提高脐带间充质干细分化为血管内皮细胞效率的一种方法与流程

背景技术：
：内皮细胞对组织器官修复、血管新生具有非常重要的作用，而且是组织工程移植物再血管化的必要细胞成分。但是成熟内皮细胞体外增殖能力有限，很难满足体外再血管化的需要。脐带间充质干细胞体外增殖能力强，具有多向分化潜能，而且这些细胞分离方便，对婴儿和母亲没有影响，可以冻存以便将来使用，所以，脐带间充质干细胞在组织器官修复和心血管组织工程再血管化研究领域将有非常大的前景。我们采用酶消化法，成功从脐带组织中分离出干细胞(武开宏，莫绪明，刘迎龙，卢士红，韩忠朝。酶消化法分离脐带干细胞。中华小儿外科杂志。2008；29(3)：159-162)。我们研究发现，在诱导剂内皮细胞生长因子(50ng/ml)的作用下，脐带间充质干细胞能够分化为血管内皮细胞，但是分化效率较低，只有约30％的脐带间充质干细胞能够分化为血管内皮细胞(武开宏，莫绪明，卢士红，韩忠朝。脐带间充质干细胞分化为内皮细胞的实验研究。中华小儿外科杂志2010；31(12)：954-6)。我们经实验研究发现在诱导剂中加入碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子，能明显提高脐带间充质干细胞分化为内皮细胞的效率，分化效率由30％提高到50-70％，为组织器官修复研究和组织工程移植物再血管化研究，进一步提高干细胞分化为内血管皮细胞的效率，提供了重要的实验依据资料。

技术实现要素：
：采用胶原酶消化法分离脐带间充质干细胞。取培养分离的第5代脐带间充质干细胞，接种于24孔培养板，培养板用Matrigel包被，血管内皮细胞诱导分化液含M199培养基，2％胎牛血清和50ng/ml血管内皮生长因子。2周后，对诱导分化后的脐带间充质干细胞进行内皮特异性抗体CD34检测和摄取DiI-Ac-LDL检测，观测阳性细胞比例。在血管内皮诱导培养液中加入碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子，采用流式细胞仪检测细胞分化效率。同时确定诱导分化时间，为实际应用中的浓度和时间提供参考基础。确定可以用20ng/ml浓度的碱性成纤维细胞生长因子和10ng/ml表皮生长因子，能够明显提高脐带间充质干细胞分化为血管内皮细胞的效率。

本发明为组织器官修复研究和组织工程移植物再血管化研究，提供了重要的实验依据资料。本发明内容未公开发表，本领域的相关技术人员如不花费创造性劳动根本不可能根据现有的技术推断得到本发明的诱导培养方法。

附图说明：

图1：分离培养的脐带间充质干细胞，细胞增殖能力旺盛，呈旋涡状生长。

图2：内皮细胞定向诱导1周后，脐带间充质干细胞形成网格样结构。

图3：2周后，免疫荧光染色示分化后的脐带间充质干细胞表达内皮特异性抗体CD34，诱导分化效率30％。

图4：加入碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子后，流式细胞仪检测内皮特异性抗体CD144示血管内皮细胞分化效率为50-70％。

具体实施方式：

1.采用酶消化法分离脐带干细胞并进行鉴定。流式细胞分析脐带干细胞表达CD13、CD29、CD44、CD90、CD105、CD166和MHC-I，而不表达CD31、CD34和CD106，MHC-II。诱导前脐带干细胞形态成典型的成纤维样细胞形态，诱导2周后，细胞的形态不断发生变化一些细胞的体积增大，空泡样改变。取培养分离的第5代脐带间充质干细胞接种于24孔培养板，培养板用Matrigel包被，每孔接种脐带间充质干细胞5×10³个。内皮诱导分化液为M199培养剂，2％胎牛血清，50ng/mlVEGF，100U/ml青、链霉素。每2天更换一次培养液，换液时取D-Hank’s轻轻冲洗细胞，去除死亡脱落的细胞，持续诱导2周，实验发现诱导分化后的脐带间充质干细胞表达内皮特异性抗体CD34并且摄取DiI-Ac-LDL检测阳性(摄取DiI-Ac-LDL是成熟内皮细胞具有的功能)，观测阳性细胞比例约为30％。

2.在血管内皮诱导培养液中加入碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子，培养方法同方法1，实验发现诱导分化后的脐带间充质干细胞表达内皮特异性抗体CD34，具有摄取DiI-Ac-LDL功能，同时流式细胞仪检测发现血管内皮细胞分化的效率提高到50-70％。同时，确定可以用20ng/ml浓度的碱性成纤维细胞生长因子和10ng/ml表皮生长因子来提高脐带间充质干细胞分化为血管内皮细胞的效率。