His抗体用10mM醋酸钠pH5.0稀释至40μg/ml，接着以5μl/分钟的流速注射以实现约6500响应单位(RU)的偶联蛋白。在注射配体后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。然后，在4或10nM捕捉Fc受体60秒。对于动力学测量，将双特异性构建体的4倍连续稀释液(范围为约500nM至4000nM)在HBS-EP(GEHealthcare,10mMHEPES,150mMNaCl,3mMEDTA,0.05％表面活性剂P20,pH7.4)中于25℃以约30μl/分钟的流速注射120秒。为了测定对靶抗原的亲和力，通过固定化于活化CM5传感器芯片表面上的抗人Fab特异性抗体(GEHealthcare)来捕捉双特异性构建体，如对于抗五-His抗体所描述的。偶联蛋白质的最终量为约12000RU。双特异性构建体在300nM捕捉90秒。使靶抗原在从250至1000nM的浓度范围以30μl/min的流速通过流动池达180秒。监测解离达180秒。通过扣除在参照流动池上获得的响应来校正批量折射率(bulkrefractiveindex)差异。使用稳定态响应通过Langmuir结合等温线的非线性曲线拟合来导出解离常数KD。使用简单的1对1Langmuir结合模型(T100评估软件版本1.1.1)通过同时拟合结合和解离传感图来计算结合速率(k结合)和解离速率(k解离)。平衡解离常数(KD)计算为比率k解离/k结合。参见例如Chen等,JMolBiol293,865-881(1999)。活性测定法可以通过各种测定法来测量本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的生物学活性，如实施例中描述的。生物学活性可例如包括诱导T细胞的增殖，诱导T细胞中的信号传导，诱导T细胞中活化标志物的表达，诱导通过T细胞的细胞因子分泌，诱导靶细胞如肿瘤细胞的裂解，和诱导肿瘤消退和/或改善存活。组合物，配制剂和施用路径在一个别的方面，本发明提供包含本文中提供的任一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子的药物组合物，例如用于以下任一种治疗方法。在一个实施方案中，药物组合物包含本文中提供的任一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子以及药学可接受载体。在另一个实施方案中，药物组合物包含本文中提供的任一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子以及至少一种另外的治疗剂，例如如下文描述的。还提供以适于体内施用的形式生成本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的方法，所述方法包括(a)获得依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，并(b)将所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子与至少一种药学可接受载体配制在一起，由此配制成用于体内施用的T细胞活化性双特异性抗原结合分子制剂。本发明的药物组合物包含治疗有效量的在药学可接受载体中溶解或分散的一种或多种T细胞活化性双特异性抗原结合分子。短语“药学或药理学可接受的”指在所采用的剂量和浓度一般对接受者无毒性，即在适当时对动物如例如人施用时不产生不利，变应性或其它不当反应的分子实体和组合物。根据本公开，制备含有至少一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子以及任选地另外的活性成分的药物组合物将是本领域技术人员已知的，如由Remington’sPharmaceuticalSciences,18thEd.MackPrintingCompany,1990例示的，其通过提述并入本文。此外，对于动物(例如人)施用，会理解制剂应当满足FDA生物标准部门(FDAOfficeofBiologicalStandards)或其它国家的相应机构要求的无菌性，热原性(pyrogenicity)，一般安全性和纯度标准。优选的组合物是冻干配制剂或水性溶液。如本文中使用的，“药学可接受载体”包括任何和所有的溶剂，缓冲剂，分散介质，涂料材料，表面活性剂，抗氧化剂，防腐剂(例如抗细菌剂，抗真菌剂)，等张剂，吸收延缓剂，盐，防腐剂，抗氧化剂，蛋白质，药物，药物稳定剂，聚合物，凝胶，粘合剂，赋形剂，崩解剂(disintegrationagent)，润滑剂，甜味剂，芳香剂，染料，此类类似的材料及其组合，如本领域普通技术人员将已知的(参见例如Remington’sPharmaceuticalSciences,18thEd.MackPrintingCompany,1990,pp.1289-1329，通过提述并入本文)。除非任何常规载体与活性成分不相容，涵盖其在治疗或药物组合物中的使用。所述组合物可以包含不同类型的载体，这取决于其要以固体，液体还是气雾剂形式施用，以及其对于此类施用路径如注射是否需要是无菌的。可以静脉内，皮内，动脉内，腹膜内，损伤内，颅内，关节内，前列腺内，脾内，肾内，胸膜内，气管内，鼻内，玻璃体内，阴道内，直肠内，肿瘤内，肌内，腹膜内，皮下，结膜下，囊泡内，粘膜，心包内，脐内，眼内，口服，表面(topically)，局部(locally)，通过吸入(例如气雾剂吸入)，注射，输注，连续输注，直接浸洗靶细胞的局部灌注，经由导管，经由灌洗，以乳剂，以液体组合物(例如脂质体)，或通过其它方法或前述项的任意组合施用本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子(以及任何另外的治疗剂)，如本领域中普通技术人员会知晓的(参见例如Remington’sPharmaceuticalSciences,18thEd.MackPrintingCompany,1990，通过提述并入本文)。胃肠外施用，特别是静脉内注射，最常用于施用多肽分子如本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。胃肠外组合物包括那些设计用于通过注射施用，例如皮下，皮内，损伤内，静脉内，动脉内，肌内，鞘内或腹膜内注射施用的组合物。对于注射，可以将本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子在水性溶液，优选地在生理学相容的缓冲液中配制，所述生理学相容的缓冲液如汉克(Hanks)氏溶液，林格(Ringer)氏溶液或生理学盐水缓冲液。溶液可以含有配制剂如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。或者，T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以为粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物例如无菌无热原水构成。根据需要，通过将本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子以需要的量掺入到具有下文列举的各种其它成分的合适溶剂中来制备无菌可注射溶液。可以容易地实现无菌，例如通过过滤流过无菌过滤膜进行。一般地，通过将各种无菌活性成分掺入到无菌媒介物中来制备分散剂，所述无菌媒介物含有基础分散介质和/或其它成分。在制备无菌可注射溶液，悬液或乳剂的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术，其将活性成分以及任何另外的期望成分的粉末从其先前无菌过滤的液体介质产生。液体介质在必要时应当是适当缓冲的，并且在用充足的盐水或葡萄糖注射前首先使液体稀释液等张。组合物在制备和贮存条件下必须是稳定的，并且针对微生物如细菌和真菌的污染作用提供保护。会领会的是，应当将内毒素污染最少保持于安全水平，例如低于0.5ng/mg蛋白质。合适的药学可接受载体包括但不限于：缓冲剂如磷酸，柠檬酸和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵(hexamethoniumchloride)；氯化苯甲烃铵(benzalkoniumchloride)；氯化苄乙铵(benzethoniumchloride)；酚，丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(低于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清清蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖，和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反荷离子如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子型表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬液可以含有提高悬液粘度的化合物，如羧甲基纤维素钠，山梨糖醇，葡聚糖等。任选地，悬液还可以含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度以允许制备高度浓缩的溶液的试剂。另外，可以将活性化合物的悬液制备为合适的油性注射悬液。合适的亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油如芝麻油或合成的脂肪酸酯，如乙基cleats或甘油三酯或脂质体。可以将活性成分在例如分别通过凝聚技术或通过界面聚合作用制备的微囊剂，例如羟甲基纤维素或明胶微囊剂和聚-(甲基丙烯酸酯)微囊剂中，在胶体药物投递系统(例如脂质体，清蛋白微球，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液(macroemulsion)中包载。此类技术披露于Remington’sPharmaceuticalSciences(18thEd.MackPrintingCompany,1990)。可以制备持续释放的制剂。合适的持续释放制剂的例子包括含多肽的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形制品例如膜或微囊剂的形式。在具体的实施方案中，可以通过在组合物中使用吸收延迟剂如例如单硬脂酸铝，明胶或其组合，来产生可注射组合物的延长吸收。在先前描述的组合物外，T细胞活化性双特异性抗原结合分子还可以配制为贮存(depot)制剂。可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射来施用此类长效配制剂。如此，例如所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以用合适的聚合或疏水性材料(例如作为可接受油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或配制为微溶性衍生物，例如微溶性盐。可以通过常规的混合，溶解，乳化，包囊，包载或冻干过程来制备包含本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的药物组合物。可以以常规方式配制药物组合物，其使用一种或多种有助于将蛋白质加工成可药学使用的制剂的生理学可接受载体，稀释剂，赋形剂或辅助剂。合适的配制剂依赖于选择的施用路径。可以将T细胞活化性双特异性抗原结合分子以游离酸或碱，中性或盐形式配制成组合物。药学可接受盐是基本保留游离酸或碱的生物学活性的盐。这些包括酸加成盐(acidadditionsalt)，例如与蛋白质性组合物的游离氨基基团形成的那些，或与无机酸(如例如氢氯酸或磷酸)或与有机酸如乙酸，草酸，酒石酸或扁桃酸形成的。与游离羧基基团形成的盐还可以自无机碱如例如氢氧化钠，钾，铵，钙或铁；或有机碱如异丙胺，三甲胺，组氨酸或普鲁卡因(procaine)衍生。药用盐倾向于比相应的游离碱形式更可溶于水性溶剂和其它质子溶剂中。治疗方法和组合物可以将本文中提供的任一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子用在治疗方法中。本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可用作免疫治疗剂，例如在癌症的治疗中。对于在治疗方法中的使用，将以与优良医学实践一致的方式配制，给药和施用本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在此背景中考虑的因素包括治疗的特定病症，治疗的特定哺乳动物，个体患者的临床状况，病症的起因，药剂的投递部位，施用方法，施用时间安排以及医学从业人员已知的其它因素。在一个方面，提供用作药物的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在别的方面，提供用于治疗疾病的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中，提供用于治疗方法的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中，本发明提供如本文中描述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，用于治疗有此需要的个体中的疾病。在某些实施方案中，本发明提供T细胞活化性双特异性抗原结合分子，用于治疗患有疾病的个体的方法，所述方法包括对所述个体施用治疗有效量的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中，待治疗的疾病是增殖性病症。在一个具体的实施方案中，所述疾病是癌症。在某些实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂(如果待治疗的疾病是癌症的话)。在别的实施方案中，本发明提供如本文中描述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，用于诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞的裂解。在某些实施方案中，本发明提供T细胞活化性双特异性抗原结合分子，用于在个体中诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞裂解的方法，该方法包括对该个体施用有效量的T细胞活化性双特异性抗原结合分子以诱导靶细胞的裂解。依照上文任何实施方案的“个体”是哺乳动物，优选是人。在一个别的方面，本发明提供本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，所述药物用于治疗有此需要的个体中的疾病。在一个别的实施方案中，所述药物用于治疗疾病的方法，该方法包括对患疾病的个体施用治疗有效量的药物。在某些实施方案中，待治疗的疾病是增殖性病症。在一个具体的实施方案中，所述疾病是癌症。在一个实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂(如果待治疗的疾病是癌症的话)。在一个别的实施方案中，所述药物用于诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞的裂解。仍在别的实施方案中，所述药物用于在个体中诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞裂解的方法，所述方法包括对该个体施用有效量的药物以诱导靶细胞的裂解。依照上文任何实施方案的“个体”是哺乳动物，优选是人。在一个别的方面，本发明提供用于治疗疾病的方法。在一个实施方案中，所述方法包括对患有此类疾病的个体施用治疗有效量的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中，对所述个体施用组合物，其包含药学可接受的形式的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中，待治疗的疾病是增殖性病症。在一个具体的实施方案中，所述疾病是癌症。在某些实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂(如果待治疗的疾病是癌症的话)。依照上文任何实施方案的“个体”是哺乳动物，优选是人。在一个别的方面，本发明提供一种用于诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞裂解的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在存在T细胞，特别是细胞毒性T细胞的情况下使靶细胞与本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子接触。在一个别的方面，提供一种用于在个体中诱导靶细胞，特别是肿瘤细胞裂解的方法。在一个此类实施方案中，所述方法包括对个体施用有效量的T细胞活化性双特异性抗原结合分子以诱导靶细胞裂解。在一个实施方案中，“个体”是人。在某些实施方案中，所述待治疗的疾病是增殖性病症，特别是癌症。癌症的非限制性例子包括膀胱癌，脑癌，头和颈癌，胰腺癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，子宫癌，宫颈癌，子宫内膜癌，食道癌，结肠癌，结肠直肠癌，直肠癌，胃癌，前列腺癌，血液癌，皮肤癌，鳞状细胞癌，骨癌和肾癌。其它可使用本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子治疗的细胞增殖病症包括但不限于位于下列各项中的新生物：腹部，骨，乳房，消化系统，肝，胰，腹膜，内分泌腺(肾上腺，副甲状腺，垂体，睾丸，卵巢，胸腺，甲状腺)，眼，头和颈，神经系统(中枢和外周)，淋巴系统，骨盆，皮肤，软组织，脾，胸区，和泌尿生殖系统。还包括癌症前期状况或损伤以及癌症转移。在某些实施方案中，癌症选自下组：肾细胞癌，皮肤癌，肺癌，结肠直肠癌，乳腺癌，脑癌，头和颈癌。熟练技术人员容易地认可在许多情况下，T细胞活化性双特异性抗原结合分子可能不提供治愈而仅可以提供部分益处。在一些实施方案中，具有一些益处的生理学变化也被视为治疗有益的。如此，在一些实施方案中，提供生理学变化的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的量被视为“有效量”或“治疗有效量”。需要治疗的受试者，患者或个体通常为哺乳动物，更特定地为人。在一些实施方案中，对细胞施用有效量的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在其它实施方案中，对个体施用治疗有效量的本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子以治疗疾病。为了预防或治疗疾病，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的合适剂量(当单独或与一种或多种其它另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病的类型，施用路径，患者的体重，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的类型，疾病的严重程度和进程，施用T细胞活化性双特异性抗原结合分子是为了预防还是治疗目的，先前或同时的治疗干预，患者的临床史和对T细胞活化性双特异性抗原结合分子的响应，以及主治医师的判断。负责施用的从业人员将在任何事件中确定组合物中活性成分的浓度和用于个体受试者的合适剂量。本文中涵盖各种给药方案，包括但不限于在各个时间点的单次或多次施用，推注施用，和脉冲输注。所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子适宜地在一次或一系列治疗里对患者施用。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以是用于对患者施用的起始候选剂量，不管是例如通过一次或多次分开的施用，还是通过连续输注进行。根据上文提及的因素，一种典型的每日剂量的范围可以从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在数天或更长里的重复施用，根据状况，治疗一般将持续直至发生对疾病症状的期望的抑制。T细胞活化性双特异性抗原结合分子的一种例示性剂量将在约0.005mg/kg至约10mg/kg的范围内。在其它非限制性例子中，剂量还可包括每次施用从约1微克/kg体重，约5微克/kg体重，约10微克/kg体重，约50微克/kg体重，约100微克/kg体重，约200微克/kg体重，约350微克/kg体重，约500微克/kg体重，约1毫克/kg体重，约5毫克/kg体重，约10毫克/kg体重，约50毫克/kg体重，约100毫克/kg体重，约200毫克/kg体重，约350毫克/kg体重，约500毫克/kg体重，至约1000mg/kg体重或更多，以及其中可导出的任何范围。在从本文列出的数量可导出的范围的非限制性例子中，基于上文描述的数目，可以施用约5mg/kg体重至约100mg/kg体重的范围，约5微克/kg体重至约500毫克/kg体重的范围等。如此，可以对患者施用一剂或多剂的约0.5mg/kg，2.0mg/kg，5.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)。可以间歇地施用此类剂量，例如每周或每3周(例如使得患者接受约2至约20，或例如约6剂的T细胞活化性双特异性抗原结合分子)。可以施用起始较高的加载剂量，继之以一剂或多剂较低剂量。然而，可以使用其它剂量方案。通过常规技术和测定法容易监测该疗法的进行。本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子一般将以对于实现意图的目的有效的量使用。对于治疗或预防疾病状况的用途，以治疗有效量施用或应用本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，或其药物组合物。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力以内，尤其根据本文中提供的详细公开内容。对于系统性施用，能从体外测定法如细胞培养测定法初步估算出治疗有效剂量。然后可以在动物模型中配制剂量以达到包含如在细胞培养中测定的IC50的循环浓度范围。可以将此类信息用于更准确地确定人中的可用剂量。使用本领域中公知的技术，还能从体外数据例如动物模型估算出初始剂量。本领域中的普通技术人员能容易地基于动物数据优化对人的施用。可以分别调整剂量量和时间间隔以提供足以维持治疗效果的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的血浆水平。通过注射施用的可用患者剂量的范围为从约0.1至50mg/kg/天，通常约0.5至1mg/kg/天。可以通过每日施用多剂实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC测量血浆中的水平。在局部施用或选择性摄取的情况中，T细胞活化性双特异性抗原结合分子的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员会能够在无需过度实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。本文中描述的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的治疗有效剂量一般将提供治疗益处，而不导致实质性毒性。可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学规程来测定T细胞活化性双特异性抗原结合分子的毒性和治疗功效。可以使用细胞培养测定法和动物研究来测定LD50(对50％的群体致命的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比率为治疗指数，其可以表达为LD50/ED50比。优选展现出较大治疗指数的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。在一个实施方案中，依照本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子展现出高治疗指数。可以将从细胞培养测定法和动物研究获得的数据用来制定适用于人的剂量范围。优选地，剂量处于具有很小或无毒性的循环浓度(包含ED50)的范围内。剂量在此范围内可以随多种因素，例如采用的剂量形式，利用的施用路径，受试者的状况等而变化。鉴于患者的状况，各个内科医生可以选择确切的配制剂，施用路径和剂量(参见例如Fingl等,1975，于：ThePharmacologicalBasisofTherapeutics,Ch.1,p.1,通过提述完整并入本文)。用本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子治疗的患者的主治内科医生将知晓如何及何时终止，中断或调整施用(由于毒性，器官功能障碍等)。相反，如果临床应答不适当(排除毒性)，主治内科医生还将知晓如何将治疗调整至更高水平。在感兴趣的病症的管理中的施用剂量的量级将随待治疗的状况的严重程度，施用路径等而变化。可以例如部分地通过标准的预后评估方法来评估状况的严重程度。另外，剂量以及可能的给药频率也将随个体患者的年龄，体重和应答而变化。其它药剂和治疗本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以与一种或多种其它药剂在疗法中组合施用。例如，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子可以与至少一种另外的治疗剂共施用。术语“治疗剂”涵盖施用以治疗需要此类治疗的个体中的症状或疾病的任何药剂。此类另外的治疗剂可以包含任何适用于所治疗的特定适应征的任何活性成分，优选地具有不会彼此不利影响的互补活性的那些活性成分。在某些实施方案中，另外的治疗剂是免疫调控剂，细胞抑制剂，细胞粘着的抑制剂，细胞毒剂，细胞凋亡的激活剂，或提高细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂。在一个具体的实施方案中，另外的治疗剂是抗癌剂，例如微管破坏物，抗代谢物，拓扑异构酶抑制剂，DNA嵌入剂，烷化剂，激素疗法，激酶抑制剂，受体拮抗剂，肿瘤细胞凋亡的激活剂，或抗血管生成剂。此类其它药剂以对意图目的有效的量适宜地组合存在。此类其它药剂的有效量取决于使用的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的量，病症或治疗的类型以及上文所述其它因素。所述T细胞活化性双特异性抗原结合分子一般以与本文中描述的相同的剂量和施用路径，或以本文中描述的剂量的约1至99％，或通过凭经验/临床上确定为合适的任何剂量和任何路径使用。上文记载的此类组合疗法涵盖组合施用(其中在同一组合物或分别的组合物中包含两种或更多种治疗剂)和分开施用，在该情况中，本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子的施用可以在施用另外的治疗剂和/或辅助剂之前，同时和/或之后发生。本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子还可以与放射疗法组合使用。制品在本发明的另一个方面，提供含有可用于治疗，预防和/或诊断上文描述的病症的材料的制品。所述制品包含容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶，管形瓶，注射器，IV溶液袋等。所述容器可从多种材料如玻璃或塑料形成。所述容器容纳组合物，其自身或与其它组合物组合对于治疗，预防和/或诊断状况是有效的，并且可以具有无菌的存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射针可穿过的塞子的静脉内溶液袋或管形瓶)。组合物中至少一种活性成分是本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子。标签或包装插页指示该组合物用于治疗选择的状况。此外，所述制品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的T细胞活化性双特异性抗原结合分子；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另外的细胞毒性或其它方面治疗剂。本发明的这一实施方案中的制品还可以包含包装插页，其指示该组合物可用于治疗特定状况。或者/另外，所述制品还可以包含第二(或第三)容器，其包含药学可接受缓冲液，如抑菌性注射用水(BWFI)，磷酸盐缓冲盐水，林格(Ringer)氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包含从商业和用户观点看期望的其它材料，包括其它缓冲液，稀释剂，滤器，针，和注射器。实施例下面是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，鉴于上文提供的一般性描述，可以实践各种其他实施方案。通用方法重组DNA技术使用标准方法操作DNA，如Sambrooketal.,Molecularcloning:Alaboratorymanual；ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,1989中描述的。依照制造商的说明书使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻和重链的核苷酸序列的一般信息参见：Kabat,E.A.etal.,(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thed.,NIHPublicationNo91-3242。DNA测序通过双链测序来测定DNA序列。基因合成在需要的情况下，期望的基因区段使用适宜的模板通过PCR来生成或由GeneartAG(Regensburg,Germany)通过自动化基因合成从合成的寡核苷酸和PCR产物合成。在确切基因序列不可得的情况下，基于来自最近的同源物的序列设计寡核苷酸引物，并通过RT-PCR从源自适宜组织的RNA分离基因。将侧翼为单一限制性内切核酸酶切割位点的基因区段克隆入标准的克隆/测序载体。从经转化的细菌纯化质粒DNA，并通过UV分光术测定浓度。通过DNA测序确认亚克隆的基因片段的DNA序列。基因区段设计为具有合适的限制性位点以允许亚克隆入相应的表达载体。所有构建体均设计为具有编码前导肽的5’端DNA序列，该前导肽在真核细胞中将蛋白质靶向分泌。实施例1有和无电荷修饰的T细胞双特异性(TCB)抗体(抗CD20/抗CD3)的制备在这个实施例中制备了下述分子，它们的示意图显示于图2：A.无电荷修饰的“2+1IgGCrossFab，倒转的”(CD3结合物中的CH1/CL交换)(图2A，SEQIDNO14-17)B.有电荷修饰的“2+1IgGCrossFab，倒转的”(CD3结合物中的VH/VL交换，CD20结合物中的电荷修饰)(图2B，SEQIDNO18-21)C.有电荷修饰的“2+1IgGCrossFab”(CD3结合物中的VH/VL交换，CD20结合物中的电荷修饰)(图2C，SEQIDNO32，19-21)D.无电荷修饰的“2+1IgGCrossFab，倒转的”(CD3结合物中的VH/VL交换)(图2D，SEQIDNO33，15，17，21)E.无电荷修饰的“2+1IgGCrossFab，倒转的”(CD3结合物中的VH-CH1/VL-CL交换)(图2E，SEQIDNO34，15，17，35)F.有电荷修饰的“2+1IgGCrossFab，倒转的”(CD20结合物中的VH/VL交换，CD3结合物中的电荷修饰)(图2F，SEQIDNO36-39)G.有电荷修饰和Fc区中的DDKK突变的“2+1IgGCrossFab，倒转的”(CD3结合物中的VH/VL交换，CD20结合物中的电荷修饰)(图2G，SEQIDNO40，41，20，21)H.有电荷修饰的“1+1CrossMab”(CD3结合物中的VH/VL交换，CD20结合物中的电荷修饰)(图2H，SEQIDNO42，43，20，21)I.有电荷修饰的“1+1CrossMab”(CD3结合物中的VH/VL交换，CD20结合物中的电荷修饰，不同的CD20结合物)(图2I，SEQIDNO43-45，21)J.有电荷修饰213E，123R的“2+1IgGCrossFab，倒转的”(CD3结合物中的VH/VL交换，CD20结合物中的电荷修饰)(图2J，SEQIDNO69-71，21)K.有电荷修饰的“2+1IgGCrossFab，倒转的”(CD3结合物中的VH/VL交换和电荷修饰)(图2K，SEQIDNO15，17，72，73)。将重和轻链可变区DNA序列与预先插入相应接受哺乳动物表达载体中的恒定重链或恒定轻链任一同框亚克隆。蛋白质表达受MPSV启动子驱动且合成的polyA信号序列位于CDS的3’端。另外，每种载体含有EBVOriP序列。通过使用聚乙烯亚胺(PEI)用哺乳动物表达载体共转染悬浮生长的HEK293-EBNA细胞来生成该分子。用相应的表达载体以1:2:1:1比率(A：“载体重链(VH-CH1-VH-CL-CH2-CH3)”:“载体轻链(VL-CL)”:“载体重链(VH-CH1-CH2-CH3)”:“载体轻链(VL-CH1)”；B，D，G，J，K：“载体重链(VH-CH1-VL-CH1-CH2-CH3)”:“载体轻链(VL-CL)”:“载体重链(VH-CH1-CH2-CH3)”:“载体轻链(VH-CL)”；C：“载体重链(VL-CH1-VH-CH1-CH2-CH3)”:“载体轻链(VL-CL)”:“载体重链(VH-CH1-CH2-CH3)”:“载体轻链(VH-CL)”；E：“载体重链(VH-CH1-VL-CL-CH2-CH3)”:“载体轻链(VL-CL)”:“载体重链(VH-CH1-CH2-CH3)”:“载体轻链(VH-CH1)”；F：“载体重链(VL-CH1-VH-CH1-CH2-CH3)”:“载体轻链(VH-CL)”:“载体重链(VL-CH1-CH2-CH3)”:“载体轻链(VH-CH1)”)或1:1:1:1比率(H，I：“载体重链(VL-CH1-CH2-CH3)”:“载体轻链(VL-CL)”:“载体重链(VH-CH1-CH2-CH3)”:“载体轻链(VH-CL)”)转染细胞。对于转染，在含有6mML-谷氨酰胺和250mg/lG418的无血清Excell培养基中悬浮培养HEK293EBNA细胞。对于在600mlTubespin烧瓶(最大工作体积400ml)中的生产，在转染前24小时接种600x106个HEK293EBNA细胞。对于转染，将细胞以210xg离心5分钟，并用20ml预热的CDCHO培养基替换上清液。在20mlCDCHO培养基中混合表达载体至最终量为400μgDNA。在添加1080μlPEI溶液(2.7μg/ml)后，将混合物涡旋振荡15秒，随后于室温温育10分钟。之后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至600mlTubespin烧瓶，并于37℃在具有5％CO2气氛的温箱中温育3小时。温育后，添加360mlExcell+6mML-谷氨酰胺+5g/LPepsoy+1.0mMVPA培养基并将细胞培养24小时。在转染后一天，添加7％补料1(Lonza)。在7天后，收集培养上清液进行纯化，即以3600xg(Sigma8K离心机)离心20-30分钟，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，并以0.01％w/v的终浓度添加叠氮化钠。将溶液保持于4℃。通过蛋白A-HPLC测定培养液中构建物的浓度。分离的基础是pH8.0时蛋白A上含Fc分子的结合和自pH2.5起的阶梯洗脱。有两种流动相。这些是Tris(10mM)-甘氨酸(50mM)-NaCl(100mM)缓冲液，相同，只是它们调节至不同的pH(8和2.5)。柱体是Upchurch2x20mm前置柱，内部体积～63μl，填充POROS20A。在经过平衡的材料上注射100μl每种样品，流速0.5ml/min。0.67分钟后，用达到pH2.5的pH梯级洗脱样品。通过测定280nm吸光度及使用人IgG1自16至166mg/l的浓度范围的标准曲线的计算进行量化。自细胞培养物上清纯化分泌的蛋白质，其通过蛋白A亲和层析，继之以大小排阻层析步骤进行。对于亲和层析，将上清液加载到用25ml20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，pH7.5平衡的HiTrap蛋白AHP柱(CV＝5ml,GEHealthcare)上。通过用至少10个柱体积的20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5清洗，继之以使用6个柱体积的10mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，0.5M氯化钠，pH5.45的额外清洗步骤清洗来去除未结合的蛋白质。随后用20ml10mMMES，100mM氯化钠，pH5.0清洗柱，并在6个柱体积的20mM柠檬酸钠，100mM氯化钠，100mM甘氨酸，pH3.0中洗脱靶蛋白。通过添加1/10的0.5M磷酸钠pH8来中和蛋白质溶液。将靶蛋白浓缩并过滤，之后加载到用20mM组氨酸，140mM氯化钠，0.01％Tween-20，pH6.0平衡的HiLoadSuperdex200柱(GEHealthcare)上。分子A必须通过额外的制备性大小排阻层析(SEC)步骤来纯化以实现100％的最终单体含量。因此，将来自第一个大小排阻步骤的具有高单体含量的级分合并，浓缩并再次加载到HiLoadSuperdex200柱(GEHealthcare)上。这个额外的纯化步骤对于其它分子不是必需的(取决于副产物概况，然而，在第一个大小排阻层析之后合并级分及因此回收对于这些分子是不同的)。在第一个纯化步骤(蛋白A亲和层析)之后通过还原剂缺失下的SDS-PAGE和考马斯(SimpleBlueTMSafeStain，Invitrogen)染色来分析分子的纯度和分子量。依照制造商的说明书使用预制凝胶系统(Invitrogen,USA)(4-12％Tris-乙酸盐凝胶或4-12％Bis-Tris)。通过测量280nm处的光密度(OD)来测定经过纯化的蛋白质样品的蛋白质浓度，其使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数进行。在最后一个纯化步骤之后通过在还原剂存在和缺失下的CE-SDS分析来分析分子的纯度和分子量。依照制造商的说明书使用CaliperLabChipGXII系统(CaliperLifescience)。使用2μg样品进行分析。使用TSKgelG3000SWXL分析性大小排阻柱(Tosoh)在25mMK2HPO4，125mMNaCl，200mML-精氨酸单氢氯化物，0.02％(w/v)NaN3，pH6.7运行缓冲液中于25℃分析抗体样品的聚集体含量。遵循相同的方法生成并纯化所有分子(只是分子A进行额外的SEC步骤，如上文指出的)。分子A在第一个制备性大小排阻层析之后显示高聚集体含量。这个纯化步骤之后的聚集体含量无法测定，因为没有高分子量杂质和单体级分的基线分离。为了获得100％单体材料，额外的制备性大小排阻层析步骤是必需的。分子B在一个制备性大小排阻层析之后是100％单体的。与分子B相比，分子A在上清液中的浓度更高，但是最终产量(由于高聚集体含量)低2.3倍(表2)。对于通过CE-SDS分析显示的最终的纯度，分子B比分子A要高(表3，图3A和B)。图3M和3N显示SEC纯化步骤(制备性SEC)的层析图，其中分子A具有与分子B相比较宽的峰，指示在SEC上加载的分子A的制备物不是同质的而分子B的制备物很大程度上是单体的。分子C能以高滴度生成，但是与分子B相比最终的回收率更低，这是由于高含量的通过所应用的层析方法无法完全去除的副产物(表2；表3；图3B和J，和图3C和K)。如图3B和3K中所示，蛋白A纯化步骤之后的SDS-PAGE分析显示分子B没有副产物，而分子C的制备物含有一些在表观分子量100kDa处出现的副产物。分子D与分子B的不同之处仅在于抗CD20Fab中缺失带电荷残基。此分子也能以高滴度瞬时生成，但是诸如早就关于分子C描述的，分析性SEC(分子D的98％单体较之分子B的100％单体)上显示的最终的质量和回收率比分子B要低，这是由于高含量的副产物(表2；表3；图3B和J和图3D和L)。如图3J和3L中所示，蛋白A纯化步骤之后的SDS-PAGE分析显示分子B没有副产物，而分子D的制备物含有一些在表观分子量66kDa和40kDa处出现的副产物。图3N和3O显示SEC纯化步骤(制备性SEC)的层析图，其中分子D具有与分子B相比较宽的峰，指示SEC上加载的分子D的制备物不是同质的而分子B的制备物很大程度上是单体的。还有，分子E的生成的滴度较高，但是最终的产物仍然还有低分子量杂质，如通过分析性SEC和毛细管电泳显示的(表2；表3；图3E)。与分子B形成对比，分子F在肿瘤靶结合模块的Fab上具有VH-VL交换，而在抗CD3Fab上引入电荷修饰。此分子也能以高滴度生成，但是最终的回收率由于副产物而较低。对于抗CD20/抗CD3TCB，在抗CD20Fab中有有电荷修饰的格式就生成和纯化而言是优选的。分子G是在Fc区中有电荷修饰的分子(“DD”＝K392D；Fc域的一个亚基中的K409D，“KK”＝D356K；Fc域的另一个亚基中的D399K(EU编号方式)，替换“节入穴”突变)。通过在一条重链上引入两个天冬氨酸残基和在第二条重链中引入两个赖氨酸残基来促进双特异性分子的生成(图2G)。此分子能以高滴度生成，但是最终的产物仍然具有一些高分子量和低分子量杂质，如通过分析性SEC和毛细管电泳显示的(表2；表3)，而副产物能自携带“节入穴”突变的相同分子(分子B)完全去除。在它的CD20结合物中与分子H不同的分子I在最终的制备性大小排阻层析之后显示与分子H相比更高的聚集体含量。通过CE-SDS分析显示的最终的纯度，分子H比分子I要高(表3；图3H和I)。还有，分子H的回收率比分子I高40％(表2)。此结果显示分子的质量还依赖于T细胞双特异性格式中使用的抗体。分子J和分子K的生成具有较好的起始滴度，这导致较好的产量。然而，两种分子20％左右的最终的回收率大大低于分子B实现的48％(表2)。两种分子在最终的质量方面是相似的，单体含量>99％(表2)。对于非还原性CE-SDS中的纯度，分子J(其缺乏CL域位置124和CH1域位置147处的电荷修饰)的接近99％比分子K(具有CD3结合物中的电荷修饰和VL-VH交换)的90％要好(表3，图3N和3O)。分子J在亲和层析之后的浓缩步骤期间显示一些沉淀。分子K在CD3结合CrossFab而非CD20结合Fab中具有电荷修饰。这对最终的质量有影响，如通过CE-SDS显示的(表3，图3O)。在SDS-PAGE上质量方面的差异在第一个纯化步骤之后最明显(图3P，3Q)。分子K含有比分子J更多的150kDa和70kDa(半分子和大概缺失轻链的构建物)处的副产物。两种分子具有相同的热稳定性，与分子B相似(表4)。对于抗CD20/抗CD3TCB，在抗CD20Fab上有电荷修饰的“倒转的”型式(分子B)是能以最高的回收率和最终的质量生成的格式。表2：有和无电荷修饰的抗CD20/抗CD3TCB分子的生成和纯化的汇总。*最终的产物，两个SEC步骤之后表3：有和无电荷修饰的抗CD20/抗CD3TCB分子的CE-SDS分析(非还原性)。通过LC-MS分析进行的分子量确认去糖基化为了确认分子的同质制备，通过LC-MS分析来分析最终的蛋白质溶液。为了去除由碳水化合物引入的异质性，用PNGaseF处理构建物。为此目的，通过对浓度为0.5mg/ml的20μg蛋白质添加2μl2MTris将蛋白质溶液的pH调节至pH7.0。添加0.8μgPNGaseF并于37℃温育12小时。LC-MS分析–线上检测在偶联TOF6441质谱仪(Agilent)的AgilentHPLC1200上实施LC-MS法。在MachereyNagel聚苯乙烯柱；RP1000-8(8μm粒径，4.6x250mm；产品目录号719510)上实施层析分离。洗脱液A为水中的5％乙腈和0.05％(v/v)甲酸，洗脱液B为95％乙腈，5％水和0.05％甲酸。流速为1ml/min，于40℃用6μg(15μl)之前所述处理获得的蛋白质样品实施分离。时间(分)％B0.515106012.510014.510014.615161516.1100在头4分钟期间，将洗脱液引导入废液中以防止质谱仪的盐污染。以干燥气流12l/min，温度350℃和雾化器压力60psi运行ESI源。以阳离子模式使用碎裂电压380V和质量范围700至3200m/z获取MS谱。由仪器软件获取MS数据4至17分钟。分子A的制备物具有约10-15％的具有错配的轻链的分子和痕量的游离的或连接的轻链。分子B的制备物具有痕量的包含两条CD3轻链的分子。检测不到诸如游离的轻链或连接的轻链等杂质(表2)。通过静态光散射进行的热稳定性通过静态光散射(SLS)及通过测量响应所应用的温度压力而发生的内在蛋白质荧光来监测热稳定性。将30μg经过过滤的蛋白质样品(蛋白质浓度1mg/ml)一式两份应用于Optim2(AvactaAnalyticalLtd；GB)。温度自25至85℃以0.1℃/min上升，收集半径和总散射强度。对于测定内在蛋白质荧光，以295nm激发样品并在266和473nm之间收集发射。对所有分子测定热稳定性，结果显示于表4。应用温度梯度后通过动态光散射测定的聚集温度(TAgg)和通过蛋白质荧光测量的解链温度(TM)对于所有分子是相当的，TAgg范围为54-58℃且TM范围为56-60℃(表4)。表4：有和无电荷修饰的抗CD20/抗CD3TCB分子的热稳定性。分子T聚集[℃]TM[℃]A54.455.9B54.356.4C5659D5659E5660F5860G5759H5556I5357J5455K5455抗CD3/抗CD20TCB抗体对CD3和CD20的结合使用表达人CD3的Jurkat细胞测量有或无电荷修饰的抗CD3/抗CD20T细胞双特异性(TCB)抗体(上文分子“A”和“B”)对CD3的结合。使用表达人CD20的Z-138细胞测定对CD20的结合。收获悬浮细胞，用PBS清洗一次，并使用Vicell测定存活力和细胞密度。以2x106个细胞/ml在FACS缓冲液中重悬浮悬浮细胞。将100μl细胞悬浮液接种入96孔圆底板中。于4℃实施每个步骤。将板以360xg离心5分钟并去除上清液。在PBS/0.1％BSA中制备抗体稀释液。对孔添加30μl经过稀释的抗CD3/抗CD20TCB抗体或FACS缓冲液并将细胞于4℃温育30分钟。温育后，每孔添加120μlFACS缓冲液，将板以350xg离心5分钟，并去除上清液。将清洗步骤重复一次。如板布局中指出的，每孔添加30μl预稀释的二抗。将板于4℃再温育30分钟。温育后，每孔添加120μlFACS缓冲液，将板以350xg离心5分钟，并去除上清液。对所有板将清洗步骤重复一次，具有Jurkat细胞的板除外，Jurkat细胞在这一个清洗步骤之后直接固定。使用每孔100μlBD固定缓冲液(#BDBiosciences，554655)将细胞于4℃固定20-30分钟。在80μl/孔FACS缓冲液中重悬浮细胞，用于使用BDFACSCantoII进行的FACS测量。这个实验的结果显示于图4。由抗CD3/抗CD20TCB抗体诱导的对表达CD20的肿瘤靶细胞的T细胞介导的杀伤后的肿瘤细胞裂解和CD4+和CD8+T细胞活化在Z-138和Nalm-6肿瘤细胞上评估由有或无电荷修饰的抗CD3/抗CD20TCB抗体(上文分子“A”和“B”)诱导的T细胞介导的靶细胞杀伤和T细胞活化。使用人PBMC作为效应器并在与双特异性抗体一起温育后22小时检测杀伤以及T细胞活化。简言之，收获靶细胞，清洗，并以30000个细胞/孔的密度分配，使用圆底96孔板。通过来自健康人供体的新鲜血液的Histopaque密度离心制备外周血单个核细胞(PBMC)。用无菌PBS稀释新鲜血液并在Histopaque梯度(Sigma，#H8889)上分层。离心(450xg，30分钟，室温)后，丢弃含有PBMC的界面上方的血浆并将PBMC转移至一个新的Falcon管，随后装填50mlPBS。将混合物离心(400xg，10分钟，室温)，丢弃上清液并将PBMC团粒用无菌PBS清洗两次(离心步骤350xg，10分钟)。对所得PBMC群体自动计数(Vicell)并在含有10％FCS和1％L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺(Biochrom，K0302)的RPMI1640培养基中保存于细胞温箱(37℃，5％CO2)中直至进一步使用(不超过24小时)。对于杀伤测定法，以所示浓度(范围为1000pM–0.1pM，一式三份)添加抗体。以最终的E:T比为6:1将PBMC添加至靶细胞。温育后，将板以420xg离心4分钟并将50μl/孔转移入新鲜的96孔平底板进行LDH检测。使用细胞毒性检测试剂盒(Roche#11644793001)依照制造商的说明书实施LDH检测。用含有0.1％BSA的PBS清洗剩余细胞。依照供应商的说明书实施针对CD8(APCCy7抗人CD8，Biolegend#301016)，CD4(FITC抗人CD4，Biolegend#300506)，CD69(BV421抗人CD69，Biolegend#310930)和CD25(PECy7抗人CD25，Biolegend#302612)的表面染色。于4℃30分钟后，将细胞用150μl/孔含有0.1％BSA的PBS清洗两次并使用100μl/孔2％PFA固定。使用BDFACSCantoII实施测量。这个实验的结果显示于图5，6和7。两种分子就肿瘤细胞裂解和T细胞活化而言展示相当的活性。人全血中由抗CD3/抗CD20TCB抗体诱导的对健康人B细胞的T细胞介导的杀伤后的B细胞消减和CD4+和CD8+T细胞活化来自健康供体的人全血与所示浓度(范围为50000pM–1pM，一式三份)的有或无电荷修饰的抗CD3/抗CD20TCB抗体(上文分子“A”和“B”)一起温育。22小时后，混合血液并收集35μl用20μl含有CD8(APCCy7抗人CD8，Biolegend#301016)，CD4(FITC抗人CD4，Biolegend#300506)，CD69(BV421抗人CD69，Biolegend#310930)和CD25(PECy7抗人CD25，Biolegend#302612)，CD22(APC抗人CD22，Biolegend#302510)和CD45(PerCPCy5.5抗人CD45，Biolegend#304028)的FACS抗体混合物进行染色。于室温温育15分钟后，用FACS裂解溶液(BD，#349202)固定血液并通过流式细胞术进行分析。基于B细胞数目和CD4+T细胞数目的比计算B细胞消减，将未处理样品设定为0％B细胞消减。这个实验的结果显示于图8和9。两种分子就全血中的B细胞消减和T细胞活化而言展示相当的活性。抗CD3/抗CD20TCB抗体对表达人CD20和CD3的靶细胞的结合在表达人CD20的弥漫性大细胞性B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞系(WSUDLCL2，0.5-1x106个CD20结合位点)和表达CD3的永生化T淋巴细胞系(Jurkat)上测试上文作为分子“B”显示的抗CD3/抗CD20TCB抗体的结合。简言之，收获细胞，计数，检查存活力并以1.5x106个细胞/ml在FACS缓冲液(PBS0.1％BSA)中重悬浮。将100μl细胞悬浮液(含有0.15x106个细胞)在圆底96孔板中与渐增浓度的CD20TCB(50pM-200nM)一起于4℃温育30分钟，用冷的PBS0.1％BSA清洗两次，与经过稀释的PE缀合的AffiniPureF(ab’)2片段山羊抗人IgGFcg片段特异性二抗(JacksonImmunoResearchLabPE#109-116-170)一起于4℃再重温育30分钟，用冷的PBS0.1％BSA清洗两次，通过添加2％PFA进行固定并使用FACSCantoII(SoftwareFACSDiva)通过FACS进行分析，通过FSC/SSC门控将死细胞排除在分析之外。结果显示于图10A(对WSUDLCL2细胞的结合)和图10B(对Jurkat细胞的结合)。使用GraphPadPrism5计算与结合有关的结合曲线和EC50值。EC50值为0.98nM(对表达CD20的WSUDLCL2细胞的二价结合)和大约12.5nM(对表达CD3的Jurkat细胞的单价结合)。抗CD3/抗CD20TCB抗体对表达人和食蟹猴CD20和CD3的靶细胞的结合通过评估对表达人和食蟹猴CD20的B细胞和表达CD3的CD4和CD8T细胞的结合来评估上文以分子“B”所示抗CD3/抗CD20TCB抗体的交叉反应性。简言之，通过密度离心使用肝素化的来自健康供体的人和食蟹猴血液分离PBMC。对分离的PBMC计数，检查存活力并以4x106细胞/ml在FACS缓冲液(100μlPBS0.1％BSA)中重悬浮。将100μl细胞悬浮液(含有0.4x106个细胞)分配入96孔U形底板并离心(420xg，4分钟)。去除上清液后，将PBMC与渐增浓度的CD20TCB-AlexaFlour488(200pM-200nM)一起于4℃温育30分钟，用冷的PBS0.1％BSA清洗两次，与人/食蟹猴交叉反应性抗体：抗CD19(内部，克隆8B8)-AlexaFluor647，抗CD4(BD，#552838，克隆L200)-PerCPCy5.5和抗CD8(BD，#555367，克隆RPA-T8)-PE一起于4℃再温育另30分钟。30分钟后，将PBMC用冷的PBS0.1％BSA清洗两次并用FACS裂解溶液(BD，#349202)处理，接着使用FACSCantoII(SoftwareFACSDiva)进行FACS分析。使用GraphPadPrism5获得结合曲线。结果显示于图11A(对人和食蟹猴B细胞的结合)，图11B(对人和食蟹猴CD4T细胞的结合)和图11C(对人和食蟹猴CD8T细胞的结合)。使用GraphPadPrism5计算的与对表达CD20的B细胞的结合有关的EC50值为4.8nM(人B细胞)和3.3nM(食蟹猴B细胞)。由不同抗CD20/抗CD3TCB抗体型式介导的肿瘤细胞裂解在Z138细胞(套细胞淋巴瘤，0.06-0.23x106个CD20结合位点)上评估由不同抗CD20/抗CD3TCB抗体型式(上文所示分子“B”，“A”，“C”和“H”)介导的肿瘤细胞裂解。使用人PBMC作为效应器并在与不同双特异性抗体型式一起温育21-24小时时检测肿瘤裂解。简言之，收获靶细胞，清洗，并以50000个细胞/孔的密度分配，使用U形底96孔板。通过健康人血液的Histopaque密度离心制备外周血单个核细胞(PBMC)。用无菌PBS稀释新鲜血液并在Histopaque梯度(Sigma，#H8889)上分层。离心(450xg，30分钟，室温，无制动)后，丢弃含有PBMC的界面上方的血浆并将PBMC转移至一个新的Falcon管，随后装填50mlPBS。将混合物离心(350xg，10分钟，室温)，丢弃上清液并用无菌PBS清洗PBMC团粒(300xg，10分钟)。对所得PBMC群体自动计数(Vicell)并在含有10％FCS和1％L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺(Biochrom，K0302)的RPMI1640培养基中保存于细胞温箱(37℃，5％CO2)中直至进一步使用(不超过24小时)。对于肿瘤裂解测定法，以所示浓度(范围为0.1pM–1nM，一式三份)添加抗体。以最终的E:T比为6:1将PBMC添加至靶细胞。于37℃，5％CO2温育21-24小时后通过量化由凋亡/坏死细胞释放入细胞上清液的LDH(LDH检测试剂盒，RocheAppliedScience，#11644793001)来评估肿瘤细胞裂解。通过将靶细胞与1％TritonX-100一起温育来实现最大靶细胞裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)指在没有双特异性构建物的情况下与效应细胞共温育的靶细胞。图12显示了不同CD20TCB抗体型式诱导较强的且靶特异性的CD20+靶细胞裂解。小图A显示了“CD20TCB_2+1_有电荷，倒转的”(上文所示分子“B”)展示与“CD20TCB_2+1_无电荷，倒转的”(上文所示分子“A”)相当的活性，而且二者均比“CD20TCB_1+1_有电荷”型式(上文所示分子“H”)更加有力。小图B显示了“CD20TCB_2+1_有电荷，倒转的”(上文所示分子“B”)比“CD20TCB_2+1_有电荷，经典的”型式(上文所示分子“C”)更加有力。使用GraphPadPrism5计算的与杀伤测定法有关的EC50值在表5中给出。表5。使用表达CD20的Z138肿瘤靶细胞评估的由不同抗CD20/抗CD3TCB抗体型式介导的肿瘤细胞裂解的EC50值(pM)。由不同抗CD20/抗CD3TCB抗体型式介导的肿瘤细胞裂解和后续T细胞活化使用自三名不同健康供体衍生的人PBMC以及更广泛的一组DLBCL系(包括OCILy-18(0.06-0.2x106个CD20结合位点)，Ramos(0.1-0.4x106个CD20结合位点)，SU-DHL-5(0.13-0.21x106个CD20结合位点)，SU-DHL-8(CD20结合位点低于测定法的检测限度)，Toledo(0.02x106个CD20结合位点)和U2932(0.09-0.4x106个CD20结合位点)细胞系)，在Z138细胞(套细胞淋巴瘤)上进一步评估由不同抗CD20/抗CD3TCB抗体型式(上文所示分子“B”和“H”)介导的肿瘤细胞裂解。肿瘤细胞收获，PBMC分离，和测定法条件与之前的实施例中所描述的相同。图13A-C中所示测定法的E:T比为6:1，对于图13D中所示测定法，它是3:1。于37℃，5％CO2温育21小时后通过量化由凋亡/坏死细胞释放入细胞上清液的LDH(LDH检测试剂盒，RocheAppliedScience，#11644793001)来评估肿瘤细胞裂解。对于肿瘤细胞裂解后发生的T细胞活化的评估，将PBMC转移至圆底96孔板，以400xg离心5分钟并用含有0.1％BSA的PBS清洗两次。依照供应商的说明书实施CD8(APCCy7抗人CD8，Biolegend，#301016)，CD4(FITC抗人CD4，Biolegend，#300506)和CD25(PECy7抗人CD25，Biolegend，#302612)的表面染色。将细胞用150μl/孔含有0.1％BSA的PBS清洗两次并使用2％PFA或FACS裂解溶液(BD，#349202)固定。在BDFACSCantoII上分析样品。图13显示了“CD20TCB_2+1_有电荷，倒转的”抗体型式(上文所示分子“B”)比“CD20TCB_1+1”抗体型式(上文所示分子“H”)更加有力，如通过使用来自不同供体的PBMC检测肿瘤细胞裂解(小图A，D)和T细胞活化(小图B，C)二者评估的。与Z138细胞的肿瘤裂解和T细胞活化有关的EC50值在表6a中给出。与一组DLBCL细胞系的肿瘤裂解测定法的有关的EC50值在表6b中给出。EC50值是使用GraphPadPrism5计算的。表6a。使用表达CD20的Z138肿瘤细胞，由抗CD20/抗CD3TCB抗体介导的肿瘤细胞裂解和T细胞活化的EC50值(pM)。表6b。由抗CD20/抗CD3TCB抗体介导的一组DLBCL肿瘤细胞系的肿瘤裂解的EC50值(pM)。由不同抗CD20/抗CD3TCB抗体型式介导的人全血中的B细胞消减使用新鲜的来自健康志愿者的人血液进一步评估由不同的抗CD20/抗CD3TCB抗体型式(上文所示分子“B”和“H”)和奥奴珠单抗(obinutuzumab)介导的正常B细胞消减。简言之，在装有肝素的注射器中收集新鲜血液。将血液小样(180μL/孔)分配入96深孔板，补充TCB或抗体稀释液(10μL/孔+10μL/孔PBS)并在增湿细胞温箱中于37℃在5％CO2中温育24小时。温育后，通过移液来混合血液，之后将35μL血液小样转移入96孔U形底板并与发荧光的抗CD45(APC，Biolegend，#304037)，抗CD4(PerCPCy5.5，BD，#552838)，抗CD8(APCCy7，Biolegend，#301016)，抗CD19(PE，Biolegend，#302208)，抗CD25(PECy7，Biolegend，#302612)和抗CD69(BV421，Biolegend，#310930)一起在55μL总体积中温育用于流式细胞术。于室温(在黑暗中)温育15分钟后，添加180μL/孔FACS裂解溶液(BDBiosciences)以在流式细胞术之前消减红细胞及固定细胞。图14显示了“CD20TCB_2+1_有电荷,倒转的”(上文分子“B”)在消减正常B细胞方面比奥奴珠单抗(Gazyva)和“CD20TCB_1+1”有电荷(上文分子“H”)二者更加有力。表7。由不同的靶向CD20的抗体介导的正常人全血中的B细胞消减的EC50值(pM)。使用Jurkat-NFAT报告物测定法通过量化CD3下游信号传导的强度评估的T细胞活化使用表达CD20的肿瘤靶细胞和Jurkat-NFAT报告细胞(一种具有NFAT启动子的表达CD3的人急性淋巴细胞白血病报告细胞系，GloResponseJurkatNFAT-RE-luc2P，Promega#CS176501)的共培养物评估不同抗CD20/抗CD3TCB抗体型式诱导T细胞交联和后续T细胞活化的能力。一旦抗CD20/抗CD3TCB同时结合CD20抗原(在肿瘤细胞上表达的)和CD3抗原(在Jurkat-NFAT报告细胞上表达的)，NFAT启动子被激活且导致有活性的萤火虫萤光素酶表达。发光信号的强度(添加萤光素酶底物后获得的)与CD3活化和信号传导的强度成比例。Jurkat-NFAT报告细胞悬浮生长且以0.1–0.5mio细胞/ml在RPMI1640，2g/l葡萄糖，2g/lNaHCO3，10％FCS，25mMHEPES，2mML-谷氨酰胺，1xNEAA，1x丙酮酸钠，200μg/ml潮霉素中培养。为了该测定法，收获肿瘤靶细胞(Z138)并使用Vicell测定存活力。将50μl/孔稀释的抗体或培养基(作为对照)添加至靶细胞。在平底，白壁96孔板(#655098，Greinerbio-one)中分配20000个细胞/孔。随后，收获Jurkat-NFAT报告细胞并使用Vicell评估存活力。在无潮霉素B的细胞培养基中以2x106个细胞/ml重悬浮细胞并以0.1x106个细胞/孔(50μl/孔)添加至肿瘤细胞以获得5:1的终E:T和100μl/孔的终体积。将细胞在增湿温箱中于37℃温育6小时。温育时间结束时，将100μl/孔ONE-Glo溶液(1:1ONE-Glo和测定法培养基体积/孔)添加至孔并在黑暗中于室温温育10分钟。使用WALLACVictor3ELISA读数仪(PerkinElmer2030)检测发光，以5秒/孔作为检测时间。图15显示了“CD20TCB_2+1_有电荷，倒转的”(上文分子“B”)导致比“CD20TCB_1+1”(上文分子“H”)更强的T细胞活化和CD3下游的信号传导。表8。使用Jurkat-NFAT报告细胞检测的CD3活化的EC50值(pM)。抗CD20/抗CD3TCB在健康NOG小鼠中的单剂PK实施单剂药动学研究(SDPK)以评估功效研究期间抗CD20/抗CD3TCB分子“B”(以下称作“CD20TCB”)的暴露(图16)。对NOG小鼠施用一次i.v.推注施用0.5mg/kg并于选定时间点采集血液样品用于药动学评估。使用一项通用免疫测定法来测量CD20TCB的总浓度。CD20TCB的标准曲线的校准范围为0.78至50ng/ml，其中15ng/ml是量化下限(LLOQ)。观察到两阶段下降，β半衰期为10天(非隔室分析)且清除率为8mL/d/kg(两隔室模型)。如预期的，半衰期和清除率与正常非靶向性IgG相当(表9)。使用来自PharsightLtd的Phoenixv6.2进行PK分析，建模和模拟。表9。在NOG小鼠中i.v.推注施用0.5mg/kgCD20TCB的药动学参数。半衰期10天清除率7.9mL/d/kgCmax9.4ug/mLAUC1554h*ug/mL抗CD20/抗CD3TCB的体内B细胞消减活性在完全人源化NOD/Shi-scid/IL-2Rγ无效(NOG)小鼠中测试CD20TCB的外周B细胞消减活性。一周一次以静脉内(i.v.)施用0.5mg/kg的剂量用媒介(n＝7)或CD20TCB(n＝6)处理14周龄的携带生理水平的循环人B和T细胞的完全人源化NOG小鼠(HayakawaJ.etal.(2009),StemCells27(1),175-182)。如图17中的研究设计上所示，在第一次治疗性注射后1和3天(D1，D3)和第二次后3天(D10)(在该时间点终止研究)对小鼠采血用于B细胞和T细胞分析。在后一个时间点，还收获脾用于B细胞和T细胞分析。作为基线参照，在治疗性注射前4天(D-4)对小鼠筛选循环B和T细胞计数。图18显示通过离体流式细胞术分析的不同时间点时用媒介(左边小图)和CD20TCB(右边小图)处理的小鼠的血液中的B和T细胞计数。结果证明循环B细胞在CD20TCB注射后1天早就得到非常有效地消减，而且它们的数目在整个研究期间保持检测不到。相反，循环T细胞计数只是在治疗性注射后D1时瞬时下降，在D3时回到基线水平，并在整个研究期间保持稳定。借助使用不同T细胞表面标志物和增殖标志物Ki67的离体流式细胞术，还在第一次治疗性注射后D3和D10时分析经处理小鼠的血液中的T细胞活化状态(图19)。来自经CD20TCB处理小鼠的T细胞在治疗性注射后D3时显示活化表型(上部小图)，在CD4和CD8T细胞隔室二者中活化标志物CD25，4-1BB，PD-1和粒酶B(GZB)与来自媒介对照的T细胞相比上调。来自经处理小鼠的T细胞还表达更高水平的增殖标志物Ki67。在第一次治疗性注射后D10时，大多数T细胞活化标志物回到了基线水平，GZB和PD-1除外，它们仍然以与媒介对照相比要高的水平表达。图20显示研究终止(D10)时对用媒介和CD20TCB处理的小鼠的脾进行的B细胞和T细胞分析的结果。CD20TCB处理在这种次级淋巴器官中也介导非常有效的B细胞消减(图20A)，而T细胞计数显示与媒介对照相当的水平(图20B)。T细胞活化状态(图20C)与在血液中观察到的相似，经处理小鼠的脾T细胞中的GZB和PD-1表达与媒介对照相比要高。这些结果一起证明CD20TCB处理能在疗法注射后1天早就介导非常有效的外周B细胞消减，B细胞直至研究终止(第二次治疗性注射后3天)保持检测不到。在经处理小鼠的脾中，B细胞也得到有效消减。在经处理动物的血液中，B细胞消减活性伴有瞬时T细胞活化，在治疗性注射后3天回到基线水平，GZB和PD-1活化标志物除外，它们保持以与未处理对照相比要高的水平表达。抗CD20/抗CD3TCB在WSU-DLCL2模型中的抗肿瘤活性在携带人弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系WSU-DLCL2并转移有人外周单个核细胞(PBMC)的NOG小鼠中测试CD20TCB的抗肿瘤活性。简言之，对雌性NOG小鼠皮下(s.c.)注射1.5x106个WSU-DLCL2细胞(最初得自欧洲细胞培养物保藏中心)。当平均肿瘤体积达到200mm3时，小鼠接受腹膜内注射人PBMC(10x106个细胞/小鼠)作为人T细胞的来源。2天后，小鼠以一周一次施用0.5mg/kg的剂量接受CD20TCB疗法i.v.。如图21中所绘，CD20TCB显示有力的抗肿瘤活性，在研究终止时(第34天)观察到几乎完全肿瘤消退。实施例2有和无电荷修饰的“2+1IgGCrossFab，倒转的”T细胞双特异性抗体(抗BCMA/抗CD3)的制备在这个实施例中制备的分子的示意图显示于图22。无电荷修饰的抗BCMA/抗CD3“2+1IgGCrossFab，倒转的”分子(在这个实施例中称作“83A10-TCB”)包含SEQIDNO22-25的氨基酸序列，有电荷修饰的抗BCMA/抗CD3“2+1IgGCrossFab，倒转的”分子(在这个实施例中称作“83A10-TCBcv”)包含SEQIDNO26-29的氨基酸序列。对于BCMAxCD3双特异性抗体载体的生成，IgG1衍生的双特异性分子由能够特异性结合两种不同抗原测定簇CD3和BCMA的至少两个抗原结合模块组成。该抗原结合模块是由重和轻链构成的Fab片段，每条链包含可变和恒定区。该Fab片段中至少一个是“CrossFab”片段，其中VH和VL是交换的。Fab片段内VH和VL的交换确保不同特异性的Fab片段不具有相同的域布局。双特异性分子设计对于CD3是单价的且对于BCMA是二价的，其中一个Fab片段融合至内部CrossFab的N端(2+1)。双特异性分子含有Fc部分使得该分子具有更长的半衰期。通过使用聚乙烯亚胺(PEI)用哺乳动物表达载体共转染悬浮生长的HEK293EBNA细胞来生成该分子。对于制备2+1CrossFab-IgG构建物，用相应的表达载体以1:2:1:1比率(“载体Fc(节)”:“载体轻链”:“载体轻链CrossFab”:“载体重链-CrossFab”)转染细胞。对于双特异性抗体，在一个结合臂“CrossFab”中引入替换/交换明显减少副产物但制备物并非完全不含副产物(详细记载于WO2009/080252和Schaefer,W.etal,PNAS,108(2011)11187-1191)。如此，为了进一步减少由针对第一抗原的轻链与错误的针对第二抗原的重链错配引起的副产物及提高双特异性抗体的产量，通过在CH1和CL域中的特定氨基酸位置处引入带有相反电荷的带电荷的氨基酸的替代，将另一种办法应用于该分子，在a)下的第一轻链的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个优选的实施方案中，用赖氨酸(K)，精氨酸(R)独立替代)，且其中在a)下的第一重链的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat)；或ii)在第二轻链b)下的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)(在一个优选的实施方案中，用赖氨酸(K)，精氨酸(R)独立替代)，且其中在第二重链b)下的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照Kabat)。对于双特异性抗体的生成，通过悬浮培养的HEK293-EBNA细胞中使用聚乙烯亚胺(PEI)的相应哺乳动物表达载体的瞬时共转染来表达双特异性抗体。转染前1天，在补充有6mML-谷氨酰胺的Excell培养基中以1.5x106个可存活细胞/mL接种HEK293-EBNA细胞。对于每mL最终的生产体积，将2.0x106个可存活细胞离心(5分钟，210xg)。吸出上清液并在100μLCDCHO培养基中重悬浮细胞。通过在100μLCDCHO培养基中混合1μgDNA(比率重链:修饰重链:轻链:修饰轻链＝1:1:2:1)来制备用于每mL最终的生产体积的DNA。添加0.27μLPEI溶液(1mg/mL)后，将混合物漩涡震荡15秒并于室温静置10分钟。10分钟后，将重悬浮的细胞和DNA/PEI混合物放到一起，然后转移入放置在摇动装置(37℃，5％CO2)中的适宜容器。3小时温育时间后，对每mL最终的生产体积添加800μL补充有6mML-谷氨酰胺，1.25mM丙戊酸和12.5％Pepsoy(50g/L)的Excell培养基。24小时后，对每mL最终的生产体积添加70μL补料(SF40，Lonza)。7天后或当细胞存活力等于或低于70％时，通过离心和无菌过滤将细胞与上清液分开。通过一个亲和步骤和一个或两个精制(polishing)步骤(为阳离子交换层析和大小排阻层析)纯化抗体。在需要时，使用一个附加的精制步骤。对于亲和步骤，将上清液加载到用6CV20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，pH7.5平衡的蛋白A柱(HiTrap蛋白AFF，5mL，GEHealthcare)上。在一个用相同缓冲液进行的清洗步骤后，用20mM磷酸钠，100mM氯化钠，100mM甘氨酸，pH3.0通过阶梯洗脱自柱洗脱抗体。立即用0.5M磷酸钠，pH8.0(1:10)中和具有期望抗体的级分，合并并通过离心浓缩。将浓缩液无菌过滤并通过阳离子交换层析和/或大小排阻层析进一步加工。对于阳离子交换层析步骤，用用于亲和步骤的洗脱缓冲液1:10稀释经过浓缩的蛋白质并加载到阳离子交换柱(Poros50HS，AppliedBiosystems)上。在分别用平衡缓冲液和清洗缓冲液(20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，20mMTRIS，pH5.0和20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，20mMTRIS，100mM氯化钠pH5.0)进行的两个清洗步骤之后，用使用20mM磷酸钠，20mM柠檬酸钠，20mMTRIS，100mM氯化钠pH8.5的梯度洗脱蛋白质。合并含有期望抗体的级分，通过离心浓缩，无菌过滤并通过大小排阻步骤进一步加工。对于大小排阻步骤，将经过浓缩的蛋白质注射到XK16/60HiLoadSuperdex200柱(GEHealthcare)中，而且有或无Tween20的20mM组氨酸，140mM氯化钠，pH6.0作为配制缓冲液。合并含有单体的级分，通过离心浓缩并无菌过滤入无菌管形瓶。通过测量280nm处的吸光度进行抗体浓度的测定，其中使用抗体的0.1％溶液的吸光度的理论值。此值基于氨基酸序列且由GPMAW软件(Lighthouse数据)计算。在25mM磷酸钾，125mM氯化钠，200mML-精氨酸单氢氯化物，0.02％(w/v)叠氮化钠，pH6.7缓冲液中分别通过CE-SDS(CaliperLabChipGXII系统(CaliperLifeSciences))和HPLC(TSKgelG3000SWXL分析性大小排阻柱(Tosoh))测定最终的蛋白质制备物的纯度和单体含量。为了验证最终的蛋白质制备物的分子量及确认最终的蛋白质溶液中分子的同质制备，使用液相层析-质谱术(LC-MS)。首先实施去糖基化步骤。为了去除由碳水化合物引入的异质性，用PNGaseF(ProZyme)处理构建物。因此，通过对浓度为0.5mg/ml的20μg蛋白质添加2μl2MTris将蛋白质溶液的pH调节至pH7.0。添加0.8μgPNGaseF并于37℃温育12小时。然后实施LC-MS线上检测。在偶联TOF6441质谱仪(Agilent)的AgilentHPLC1200上实施LC-MS方法。在MachereyNagel聚苯乙烯柱；RP1000-8(8μm粒径，4.6x250mm；产品目录号719510)上实施层析分离。洗脱液A为水中的5％乙腈和0.05％(v/v)甲酸，洗脱液B为95％乙腈，5％水和0.05％甲酸。流速为1ml/min，于40℃用6μg(15μl)之前所述处理获得的蛋白质样品实施分离。时间(分)％B0.515106012.510014.510014.615161516.1100在头4分钟期间，将洗脱液引导入废液中以保护质谱仪免于盐污染。以干燥气流12l/min，温度350℃和雾化器压力60psi运行ESI源。以阳离子模式使用碎裂电压380V和质量范围700至3200m/z获取MS谱。由仪器软件获取MS数据4至17分钟。图23描绘不同纯化方法后83A10-TCB和83A10-TCBcv抗体的最终的蛋白质制备物的CE-SDS(非还原的)图。蛋白A(PA)亲和层析和大小排阻层析(SEC)纯化步骤应用于83A10-TCB抗体导致<30％的纯度和82.8％的单体含量(A)。当将附加的纯化步骤(包括阳离子交换层析(cIEX)和最终的大小排阻层析(re-SEC)步骤)应用于(A)中的最终的蛋白质制备物时，纯度提高至93.4％但单体含量保持相同且产量显著降低至0.42mg/L。然而，当将特定电荷修饰应用于83A10抗BCMAFabCL-CH1时，即83A10-TCBcv抗体，甚至在应用PA+cIEX+SEC纯化步骤时(C)就能观察到卓越的TCB分子生产/纯化概况(表现为95.3％的纯度，100％的单体含量和高至3.3mg/L的产量)，比较而言，(B)具有显示低7.9倍的产量和低17.2％的单体含量的生产/纯化概况，尽管包括附加的re-SEC纯化步骤。然后进行头-对-头生产运行以比较83A10-TCB对83A10-TCBcv抗体的生产/纯化概况以进一步评估CL-CH1电荷修饰应用于该抗体的优势。如图24中所绘，并行测量并比较了83A10-TCB和83A10-TCBcv抗体在每个纯化步骤1)仅PA亲和层析(A，B)，2)PA亲和层析，然后是SEC(C，D)和3)PA亲和层析，然后是SEC，然后是cIEX和re-SEC(E，F)之后的特性。83A10-TCB和83A10-TCBcv抗体在各自纯化方法之后最终的蛋白质溶液的CE-SDS(非还原的)图展现于图24。如图24A和24B中所示，在仅通过PA亲和层析纯化之后就观察到将电荷变体应用于TCB抗体的改善。在这项头-对-头研究中，将PA亲和层析纯化步骤应用于83A10-TCB抗体导致61.3％的纯度，26.2mg/L的产量和63.7％的单体含量(24A)。比较而言，当通过PA亲和层析纯化83A10-TCBcv抗体时，所有特性得到改善，更好的纯度81.0％，更好的产量51.5mg/L和单体含量68.2％(24B)。当将附加的SEC纯化步骤应用于最终的蛋白质制备物时，如图24A和24B中看到的，83A10-TCB得到69.5％的纯度，14.1mg/L的产量和74.7％的单体含量，比较而言，83A10-TCBcv具有改善的纯度和单体含量，分别升高至91.0％和83.9％，和10.3mg/L的产量。虽然在这项特定实验中83A10-TCBcv的产量比83A10-TCB略微较低(即低27％)，但是83A10-TCBcv的正确分子的百分比比83A10-TCB好得多，分别为90％与40-60％，如通过LC-MS测量。在第三项头-对-头比较中，合并来自图24C和24D的83A10-TCB和83A10-TCBcv最终的蛋白质制备物与大约1L(等体积)来自另一个纯化批次(相同的生产)的在仅PA亲和层析纯化步骤之后各自的最终的蛋白质制备物。然后通过cIEX和SEC纯化方法进一步纯化合并的蛋白质制备物。如图24E和24F中所绘，在与无电荷变体的TCB抗体相比时一贯观察到具有电荷变体的TCB抗体的生产/纯化概况的改善。在使用数个步骤的纯化方法(即PA+/-SEC+cIEX+SEC)来纯化83A10-TCB抗体之后，只达到了43.1％纯度，而且能实现98.3％单体含量，但是付出了产量的代价，其降低至0.43mg/L。通过LC-MS测量的正确分子的百分比仍然较差，为60-70％。最后，最终的蛋白质制备物的质量对于体外使用不是可接受的。完全相反，当相同的多个纯化步骤以相同的次序应用于83A10-TCBcv抗体时，达到了96.2％纯度和98.9％单体含量以及95％正确分子(如通过LC-MS测量的)。然而，产量也在cIEX纯化步骤之后大大降低至0.64mg/L。结果显示，用83A10-TCBcv抗体只在两个标准纯化步骤即PA亲和层析和SEC之后就能实现更好的纯度，更高的单体含量，更高百分比的正确分子和更好的产量(图24D)，而用83A10-TCB甚至在应用附加的纯化步骤时也无法实现此类特性(图24E)。表10汇总83A10-TCB与83A10-TCVcv相比在PA纯化步骤之后的特性。表11汇总83A10-TCB与83A10-TCVcv相比在PA和SEC纯化步骤之后的特性。表12汇总83A10-TCB与83A10-TCVcv相比在PA和SEC加单独的PA，然后是cIEX和re-SEC纯化步骤之后的特性。对于表10至12，粗体数值突显83A10-TCB与83A10-TCVcv之间相比的卓越特性。除一个(可能不具有代表性)例外，来自3项头-对-头比较实验的所有生产/纯化参数和数值均为83A10-TCBcv优于83A10-TCB。总体结果明显证明，生产/纯化特征中的优势能通过将CL-CH1电荷修饰应用于TCB抗体来实现，而且只需要两个纯化步骤(即PA亲和层析和SEC)就能实现具有很好的可开发性特性的高质量蛋白质制备物。表10。抗BCMA/抗CD3T细胞双特异性抗体在蛋白A亲和层析纯化步骤之后的生产/纯化概况。83A10-TCB83A10-TCBcv纯度(％)61.381.0产量(mg/L)26.251.5量(mg)24.350.2单体(％)63.768.2通过LC-MS，正确分子(％)n.d.n.d表11。抗BCMA/抗CD3T细胞双特异性抗体在蛋白A亲和层析和大小排阻层析纯化步骤之后的生产/纯化概况。83A10-TCB83A10-TCBcv纯度(％)69.591.0产量(mg/L)14.110.3量(mg)13.110.0单体(％)74.783.9通过LC-MS，正确分子(％)40-6090表12。抗BCMA/抗CD3T细胞双特异性抗体在1.a)蛋白A亲和层析和大小排阻层析和1.b)仅蛋白A亲和层析，合并到一起，然后2)阳离子交换层析和3)最终的大小排阻层析纯化步骤之后的生产/纯化概况。83A10-TCB83A10-TCBcv纯度(％)43.196.2产量(mg/L)0.430.64量(mg)0.731.27单体(％)98.398.9通过LC-MS，正确分子(％)60-70％>95％抗BCMA/抗CD3T细胞双特异性抗体对BCMA阳性多发性骨髓瘤细胞系的结合(流式细胞术)通过流式细胞术对抗BCMA/抗CD3TCB抗体(83A10-TCB，13A4-TCBcv)分析对表达BCMA的NCI-H929细胞(CRL-9068TM)上的人BCMA的结合。使用MKN45(不表达BCMA的人胃腺癌细胞系)作为阴性对照。简言之，收获培养的细胞，计数并使用Vicell评估细胞存活力。然后在含有BSA的FACS染色缓冲液(BDBiosciences)中将可存活细胞调节至2x106细胞/ml。进一步将100μl/孔此细胞悬浮液等分入圆底96孔板并与30μl抗BCMA抗体或对应IgG对照一起于4℃温育30分钟。滴定所有抗BCMA/抗CD3TCB抗体(和TCB对照)并在1–300nM的终浓度范围中分析。然后将细胞离心(5分钟，350xg)，用120μl/孔FACS染色缓冲液(BDBiosciences)清洗，重悬浮并与荧光染料缀合的PE缀合的AffiniPureF(ab’)2片段山羊抗人IgGFc片段特异性的(JacksonImmunoResearchLab；109-116-170)一起于4℃再温育30分钟。然后用染色缓冲液(BDBiosciences)清洗细胞两次，使用100μl/孔BD固定缓冲液(#BDBiosciences，554655)于4℃固定20分钟，在120μlFACS缓冲液中重悬浮并使用BDFACSCantoII分析。如图25中所绘，将抗BCMA/抗CD3TCB抗体的均值荧光强度以抗体浓度的函数绘图；(A)83A10-TCB对H929细胞和MKN45细胞，(B)83A10-TCBcv对H929细胞和MKN45细胞。在适用时，使用PrismGraphPad(LaJolla，CA，USA)计算EC50，并且表示达到83A10-TCB和83A10-TCBcv结合H929细胞的最大结合的50％需要的抗体浓度的EC50值汇总于表13。图25C显示了83A10-TCB和83A10-TCBcv以浓度依赖性方式及相似的效力结合H929细胞。此类结果符合预期，因为83A10-TCB和83A10-TCBcv分子在各自的VL和VH可变域上分享相同的CDR序列。DP47-TCB对照抗体不结合BCMA阳性H929骨髓瘤细胞，如通过中值荧光强度升高缺失测量的。在第二项头-对-头比较实验中，对83A10-TCB和83A10-TCBcv评估对BCMA阳性H929细胞的结合和对BCMA/CD3阴性MKN45细胞的结合的缺失。如图25D中所绘，83A10-TCB和83A10-TCBcv以浓度依赖性方式及相似的效力结合BCMA阳性H929细胞。此第二项实验中83A10-TCB和83A10-TCBcv结合H929细胞的EC50值汇总于表14。表13。抗BCMA/抗CD3TCB抗体结合H929细胞的EC50值(实验1).抗BCMA/抗CD3TCB分子EC50(nM)EC50(μg/ml)83A10-TCB9.81.983A10-TCBcv14.52.8表14。抗BCMA/抗CD3TCB抗体结合H929细胞的EC50值(实验2).抗BCMA/抗CD3TCB分子EC50(nM)EC50(μg/ml)83A10-TCB16.93.2583A10-TCBcv14.52.8由抗BCMA/抗CD3T细胞双特异性抗体诱导的对高表达BCMA的H929骨髓瘤细胞的重定向T细胞细胞毒性(LDH释放测定法)还对抗BCMA/抗CD3TCB抗体分析它们在高表达BCMA的骨髓瘤细胞中在经由抗原结合模块对细胞上的BCMA的结合的构建物交联后诱导T细胞介导的凋亡的潜力。简言之，用细胞解离缓冲液收获表达人BCMA的H929多发性骨髓瘤靶细胞，清洗并在补充有10％胎牛血清(Invitrogen)的RPMI中重悬浮。在圆底96孔板中分配大约30,000个细胞/孔并添加抗体构建物各自的稀释液达到期望的终浓度(一式三份)；终浓度范围为0.1pM至10nM。为了适当的比较，将所有TCB构建物和对照调节至相同的摩尔浓度。将人总T细胞(效应)添加入孔以获得5:1的最终效应:靶(E:T)比。当使用人PBMC作为效应细胞时，使用10:1的最终E:T比。阴性对照组只以效应或靶细胞代表。作为人泛T细胞活化的阳性对照，使用1μg/mlPHA-M(Sigma#L8902)。对于标准化，通过将靶细胞与终浓度1％TritonX-100一起温育，诱导细胞死亡来测定H929MM靶细胞的最大裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)以只与效应细胞共温育的靶细胞代表，即没有任何T细胞双特异性抗体。于37℃，5％CO2温育20-24小时后，用LDH检测试剂盒(RocheAppliedScience)遵循制造商的说明书测量由凋亡/坏死骨髓瘤靶细胞释放入上清液的LDH。在浓度-响应曲线中将LDH释放百分比针对抗BCMA/抗CD3T细胞双特异性抗体的浓度绘图。在适用时，作为导致最大LDH释放的50％时的TCB抗体浓度，使用Prism软件(GraphPad)测量并测定EC50值。如图26中所示，抗BCMA/抗CD3TCB抗体((A,B)83A10-TCB，(C,D)83A10-TCBcv)诱导浓度依赖性的对BCMA阳性H929骨髓瘤细胞的杀伤，如通过LDH释放测量的。对H929细胞的杀伤是特异性的，因为不结合BCMA阳性靶细胞的DP47-TCB对照抗体甚至在1nM的最高浓度也没有诱导LDH释放(A)。尽管使用Prism(GraphPad)统计软件无法测量83A10-TCB(A，B)和83A10-TCBcv(C，实验1)的EC50值，然而能大致估算不带电荷的和带电荷的TCB分子二者的EC50值的量级为低皮摩尔范围效力。在第二项实验中，在重定向T细胞杀伤测定法中评估83A10-TCBcv的效果并能测量EC50值为1.5pM。作者不能排除略微更低的EC50值(略微更好的效力)可能是由于血液供体变异性。然而，杀伤H929细胞的效力的量级无疑在低皮摩尔范围中。总体结果提示83A10-TCB(无电荷变体)与83A10-TCBcv(有电荷变体)在基于细胞的测定法中显示相似的生物学特性。表15。由抗BCMA/抗CD3TCB抗体诱导的对H929细胞的重定向T细胞杀伤的EC50值和评估。抗BCMA/抗CD3TCB分子EC50(pM)EC50(μg/ml)83A10-TCB(实验1)低pM范围(大约<20)一位数83A10-TCB(实验2)低pM范围(大约<20)一位数83A10-TCBcv(实验1)低pM范围(大约<20)一位数83A10-TCBcv(实验2)1.50.3实施例3有电荷修饰的“2+1IgGCrossFab，倒转的”T细胞双特异性抗体(抗Her2/抗CD3)和有电荷修饰的“2+1IgGCrossFab”T细胞双特异性抗体(抗Her3/抗CD3)的制备在这个实施例中制备的分子的示意图显示于图27。有电荷修饰的抗Her2/抗CD3“2+1IgGCrossFab，倒转的”分子(在这个实施例中称作“Her2TCB”)包含SEQIDNO21，52，53和54的氨基酸序列。有电荷修饰的抗Her3/抗CD3“2+1IgGCrossFab”分子(在这个实施例中称作“Her3TCB”)包含SEQIDNO21，55，56和57的氨基酸序列。如上文实施例1中所述(用单个制备性SEC步骤)制备，纯化并分析该分子。两种分子均能以较高的最终质量纯化，如通过分析性大小排阻层析和CE-SDS显示的(表16，17)。虽然此次制备中Her2TCB的回收率比Her3TCB要低，但是该蛋白质在两个纯化步骤(蛋白A和SEC)之后几乎是纯的。CE-SDS分析只显示1.18％大约164kDa处的低分子量杂质(表17)。于187.28kDa处检测到的种类对应于没有Fc域上的N连接的糖基化的靶分子(通常对人IgG1在真核细胞中生成后通过CE-SDS检测到此种类)。Her3TCB能以较好的回收率纯化。比较最终的单体含量，最终的质量优于Her2TCB。还有，CE-SDS显示100％靶蛋白质，假定于192.05kDa处检测到的峰对应于非糖基化的Fc种类。对于这两种制备物，通过CE-SDS或分析性大小排阻层析没有检测到产物相关低分子量杂质，诸如游离轻链(预期分子量在25kDa处)，二聚化轻链(可通过只在一条轻链上引入CH1-CL交换而发生)(预期分子量在50kDa处)或缺失轻链或具有非共价连接的轻链的分子(预期分子量在125kDa，150kDa或175kDa处)。表16。有电荷修饰的抗Her2/抗CD3和抗Her3/抗CD3TCB分子的生产和纯化的汇总。表17。有电荷修饰的抗Her2/抗CD3和抗Her3/抗CD3TCB分子的CE-SDS分析(非还原的)。分子峰编号大小[kDa]纯度[％]Her2TCB1163.991.182187.281.303200.8197.52Her3TCB1192.0519.362198.5780.64Her2TCB和Her3TCB对细胞的结合收获Jurkat悬浮细胞，用FACS缓冲液(PBS+0.1％BSA)清洗一次并通过Vicell测定存活力。用细胞解离缓冲液(GibcoInvitrogen)收获贴壁KPL-4肿瘤细胞(由J.Kurebayashi，KawasakiMedicalSchool，Japan馈赠)并用FACS缓冲液清洗一次，之后通过Vicell测定存活力。在圆底96孔板的每个孔中分配0.2x106个细胞并将板以400xg离心4分钟。然后对细胞添加25μl/孔FACS缓冲液中的TCB稀释液。将细胞在冰箱中温育30分钟。之后用150μl/孔FACS缓冲液清洗细胞两次。添加25μl/孔适当稀释的二抗(FITC缀合的AffiniPureF(ab′)2片段，山羊抗人IgG，F(ab′)2片段特异性的，JacksonImmunoResearch)并进一步将板在黑暗中于4℃染色30分钟。用150μl/孔FACS缓冲液清洗板两次并在150μlFACS缓冲液中重悬浮。使用配备有FACSDiva软件的BDFACSCantoII实施分析。将中值荧光值(MFI)针对TCB分子的浓度绘图。如图29中所示，两种TCB均显示较好的对它们各自的在细胞上的靶抗原的浓度依赖性结合。由Her3TCB诱导的，T细胞介导的人肿瘤细胞裂解后，人CD8+T效应细胞的活化使用效应-对-靶比率(E:T)10:1和温育时间48小时，对经典肿瘤细胞裂解实验(如下所述)中CD8+T效应细胞及Her3TCB评估CD69阳性细胞的百分比。简言之，温育后，将PBMC转移至圆底96孔板，以350xg离心5分钟并用含有0.1％BSA的PBS清洗两次。依照供应商的说明书实施针对CD8(Biolegend#300908)和CD69(BioLegend#310904)的表面染色。用150μl/孔含有0.1％BSA的PBS清洗细胞两次并使用100μl/孔1％PFA于4℃固定20分钟。离心后，在200μl/孔PBS0.1％BSA中重悬浮样品并在FACSCantoII(FACSDiva软件)上分析。如图30中所示，Her3TCB经由它各自的靶向模块诱导T细胞和肿瘤细胞(KPL-4)交联并以浓度依赖性方式诱导T细胞活化。Jurkat-NFAT活化测定法使用肿瘤抗原阳性靶细胞(KPL-4)和Jurkat-NFAT报告细胞(一种具有NFAT启动子的表达CD3的人急性淋巴细胞白血病报告细胞系，GloResponseJurkatNFAT-RE-luc2P，Promega#CS176501)的共培养物评估Her2TCB和Her3TCB诱导T细胞交联和后续T细胞活化的能力。一旦TCB分子同时结合人Her2或人Her3抗原(在肿瘤细胞上表达的)和CD3抗原(在Jurkat-NFAT报告细胞上表达的)，NFAT启动子被激活并导致有活性的萤火虫萤光素酶表达。发光信号的强度(添加萤光素酶底物后获得的)与CD3活化和信号传导的强度成比例。为了该测定法，用细胞解离缓冲液(GibcoInvitrogen)收获KPL-4人肿瘤细胞并使用Vicell测定存活力。在平底，白壁96孔板(Greinerbio-one)中分配20000个细胞/孔并添加稀释的TCB或培养基(作为对照)。随后，收获Jurkat-NFAT报告细胞并使用Vicell评估存活力。在细胞培养基中重悬浮细胞并添加至肿瘤细胞以获得2.5:1(对于Her2TCB)或5:1(对于Her3TCB)的最终的E:T(如标示的)，和100μl/孔的终体积。将细胞在增湿温箱中于37℃温育5小时。温育时间结束时，将100μl/孔ONE-Glo溶液(Promega，#E6120)(1:1ONE-Glo和测定法培养基体积/孔)添加至孔并在黑暗中于室温温育10分钟。使用WALLACVictor3ELISA读数仪(PerkinElmer2030)检测发光，以5秒/孔作为检测时间。如图31中所绘，两种TCB分子均诱导经由CD3的T细胞交联和后续T细胞活化。Her3TCB对KPL-4细胞略微更加有力，这可以通过这些靶细胞上Her3的水平比Her2要高来解释。由Her2TCB和Her3TCB诱导的肿瘤细胞裂解使用人外周血单个核细胞(PBMC)作为效应器于10:1的E:T评估由各自的TCB分子诱导的表达Her2或Her3的肿瘤靶细胞的肿瘤细胞裂解。如标示的，通过测量与TCB一起温育24小时和48小时后释放入上清液的LDH来测定肿瘤细胞裂解。自新鲜血液或血沉棕黄层分离人PBMC。简言之，用PBS2:1(新鲜血液)或3:1(血沉棕黄层)稀释血液。将约30ml血液/PBS混合物在15mlHistopaque(Sigma)上分层并在无制动的情况下于RT以450xg离心30分钟。用10ml移液器收集淋巴细胞入装有PBS的50ml管。用PBS装填管至50ml并以350xg离心10分钟。丢弃上清液，在50mlPBS中重悬浮团粒并以300xg离心10分钟。将清洗步骤重复一次。在含有10％FCS和1％GlutaMax(LifeTechnologies)的RPMI中重悬浮细胞并在温箱中保存于37℃，5％CO2直至测定法开始(不超过24小时)。简言之，用胰蛋白酶/EDTA收获靶细胞，清洗，并以30000个细胞/孔的密度分配，使用平底96孔板。让细胞在增湿温箱中贴壁过夜。在测定那天，将测定板以350xg离心5分钟并吸出培养基。添加100μl/孔测定培养基。以所示浓度(范围为对于Her3TCB的0.001pM–1nM，和对于Her2TCB的0.01pM–100nM，一式三份)添加TCB。以最终的E:T比为10:1将PBMC添加至靶细胞。温育24小时和48小时后通过量化由凋亡/坏死细胞释放入细胞上清液的LDH(乳酸脱氢酶)(LDH检测试剂盒，RocheAppliedScience，#11644793001)来评估靶细胞杀伤。通过将靶细胞与1％TritonX-100一起温育来实现最大靶细胞裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)指在没有双特异性抗体的情况下与效应细胞共温育的靶细胞。使用GraphPadPrism5计算EC50值。在另一项实验中，通过在微量板读数仪中测量发光(5s/孔读数时间)，通过6.5小时后的胱天蛋白酶3/7活性来测定肿瘤细胞裂解。对于胱天蛋白酶3/7活性的测定，如上所述收获KPL-4-胱天蛋白酶-3/7GloSensor靶细胞(用GloSensor质粒稳定转染的KPL-4细胞)。用PBS清洗一次后，在测定培养基(RPMI1640，2％FCS，1％Glutamax)中将浓度调节至0.3x106个细胞/ml并与2％v/vGloSensorcAMP试剂(Promega)混合。将100μl(＝30000个细胞)此靶细胞悬浮液转移入具有白壁的96平底板的每个孔。如上所述，通过自健康人供体获得的经过富集的淋巴细胞制备物(血沉棕黄层)的Histopaque密度离心制备外周血单个核细胞(PBMC)。基本上如上所述实施肿瘤细胞裂解测定法。图32C和图33中所绘结果图示了Her3TCB分子诱导有力的且浓度依赖性的KPL-4肿瘤细胞凋亡和裂解。Her2TCB亦如此，其描绘于图32A和B且显示显著的，浓度依赖性的肿瘤细胞随时间的裂解。由此，杀伤的EC50看来依赖于各自靶细胞上Her2的表达水平。表达水平越高，Her2TCB所致肿瘤细胞杀伤越好。实施例4有和无电荷修饰的“(Fab)2-CrossFab”T细胞双特异性抗体(抗MCSP/抗CD3)的制备在这个实施例中制备的分子的示意图显示于图34。MCSP结合物中有电荷修饰的抗MCSP/抗CD3“(Fab)2-CrossFab”分子(在这个实施例中称作“(Fab)2-XFab-LC007cv”)包含SEQIDNO58，59和60的氨基酸序列。无电荷修饰的抗MCSP/抗CD3“(Fab)2-CrossFab”分子(在这个实施例至称作“(Fab)2-XFab”)包含无电荷修饰的相应氨基酸序列。基本上如上文实施例1中所述，加以下述适应，制备，纯化并分析该分子。对于这些分子的生成，用相应的表达载体以1:2:1比率(“载体重链”:“载体轻链抗MSCPFab”:“载体轻链抗CD3Fab”)转染HEK293-EBNA细胞。如实施例1中所述基于pH8.0时CH1域的部分对蛋白A的结合和自pH2.5的阶梯洗脱，通过蛋白A-HPLC测定培养液中构建物的浓度。通过亲和层析(其利用结合CH1的亲和层析)，继以大小排阻层析步骤自细胞培养物上清液纯化分泌的蛋白质。对于亲和层析，将上清液加载到用5ml50mMTris，100mM甘氨酸，150mMNaClpH8.0平衡的HiTrap卡帕Select柱(CV＝5mL，GEHealthcare)上。通过用至少10个柱体积的50mMTris，100mM甘氨酸，150mMNaClpH8.0清洗，去除未结合的蛋白质。在10个柱体积的到达50mMTris，100mM甘氨酸，150mMNaClpH2.0的梯度中洗脱靶蛋白质。通过添加1/40的2MTrispH8.0来中和蛋白质溶液。浓缩并过滤靶蛋白质，之后加载到用20mM组氨酸，140mM氯化钠，0.01％Tween-20，pH6.0平衡的HiLoadSuperdex200柱(GEHealthcare)上。遵循相同的方法生成并纯化这两种分子。与无电荷修饰的分子(“(Fab)2-XFab”)相比，有电荷的分子的滴度要低10倍。不过，两个抗MCSPFab中具有电荷修饰的分子(“(Fab)2-XFab-LC007cv”)的最终的回收率要高大约两倍(表18)。(Fab)2-XFab-LC007cv分子能纯化至最终的单体含量95.8％(如大小排阻层析显示的)和最终的纯度94.33％(如CE-SDS分析证明的)。表18。有和无电荷修饰的抗MCSP/抗CD3TCB分子的生产和纯化的汇总。表19。有电荷修饰的抗MCSP/抗CD3TCB分子的CE-SDS分析(非还原的)。有和无电荷修饰的“(Fab)2-CrossFab”T细胞双特异性抗体(抗MCSP/抗CD3)的细胞结合收获Jurkat-NFAT悬浮细胞，用FACS缓冲液(PBS+0.1％BSA)清洗一次并通过Vicell测定存活力。用细胞解离缓冲液(GibcoInvitrogen)收获贴壁MV-3肿瘤细胞并用FACS缓冲液清洗一次，之后通过Vicell测定存活力。在圆底96孔板的每个孔中分配0.2x106个细胞并将板以400xg离心4分钟。然后对细胞添加25μl/孔FACS缓冲液中的一抗稀释液。将细胞在冰箱中温育30分钟。之后用150μl/孔FACS缓冲液清洗细胞两次。添加25μl/孔稀释的二抗(FITC缀合的AffiniPureF(ab′)2片段，山羊抗人IgG，F(ab′)2片段特异性的，JacksonImmunoResearch)并进一步将板在黑暗中于4℃染色30分钟。用150μl/孔FACS缓冲液清洗板两次并在150μlFACS缓冲液中重悬浮。使用配备有FACSDiva软件的BDFACSCantoII实施分析。将中值荧光值(MFI)针对MCSPTCB分子的浓度绘图。如图36中所示，(Fab)2-XFAb-LC007cv分子显示对MV-3上的人MCSP和Jurkat细胞上的人CD3的浓度依赖性结合。无电荷修饰的(Fab)2-XFab分子显示与(Fab)2-XFAb-LC007cv相当的对人MCSP的结合((Fab)2-XFAb-LC007cv的EC50结合2.3nM对(Fab)2-XFab的EC501.5nM)。由有和无电荷修饰的“(Fab)2-CrossFab”T细胞双特异性抗体(抗MCSP/抗CD3)介导的肿瘤细胞裂解使用人PBMC作为效应器于10:1的E:T评估由MCSPTCB分子诱导的表达MCSP的MV-3肿瘤靶细胞的肿瘤细胞裂解。通过测量与TCB一起温育24小时和48小时后释放入上清液的LDH来测定肿瘤细胞裂解。简言之，用胰蛋白酶/EDTA收获靶细胞，清洗，并以25000个细胞/孔的密度分配，使用平底96孔板。让细胞在增湿温箱中贴壁过夜。在测定那天，将测定板以350xg离心5分钟并吸出培养基。添加100μl/孔测定培养基。自新鲜血液分离外周血单个核细胞(PBMC)。简言之，用PBS2:1稀释血液。将约30ml血液/PBS混合物在15mlHistopaque(Sigma)上分层并在无制动的情况下以450xg离心30分钟。用10ml移液器收集淋巴细胞入装有PBS的50ml管。用PBS装填管至50ml并以350xg离心10分钟。丢弃上清液，在50mlPBS中重悬浮团粒并以300xg离心10分钟。将清洗步骤重复一次。在含有10％FCS和1％GlutaMax(LifeTechnologies)的RPMI中重悬浮细胞并在温箱中保存于37℃，5％CO2直至测定法开始(不超过24小时)。对于杀伤测定法，以所示浓度(范围为0.04pM–10nM，一式三份)添加TCB分子。以最终的E:T比为10:1将PBMC添加至靶细胞。温育24小时和48小时后通过量化由凋亡/坏死细胞释放入细胞上清液的LDH(乳酸脱氢酶)(LDH检测试剂盒，RocheAppliedScience，#11644793001)来评估靶细胞杀伤。通过将靶细胞与1％TritonX-100一起温育来实现最大靶细胞裂解(＝100％)。最小裂解(＝0％)指在没有双特异性抗体的情况下与效应细胞共温育的靶细胞。使用GraphPadPrism5计算EC50值。如图37中所绘，两种分子都显示表达hMCSP的靶细胞的浓度依赖性裂解。(Fab)2-XFAb-LC007cv分子的效力(24小时后的EC50为2.8pM，而48小时后为8.6pM)与无电荷修饰的(Fab)2-XFab分子的效力(24小时后的EC50为5.9pM，而48小时后为4.8pM)相当。***尽管为了理解清楚的目的已经通过例示和实施例较为详细地描述了前述发明，但是该描述和实施例不应解释为限制本发明的范围。通过提述明确完整收录本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容。序列表<110>豪夫迈·罗氏有限公司（F.Hoffmann-LaRocheAG）<120>双特异性T细胞活化性抗原结合分子<130>P32209<150>EP14179764.7<151>2014-08-04<150>EP15170866.6<151>2015-06-05<160>73<170>PatentInversion3.5<210>1<211>207<212>PRT<213>人（Homosapiens）<400>1MetGlnSerGlyThrHisTrpArgValLeuGlyLeuCysLeuLeuSer151015ValGlyValTrpGlyGlnAspGlyAsnGluGluMetGlyGlyIleThr202530GlnThrProTyrLysValSerIleSerGlyThrThrValIleLeuThr354045CysProGlnTyrProGlySerGluIleLeuTrpGlnHisAsnAspLys505560AsnIleGlyGlyAspGluAspAspLysAsnIleGlySerAspGluAsp65707580HisLeuSerLeuLysGluPheSerGluLeuGluGlnSerGlyTyrTyr859095ValCysTyrProArgGlySerLysProGluAspAlaAsnPheTyrLeu100105110TyrLeuArgAlaArgValCysGluAsnCysMetGluMetAspValMet115120125SerValAlaThrIleValIleValAspIleCysIleThrGlyGlyLeu130135140LeuLeuLeuValTyrTyrTrpSerLysAsnArgLysAlaLysAlaLys145150155160ProValThrArgGlyAlaGlyAlaGlyGlyArgGlnArgGlyGlnAsn165170175LysGluArgProProProValProAsnProAspTyrGluProIleArg180185190LysGlyGlnArgAspLeuTyrSerGlyLeuAsnGlnArgArgIle195200205<210>2<211>198<212>PRT<213>食蟹猴（Macacafascicularis）<400>2MetGlnSerGlyThrArgTrpArgValLeuGlyLeuCysLeuLeuSer151015IleGlyValTrpGlyGlnAspGlyAsnGluGluMetGlySerIleThr202530GlnThrProTyrGlnValSerIleSerGlyThrThrValIleLeuThr354045CysSerGlnHisLeuGlySerGluAlaGlnTrpGlnHisAsnGlyLys505560AsnLysGluAspSerGlyAspArgLeuPheLeuProGluPheSerGlu65707580MetGluGlnSerGlyTyrTyrValCysTyrProArgGlySerAsnPro859095GluAspAlaSerHisHisLeuTyrLeuLysAlaArgValCysGluAsn100105110CysMetGluMetAspValMetAlaValAlaThrIleValIleValAsp115120125IleCysIleThrLeuGlyLeuLeuLeuLeuValTyrTyrTrpSerLys130135140AsnArgLysAlaLysAlaLysProValThrArgGlyAlaGlyAlaGly145150155160GlyArgGlnArgGlyGlnAsnLysGluArgProProProValProAsn165170175ProAspTyrGluProIleArgLysGlyGlnGlnAspLeuTyrSerGly180185190LeuAsnGlnArgArgIle195<210>3<211>125<212>PRT<213>人工序列<220><223>CD3VH<400>3GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerThrTyr202530AlaMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerArgIleArgSerLysTyrAsnAsnTyrAlaThrTyrTyrAlaAsp505560SerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAspSerLysAsnThr65707580LeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyr859095TyrCysValArgHisGlyAsnPheGlyAsnSerTyrValSerTrpPhe100105110AlaTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSer115120125<210>4<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>CD3HCDR1<400>4ThrTyrAlaMetAsn15<210>5<211>19<212>PRT<213>人工序列<220><223>CD3HCDR2<400>5ArgIleArgSerLysTyrAsnAsnTyrAlaThrTyrTyrAlaAspSer151015ValLysGly<210>6<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>CD3HCDR3<400>6HisGlyAsnPheGlyAsnSerTyrValSerTrpPheAlaTyr1510<210>7<211>109<212>PRT<213>人工序列<220><223>CD3VL<400>7GlnAlaValValThrGlnGluProSerLeuThrValSerProGlyGly151015ThrValThrLeuThrCysGlySerSerThrGlyAlaValThrThrSer202530AsnTyrAlaAsnTrpValGlnGluLysProGlyGlnAlaPheArgGly354045LeuIleGlyGlyThrAsnLysArgAlaProGlyThrProAlaArgPhe505560SerGlySerLeuLeuGlyGlyLysAlaAlaLeuThrLeuSerGlyAla65707580GlnProGluAspGluAlaGluTyrTyrCysAlaLeuTrpTyrSerAsn859095LeuTrpValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu100105<210>8<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>CD3LCDR1<400>8GlySerSerThrGlyAlaValThrThrSerAsnTyrAlaAsn1510<210>9<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>CD3LCDR2<400>9GlyThrAsnLysArgAlaPro15<210>10<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>CD3LCDR3<400>10AlaLeuTrpTyrSerAsnLeuTrpVal15<210>11<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>接头<400>11GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer1510<210>12<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>接头<400>12AspGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer1510<210>13<211>225<212>PRT<213>人（Homosapiens）<400>13AspLysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluLeuLeuGly151015GlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMet202530IleSerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHis354045GluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluVal505560HisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyr65707580ArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGly859095LysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProIle100105110GluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnVal115120125TyrThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGlnValSer130135140LeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGlu145150155160TrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProPro165170175ValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrVal180185190AspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMet195200205HisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSer210215220Pro225<210>14<211>690<212>PRT<213>人工序列<220><223>CD20VH-CH1-CD3VH-CL-Fc(节,P329GLALA)<400>14GlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlySer151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrAlaPheSerTyrSer202530TrpIleAsnTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyArgIlePheProGlyAspGlyAspThrAspTyrAsnGlyLysPhe505560LysGlyArgValThrIleThrAlaAspLysSerThrSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgAsnValPheAspGlyTyrTrpLeuValTyrTrpGlyGlnGly100105110ThrLeuValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSerValPhe115120125ProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeu130135140GlyCysLeuValLysAspTyrPheProGluProValThrValSerTrp145150155160AsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaValLeu165170175GlnSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValProSer180185190SerSerLeuGlyThrGlnThrTyrIleCysAsnValAsnHisLysPro195200205SerAsnThrLysValAspLysLysValGluProLysSerCysAspGly210215220GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGluValGlnLeuLeuGluSer225230235240GlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGlySerLeuArgLeuSerCysAla245250255AlaSerGlyPheThrPheSerThrTyrAlaMetAsnTrpValArgGln260265270AlaProGlyLysGlyLeuGluTrpValSerArgIleArgSerLysTyr275280285AsnAsnTyrAlaThrTyrTyrAlaAspSerValLysGlyArgPheThr290295300IleSerArgAspAspSerLysAsnThrLeuTyrLeuGlnMetAsnSer305310315320LeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCysValArgHisGlyAsn325330335PheGlyAsnSerTyrValSerTrpPheAlaTyrTrpGlyGlnGlyThr340345350LeuValThrValSerSerAlaSerValAlaAlaProSerValPheIle355360365PheProProSerAspGluGlnLeuLysSerGlyThrAlaSerValVal370375380CysLeuLeuAsnAsnPheTyrProArgGluAlaLysValGlnTrpLys385390395400ValAspAsnAlaLeuGlnSerGlyAsnSerGlnGluSerValThrGlu405410415GlnAspSerLysAspSerThrTyrSerLeuSerSerThrLeuThrLeu420425430SerLysAlaAspTyrGluLysHisLysValTyrAlaCysGluValThr435440445HisGlnGlyLeuSerSerProValThrLysSerPheAsnArgGlyGlu450455460CysAspLysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluAlaAla465470475480GlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeu485490495MetIleSerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSer500505510HisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGlu515520525ValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThr530535540TyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsn545550555560GlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuGlyAlaPro565570575IleGluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGln580585590ValTyrThrLeuProProCysArgAspGluLeuThrLysAsnGlnVal595600605SerLeuTrpCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaVal610615620GluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrPro625630635640ProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThr645650655ValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerVal660665670MetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeu675680685SerPro690<210>15<211>447<212>PRT<213>人工序列<220><223>CD20VH-CH1-Fc(穴,P329GLALA)<400>15GlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlySer151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrAlaPheSerTyrSer202530TrpIleAsnTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMet354045GlyArgIlePheProGlyAspGlyAspThrAspTyrAsnGlyLysPhe505560LysGlyArgValThrIleThrAlaAspLysSerThrSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgAsnValPheAspGlyTyrTrpLeuValTyrTrpGlyGlnGly100105110ThrLeuValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSerValPhe115120125ProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeu130135140GlyCysLeuValLysAspTyrPheProGluProValThrValSerTrp145150155160AsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaValLeu165170175GlnSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValProSer180185190SerSerLeuGlyThrGlnThrTyrIleCysAsnValAsnHisLysPro195200205SerAsnThrLysValAspLysLysValGluProLysSerCysAspLys210215220ThrHisThrCysProProCysProAlaProGluAlaAlaGlyGlyPro225230235240SerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetIleSer245250255ArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHisGluAsp260265270ProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHisAsn275280285AlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyrArgVal290295300ValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGlu305310315320TyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuGlyAlaProIleGluLys325330335ThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnValCysThr340345350LeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGlnValSerLeuSer355360365CysAlaValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGluTrpGlu370375380SerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProValLeu385390395400AspSerAspGlySerPhePheLeuValSerLysLeuThrValAspLys405410415SerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMetHisGlu420425430AlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSerPro435440445<210>16<211>214<212>PRT<213>人工序列<220><223>CD3VL-CH1<400>16GlnAlaValValThrGlnGluProSerLeuThrValSerProGlyGly151015ThrValThrLeuThrCysGlySerSerThrGlyAlaValThrThrSer202530AsnTyrAlaAsnTrpValGlnGluLysProGlyGlnAlaPheArgGly354045LeuIleGlyGlyThrAsnLysArgAlaProGlyThrProAlaArgPhe505560SerGlySerLeuLeuGlyGlyLysAlaAlaLeuThrLeuSerGlyAla65707580GlnProGluAspGluAlaGluTyrTyrCysAlaLeuTrpTyrSerAsn859095LeuTrpValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeuSerSerAla100105110SerThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProSerSerLysSer115120125ThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyrPhe130135140ProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGly145150155160ValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerSerGlyLeuTyrSerLeu165170175SerSerValValThrValProSerSerSerLeuGlyThrGlnThrTyr180185190IleCysAsnValAsnHisLysProSerAsnThrLysValAspLysLys195200205ValGluProLysSerCys210<210>17<211>219<212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