本发明属于生物技术药物领域，具体涉及一种肉食螨变应原制备方法。
背景技术：
过敏性疾病是当代社会中最常见的一种疾病，它是由广泛存在的过敏原引起的。据世界变态反应组织报告，全世界有30％～40％普通人被过敏问题困扰。世界卫生组织估计，全球约有3亿人患有哮喘，其中50％以上的成人和至少80％的儿童患者均由过敏因素诱发，每年约25万人死于哮喘。世界卫生组织已将变态反应性疾病列为21世纪重点防治的三大疾病之一。
近年来，过敏性疾病的发病率逐年在增加。伴随着过敏人群的增加，引起过敏的种类多种多样。螨是全球范围内最主要的过敏原，现在市售的螨变应原产品主要是户尘螨和粉尘螨相关的诊断、治疗等变应原产品。肉食螨以粉螨为食，在户尘螨、粉尘螨、粗脚粉螨、腐食酪螨等粉螨生长密集的地方往往能发现大量的肉食螨滋生。因此当肉食螨过敏的病人接触到肉食螨的排泄物、皮屑、被肉食螨染污的食物等，会引起过敏。由于缺少肉食螨变应原无法进行对肉食螨过敏病人的诊断和治疗。未见有肉食螨变应原的报道。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供了一种肉食螨变应原的制备方法。
本发明肉食螨变应原中的螨是指普通肉食螨(Cheyletus eruditus)。雌螨，体长为450～620微米；躯体无色，呈菱形；颚体比较狭长，气门板呈M状；须肢跗节上，外方有13～15个硬齿，内方有16～17个齿；前足体板的前缘比后缘短，有4对梳状缘毛。后半体板狭，有3对刚毛。第一对足长度中等。雄螨，比雌螨宽，更骨化；前复片为纵向的脊，有几个结节，无显著的侧突或侧翼；复片有纵向的条纹；须肢跗节上，外方有8～9个硬齿，内方有6～9个齿；前足体板比雌螨宽，具有2对中毛及4对缘毛。后半体板伸向体躯后缘，有5或6对缘毛；生殖孔位于体躯后缘，阳茎稍弯曲。
本发明第一方面是提供了普通肉食螨变应原原材料的制备方法。
普通肉食螨变应原原材料通过种子建立、接种培养、收集、纯化等步骤制备。
1)种子建立
螨种收集：广泛收集起居室床上、枕头、被褥、沙发、地毯等中的粉尘以及房舍灰尘。24℃～27℃、相对湿度为60～75％的环境中培养2～4个月。
分离鉴定：每周观察2～3次粉尘、灰尘中螨生长情况，发现有普通肉食螨活动时，接种针挑出，对普通肉食螨进行形态学鉴定，确认普通肉食螨后，将普通肉食螨分离出来，进行培养。
种子培养：培养基为：猪肉粉30％、小麦胚芽40％、大豆蛋白粉30％，经过钴60照射灭菌处理。取600ml无菌细胞培养瓶，每个培养瓶以无菌操作接入20～30克培养基，然后接入1.0～1.5克上述已分离鉴定好的普通肉食螨，24℃～27℃、相对湿度为60～75％的环境中 避光培养2～3个月。至普通肉食螨达到50％左右作为种子。普通肉食螨种子于20℃～25℃、相对湿度为50～70％条件下避光保存，每3～6个月传代一次。
2)接种培养：培养基为：猪肉粉30％、小麦胚芽40％、大豆蛋白粉30％，培养基各成分分别通过100目以上的分样筛，经过钴60照射灭菌处理。取600ml无菌细胞培养瓶，每个培养瓶以无菌操作接入20～30克培养基，然后接入1.0～1.5克普通肉食螨工作种子。将接种好的培养瓶置于24℃～27℃、相对湿度为60～75％条件下避光培养2～3个月。
3)收集：将培养瓶内的普通肉食螨与培养基的混合物倒入准备好的不锈钢盘中，放入-80℃冰箱过夜，真空冷冻干燥48h以上。
4)纯化：将普通肉食螨原材料通过100目分筛，超声筛分纯化，取其筛上部分，镜检普通肉食螨含量95％以上为合格。
5)脱脂：加入2倍体积的-20℃以下丙酮脱脂，振荡30min后静置5min，重复操作，直至上清液无色为止。
6)干燥：弃去废液后将固体物在滤纸上摊开，真空干燥48h以上。
7)保存：-20℃以下密封避光保存。
本发明另一方面提供了普通肉食螨变应原的制备方法。
1)提取：普通肉食螨纯螨变应原原材料与50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液按1～2∶20(W/V)的比例混合，2～8℃，搅拌提取24h。
2)离心：于4℃，8000rmp离心15～30分钟。
3)过滤：过滤上清液滤纸过滤，0.22μm膜除菌过滤。
4)浓缩：用截留分子量5kD的膜，以pH8的50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液衡滤，至滤出液无色为止，超滤浓缩至体积为原体积的三分之一，收集回流液，经0.22μm膜过滤除菌得普通肉食螨变应原原液。
5)真空冷冻干燥：用甘露醇水溶液稀释到规定浓度，甘露醇终浓度为2％。稀配后的普通肉食螨变应原原液经0.22μm膜过滤除菌后分装到西林瓶中，每瓶1ml。真空冷冻干燥48h以上，即得普通肉食螨变应原。
6)保存：-20℃以下密封避光保存。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：普通肉食螨变应原原材料的制备方法。
1)种子建立
螨种收集：广泛收集起居室床上、枕头、被褥、沙发、地毯等中的粉尘以及房舍灰尘。24℃～27℃、相对湿度为60～75％的环境中培养4个月。
分离鉴定：每周观察2～3次粉尘、灰尘中螨生长情况，发现有普通肉食螨活动时，接种针挑出，对普通肉食螨进行形态学鉴定，确认为普通肉食螨，将普通肉食螨分离出来，进行培养。
种子培养：培养基为：猪肉粉30％、小麦胚芽40％、大豆蛋白粉30％，经过钴60照射灭菌处理。取600ml无菌细胞培养瓶，每个培养瓶以无菌操作接入20～30克培养基，然后接入1.0～1.5克上述已分离鉴定好的普通肉食螨，24℃～27℃、相对湿度为60～75％的环境中 避光培养3个月。至普通肉食螨达到50％左右作为种子。普通肉食螨种子于20℃～25℃、相对湿度为50～70％条件下避光保存，每3～6个月传代一次。
2)接种培养：培养基为：猪肉粉30％、小麦胚芽40％、大豆蛋白粉30％，培养基各成分分别通过100目以上的分样筛，经过钴60照射灭菌处理。取600ml无菌细胞培养瓶，每个培养瓶以无菌操作接入20～30克培养基，然后接入1.0～1.5克普通肉食螨工作种子。将接种好的培养瓶置于24℃～27℃、相对湿度为60～75％条件下避光培养3个月。
3)收集：将培养瓶内的普通肉食螨与培养基的混合物倒入准备好的不锈钢盘中，放入-80℃冰箱过夜，真空冷冻干燥48h。
4)纯化：将普通肉食螨原材料通过100目分筛，超声筛分纯化，取其筛上部分，螨含量95％以上为合格，镜检普通肉食螨含量99％。
5)脱脂：加入2倍体积的-20℃以下丙酮脱脂，振荡30min后静置5min，重复操作，直至上清液无色为止。
6)干燥：弃去废液后将固体物在滤纸上摊开，真空冷冻干燥48h。
7)保存：-20℃以下密封避光保存。
实施例2：普通肉食螨变应原的制备方法。
1)提取：普通肉食螨纯螨变应原原材料与50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液按1∶20(w/v)的比例混合，2～8℃，搅拌提取24h。
2)离心：于4℃，8000rmp离心15分钟。
3)过滤：过滤上清液滤纸过滤，0.22μm膜除菌过滤。
4)浓缩：用截留分子量5kD的膜，以pH8的50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液衡滤，至滤出液无色为止，超滤浓缩至体积为原体积的三分之一，收集回流液，经0.22μm膜过滤除菌得普通肉食螨变应原原液。
5)真空冷冻干燥：
甘露醇溶液(4％)的配制：按比例称取适量甘露醇，用60℃注射水定容至终体积的1/3，当温度降至30℃时，加入0.2％针用活性炭，30℃搅拌30min。然后使用钛棒将药液过滤除去碳颗粒。脱碳后的甘露醇溶液用60℃注射水定容至终体积，加入0.05％针用活性炭，60℃搅拌吸附30分钟，用0.8μm膜过滤，除去活性炭，经0.22μm膜过滤除菌。
用甘露醇水溶液稀释到规定浓度，甘露醇终浓度为2％。稀配后的普通肉食螨变应原原液经0.22μm膜过滤除菌后分装到西林瓶中，每瓶1ml。
半压塞放入冻干机腔体内，以每分钟2.5～3.0℃/min的速度将温度降至-45℃，保持8h；然后以每分钟0.4℃/min的速度将温度升至-30℃，保持30h，维持腔内真空度15Pa；再以2℃/min速度将温度升至25℃，保持50min，同时维持真空度为0Pa；再以0.5℃/min的速度将温度升至30℃，保持60min，同时维持真空度0Pa，即得普通肉食螨变应原。
6)保存：-20℃以下密封避光保存。