本发明涉及分子克隆与细胞生物学领域，具体的，本发明涉及使癌细胞重编程为癌干细胞的方法及其应用，更具体的，本发明涉及一种将癌细胞转变成癌干细胞的方法、一种试剂盒、一种膀胱癌干细胞和一种检测癌细胞是否为癌干细胞的方法。
背景技术：
：世界范围内，膀胱癌每年有430,000个病例新增和150,300个死亡病例(Chavanetal.,2014)。膀胱癌干细胞最早在2008年被分选鉴定(Ningetal.,2009；Sheetal.,2008)，当初所采用的方法是侧群细胞分选法(Side-Population,SP)。随着研究的深入，科学家们陆续使用CD44v6(YangandChang,2008)，67LR(Heetal.,2009)，CD44(Chanetal.,2009)，ALDH1A1(Suetal.,2010)和CD90/CK14(Volkmeretal.,2012)等分离并鉴定了膀胱癌干细胞。膀胱癌干细胞具有干性维持能力和肿瘤起始的能力，负责膀胱癌的复发和耐药(Hoetal.,2012；Tranetal.,2010)。根据先前的报道，人的膀胱癌干细胞可能起源于正常膀胱粘膜中表达CK5和CK17的基底层细胞(Heetal.,2009)。随后连续两篇文章利用BBN诱导的方法获得了小鼠膀胱癌模型，并发现了小鼠原位膀胱癌和浸润型膀胱癌起源于正常膀胱粘膜中表达CK5和分泌蛋白shh的基底层细胞(Shinetal.,2014；VanBataviaetal.,2014)；另外，VanBatavia等人还证明了乳头状膀胱癌起源于正常膀胱粘膜中表达CK2的中间层细胞，而鳞状细胞膀胱癌的祖先是表达CK5的基底层干细胞(VanBataviaetal.,2014)。技术实现要素：依据本发明的一方面，本发明提供一种将癌细胞转变成癌干细胞的方法，该方法包括使所述癌细胞的基因组上具有(1)和(2)两个突变的步骤：(1)MLL2基因chr12:49420183C>G，(2)ARID1A基因chr1:27093001G>A。经过基因编辑方法以及体外试验验证确定，使癌细胞基因组同时存在上述两个突变能够使癌细胞去分化获得干细胞性质。任选的，所述癌细胞为膀胱癌细胞，所述癌干细胞为膀胱癌干细胞。这两个突变是发明人从膀胱癌干细胞样本中新发现且经验证的膀胱癌干细胞特有的、之前未见有报道的突变。由于膀胱癌干细胞具有干性维持能力和肿瘤起始的能力，负责膀胱癌的复发和耐药， 所以基于该发现的本发明的这一方法能够获得癌干细胞，对该癌症的研究，包括该癌的发展、治疗给药耐药和愈后复发等都能提供更多的信息，结合这些中间信息，利于辅助临床诊断治疗该肿瘤患者时作出有针对性的、更有效的治疗方案。依据本发明的另一方面，本发明提供一种试剂盒，其包括能够使癌细胞的基因组上具有上述本发明一方面的方法中的突变的试剂。所称试剂包括基因编辑系统，包括但不限于序列、质粒载体、细胞、检测试剂和/或转化或转染相关溶液配方或反应体系。依据本发明的再一方面，本发明提供上述试剂盒在使癌细胞重编程为癌干细胞中的用途。试剂盒包含的试剂包括包括基因编辑系统，包括但不限于序列、质粒载体、细胞、检测试剂和/或转化或转染相关溶液配方或反应体系。利用该试剂盒，能够方便有效的将癌细胞转变成癌干细胞。依据本发明的又一方面，本发明提供一种利用上述本发明一方面的方法使膀胱癌细胞去分化而获得的膀胱癌干细胞。由于膀胱癌干细胞具有干性维持能力和肿瘤起始的能力，负责膀胱癌的复发和耐药，体外将膀胱癌细胞转变成膀胱癌膀胱癌，获得膀胱癌干细胞，对膀胱癌的研究，包括膀胱癌的产生发展、治疗给药耐药和愈后复发过程等都能提供更多的信息，结合这些中间信息，利于辅助临床诊断治疗膀胱癌患者时作出有针对性的、更有效的治疗方案。依据本发明的一方面，本发明提供一种检测癌细胞是否为癌干细胞的方法，该方法包括：对所述癌细胞的基因组进行变异检测，获得变异结果；当所述变异结果包括MLL2基因chr12:49420183C>G和ARID1A基因chr1:27093001G>A两个突变时，判定所述癌细胞为癌干细胞。任选的，所述癌细胞为膀胱癌细胞，所述癌干细胞为膀胱癌干细胞。MLL2基因chr12:49420183C>G和ARID1A基因chr1:27093001G>A这两个突变是发明人从膀胱癌干细胞样本中新发现且验证过的膀胱癌干细胞特有的、之前未见有报道的突变。由于膀胱癌干细胞具有干性维持能力和肿瘤起始的能力，负责膀胱癌的复发和耐药，利用本发明的这一检测膀胱癌细胞是否是膀胱癌干细胞的方法，对膀胱癌的研究，包括膀胱癌的发生发展、治疗给药耐药和愈后复发过程等都能提供更多的信息，结合这些中间信息，利于辅助临床诊断治疗膀胱癌患者时作出有针对性的、更有效的治疗方案。附图说明本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施方式的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1是本发明的一个实施例中的正常膀胱细胞和膀胱癌细胞的流式分选结果图；图1A显示正常膀胱细胞和膀胱癌细胞的流式分选策略；图1B显示BCS2、BCS3和BCS5的流式分选结果。图2是本发明的一个实施例中的从BCS2、BCS3和BCS5中获得的59个单细胞DNA样品的电泳检测结果。图3是本发明的一个实施例中的单细胞测序数据的评估结果图；图3A显示从BCS2、BCS3和BCS5中分离的单细胞的平均测序深度，图3B显示59个单细胞的测序覆盖度。图4是本发明的一个实施例中的BCS2、BCS3和BCS5中膀胱癌干细胞和分化的膀胱癌肿瘤细胞中特有突变和共有突变的维恩图。图5是本发明的一个实施例中的膀胱癌干细胞特有的19个基因突变的频率分析结果示意图。图6是本发明的一个实施例中对突变后的膀胱癌细胞系EJ和T24的自我更新能力的检测结果图；图6A显示细胞突变后在无血清培养的条件下形成干细胞小球的个数；图6B显示ARID1A，GPRC5A和MLL2在膀胱癌细胞系中的突变Sanger验证结果；图6C显示ARID1A，GPRC5A和MLL2共同突变的膀胱癌细胞对干细胞小球形成的能力的影响。图7是本发明的一个实施例中的RT-PCR检测野生型和突变型膀胱癌细胞中ARID1A，MLL2和GPRC5A的mRNA表达量的结果示意图。图8是本发明的一个实施例中的野生型和突变型膀胱癌细胞中干细胞标志物CD44的表达的结果示意图。图9是本发明的一个实施例中的野生型和突变型膀胱癌细胞的有限稀释成瘤实验和肿瘤干细胞比例预测结果示意图。图10是本发明的一个实施例中的野生型和突变型膀胱癌细胞形成的异种移植瘤干细胞标志物CD44的表达结果示意图。图11是本发明的一个实施例中的ARID1A、GPRC5A和MLL2基因突变与膀胱癌患者预后的关系的示意图；图11A显示五十一例膀胱癌患者的膀胱癌干细胞中ARID1A，GPRC5A和MLL2突变情况；图11B显示五十一例膀胱癌患者术后复发的时间。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中，自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本 发明的限制。在本文中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。在本文中，除非另有说明，所称的癌干细胞，除了包括本领域定义的癌干细胞，即被认为具有干性维持和肿瘤起始的能力的一类细胞，还包括类肿瘤(癌)干细胞，类肿瘤干细胞也具备自我更新和肿瘤起始的能力，但可认为其自我更新和/或肿瘤起始能力介于癌干细胞和癌细胞之间。根据本发明的实施例提供的将癌细胞转变成癌干细胞的方法，包括使癌细胞的基因组上具有(1)和(2)两个突变的步骤：(1)MLL2基因chr12:49420183C>G，(2)ARID1A基因chr1:27093001G>A。经过基因编辑方法以及体外试验验证确定，使癌细胞基因组同时存在上述两个突变能够使癌细胞去分化获得干细胞性质。这两个突变是发明人从膀胱癌干细胞样本中新发现且验证的膀胱癌干细胞特有的、之前未见有报道的突变，所以优选的，所述癌细胞为膀胱癌细胞，所述癌干细胞为膀胱癌干细胞。由于膀胱癌干细胞具有干性维持能力和肿瘤起始的能力，负责膀胱癌的复发和耐药，所以基于该发现的本发明的这一方法能够获得癌干细胞，对该癌症的研究，包括膀胱癌的发生发展、治疗给药耐药和愈后复发等都能提供更多的信息，结合这些中间信息，利于辅助临床诊断治疗该肿瘤患者时作出有针对性的、更有效的治疗方案。根据本发明的一个较佳实施例，该方法还包括使所述癌细胞的基因组上具有GPRC5A基因chr12:13061979T>G突变的步骤。GPRC5A基因chr12:13061979T>G突变也是发明人从膀胱癌干细胞样本中新发现验证的膀胱癌干细胞特有的、之前未见有报道的突变。在干细胞小球培养体系中，发明人惊喜地发现GPRC5A基因chr12:13061979T>G、上述(1)和(2)三个突变同时存在的膀胱癌细胞具有干细胞性质，当其基因组上同时存在这三个突变可以显著有效的提高膀胱癌细胞自我更新和小球的形成能力，使该膀胱癌细胞重编程为膀胱癌干细胞。根据本发明的一个实施例，该方法还包括使所述癌细胞的基因组上具有以下17个突变中的至少之一的步骤：ATM基因chr11:108186754C>A，CREBBP基因chr16:3790519C>A，ERCC2基因chr19:45867687T>C，ETS1基因chr11:128333418A>G，FAT4基因chr4:126329890T>C，GPRC5A基因chr12:13061979T>G，LRP2基因chr2:170096229G>A，MAP3K6基因chr1:27687466G>T，MKL1基因chr22:40807506G>A，PAWR基因chr12:79990409G>T，PITX2基因chr4:111542524C>G，RNF213基因chr17:78293189A>T，SIN3A基因chr15:75664469C>T，STAG2基因chrX:123220567C>G，TP53基因chr17:7577100T>C，USP24基因chr1:55638075G>A和ZBTB17基因chr1:16270382G>T。这17突变包括GPRC5A基因chr12:13061979T>G突变，都是发明人从膀胱癌干细胞样本 中新发现验证的膀胱癌干细胞特有的、之前未见有报道的突变。在干细胞小球培养体系中，发明人惊喜地发现这17个突变中的至少一个、加上上述(1)和(2)突变同时存在的膀胱癌细胞具有干细胞性质，其基因组上同时存在以上多个突变可以有效的提高膀胱癌细胞自我更新和小球的形成能力。上述涉及的19个突变，包括(1)和(2)以及17个所称的突变，是发明人利用单细胞测序方法，对来自三个膀胱癌患者的四类59个单细胞进行了单细胞测序、数据分析并且经过其它单细胞样本的验证而获得的。所称的19突变如表1所示，这19个突变是基于比较膀胱/膀胱癌组织四类细胞，排除非膀胱癌干细胞的其它三类细胞中存在的突变以及排除已报道过的突变，而确定下来的、只存在膀胱癌干细胞的突变，即膀胱癌干细胞特有突变。所以，较佳的，待转变的细胞为来自膀胱组织或者膀胱癌组织。来自膀胱组织或者膀胱癌组织的细胞，一般可能为分化的膀胱细胞、分化的膀胱癌细胞、膀胱干细胞或者膀胱癌干细胞。需要说明的是，表1中的19个SNP突变包括上述(1)和(2)两个突变的表示方式是根据HGVS命名法标注该位点在参考基因组DNA(gDNA，HG19版本)上的位置来显示的，本领域技术人员能够知道，一个SNP位点还可以有其它表示方式，例如以GenBankSNP数据库的命名方法——以rs加7位阿拉伯数字来表示一个SNP，例如以该SNP在参考cDNA上的位置来标注指代与表1一样的SNP位点或SNP组合，都仍旧是指代本发明公开的SNP，属于本发明范围，比如表1中MKL1基因序列上的基因组序列上的突变chr22:40807506G>A，与其cDNA上的c.C2684T，属于同一突变，都能致使发生多肽突变p.S895L。还需要说明的是，一个来自膀胱/膀胱组织的细胞的基因组存在表1中的19个突变中的至少一个，是判断该细胞是膀胱癌干细胞的必要非充分条件，即待测细胞中存在表1中的任意一个突变序列，则判定该细胞为膀胱癌干细胞，而不能推定膀胱癌干细胞一定具有表1中的任意一个或者表1中的至少一个突变。表1基因核酸突变(基因组HG19)ARID1Achr1:27093001G>AATMchr11:108186754C>ACREBBPchr16:3790519C>AERCC2chr19:45867687T>CETS1chr11:128333418A>GFAT4chr4:126329890T>CGPRC5Achr12:13061979T>GLRP2chr2:170096229G>AMAP3K6chr1:27687466G>TMKL1chr22:40807506G>AMLL2chr12:49420183C>GPAWRchr12:79990409G>TPITX2chr4:111542524C>GRNF213chr17:78293189A>TSIN3Achr15:75664469C>TSTAG2chrX:123220567C>GTP53chr17:7577100T>CUSP24chr1:55638075G>AZBTB17chr1:16270382G>T该方法可以利用现有的任何一种基因/基因组编辑方法和/或试剂盒来实现使癌细胞的基因组带有所说的突变。根据本发明的一个实施例，利用CRISPR系统以及单链DNA模板使所述癌细胞的基因组上具有所述突变。CRISPR(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)最早发现于原核生物的免疫系统中，这些成簇规则间隔的短回文重复序列旁边经常伴随出现保守基因，而这些保守基因编码的蛋白统称为CRISPR相关蛋白(Cas，CRISPR-associatedproteins)。CRISPR系统、TALEN(transcriptionactivator-likeeffectornucleases)系统和ZFN(zincfingernucleases)系统是现在常用的三种基因组编辑工具，可以用于复杂的基因组编辑。目前CRISPR系统成功已应用于细菌、酵母、斑马鱼、小鼠及人细胞的基因组精确修饰，以及基因转录翻译调控以及其他方面。由于其突变效率高、突变成本低、作用物种广泛，是一种非常有前景的基因组定点改造分子工具。CRISPR系统主要由两个部分组成：sgRNA(singleguideRNA)和Cas9蛋白。sgRNA序列也是由两部分组成：1)寡核苷酸序列，长20bp，和基因组上目标序列(靶序列)互补，位于PAM(Protospacer-AdjacentMotif)序列之前，需要自行设计；2)crRNA-tracrRNA，由原核生物上的序列改造而成，形成可以被Cas9蛋白识别的茎环结构。Cas9是一种核酸酶。当sgRNA和Cas9共转化受体细胞时，sgRNA可以将Cas9带到基因组上靶序列的位置，在PAM序列上游2-3碱基处由Cas9将靶基因的DNA双链切断。如果新的DNA模板也一并导入的话，断裂的DNA双链会发生同源重组，如果没有DNA模板导入，则在非同源末端连接修复机制下，会产生Indel突变。根据本发明的一个实施例，该方法所利用的CRISPR系统为LentiCRISPRv2病毒质粒。所称LentiCRISPRv2病毒质粒是通过将自设计合成的能够与基因组上靶序列结合的双链DNA序列构建到购买addgene公司的LentiCRISPRv2载体上获得的。根据本发明的一些实施例，所述CRISPR系统包括能够与所述突变所在的位置结合的双链DNA。具体的，例如，为使所述癌细胞的基因组上具有MLL2基因chr12:49420183C>G突变，所述双链DNA的两条链分别为SEQIDNO：1和2，所述单链DNA模板为SEQID NO：3；为使所述癌细胞的基因组上具有ATM基因chr11:108186754C>A，所述双链DNA的两条链分别为SEQIDNO：4和5，所述单链DNA模板为SEQIDNO：6；为使所述癌细胞的基因组上具有CREBBP基因chr16:3790519C>A，所述双链DNA的两条链分别为SEQIDNO：7和8，所述单链DNA模板为SEQIDNO：9；为使所述癌细胞的基因组上具有ERCC2基因chr19:45867687T>C，所述双链DNA的两条链分别为SEQIDNO：10和11，所述单链DNA模板为SEQIDNO：12；为使所述癌细胞的基因组上具有ETS1基因chr11:128333418A>G，所述双链DNA的两条链分别为SEQIDNO：13和14，所述单链DNA模板为SEQIDNO：15；为使所述癌细胞的基因组上具有FAT4基因chr4:126329890T>C，所述双链DNA的两条链分别为SEQIDNO：16和17，所述单链DNA模板为SEQIDNO：18；为使所述癌细胞的基因组上具有GPRC5A基因chr12:13061979T>G，所述双链DNA的两条链分别为SEQIDNO：19和20，所述单链DNA模板为SEQIDNO：21；为使所述癌细胞的基因组上具有LRP2基因chr2:170096229G>A，所述双链DNA的两条链分别为SEQIDNO：22和23，所述单链DNA模板为SEQIDNO：24；为使所述癌细胞的基因组上具有MAP3K6基因chr1:27687466G>T，所述双链DNA的两条链分别为SEQIDNO：25和26，所述单链DNA模板为SEQIDNO：27；为使所述癌细胞的基因组上具有MKL1基因chr22:40807506G>A，所述双链DNA的两条链分别为SEQIDNO：28和29，所述单链DNA模板为SEQIDNO：30；为使所述癌细胞的基因组上具有MLL2基因chr12:49420183C>G，所述双链DNA的两条链分别为SEQIDNO：31和32，所述单链DNA模板为SEQIDNO：33；为使所述癌细胞的基因组上具有PAWR基因chr12:79990409G>T，所述双链DNA的两条链分别为SEQIDNO：34和35，所述单链DNA模板为SEQIDNO：36；为使所述癌细胞的基因组上具有PITX2基因chr4:111542524C>G，所述双链DNA的两条链分别为SEQIDNO：37和38，所述单链DNA模板为SEQIDNO：39；为使所述癌细胞的基因组上具有RNF213基因chr17:78293189A>T，所述双链DNA的两条链分别为SEQIDNO：40和41，所述单链DNA模板为SEQIDNO：42；为使所述癌细胞的基因组上具有SIN3A基因chr15:75664469C>T，所述双链DNA的两条链分别为SEQIDNO：43和44，所述单链DNA模板为SEQIDNO：45；为使所述癌细胞的基因组上具有STAG2基因chrX:123220567C>G，所述双链DNA的两条链分别为SEQIDNO：46和47，所述单链DNA模板为SEQIDNO：48；为使所述癌细胞的基因组上具有TP53基因chr17:7577100T>C，所述双链DNA的两条链分别为SEQIDNO：49和50，所述单链DNA模板为SEQIDNO：51；为使所述癌细胞的基因组上具有USP24基因chr1:55638075G>A，所述双链DNA的两 条链分别为SEQIDNO：52和53，所述单链DNA模板为SEQIDNO：54；为使所述癌细胞的基因组上具有ZBTB17基因chr1:16270382G>T，所述双链DNA的两条链分别为SEQIDNO：55和56，所述单链DNA模板为SEQIDNO：57。表2和表3分别展示上述的双链DNA序列和单链DNA模板，其中表2中的粗体显示的20bp序列为能够与基因组上靶序列结合或者与基因上靶序列一致的序列，非粗体显示的碱基在退火形成双链后，能使双链DNA具有BsmBI酶切位点；表3中的粗体显示的为各基因的单核苷酸突变。表2和表3中的序列，是发明人综合考虑靶序列的位置、碱基组成、模板的长度以及突变位点在模板中的位置对基因编辑效果的影响等因素，经过大量组合筛选试验、效果比较确定下来的。表2表3根据本发明的另一实施例提供的试剂盒，其包括能够使癌细胞的基因组上具有上述本发明任一实施例中的将癌细胞转变成癌干细胞的方法中的突变的试剂。所称试剂包括基因/基因组编辑系统，包括但不限于序列、质粒载体、细胞、检测试剂和/或转化或转染相关溶液配方或反应体系。利用该试剂盒能够方便快速有效的将癌细胞转变成癌干细胞。根据本发明的一个实施例，提供了上述试剂盒在使癌细胞重编程为癌干细胞中的用途。试剂盒包含的试剂包括包括基因编辑系统，包括但不限于序列、质粒载体、细胞、检测试剂和/或转化或转染相关溶液配方或反应体系。利用该试剂盒，能够方便有效的将癌细胞转变成癌干细胞。根据本发明的实施例，提供一种利用上述任一实施例中的将癌细胞转变成癌干细胞的方法作用膀胱癌细胞，使其去分化转变成膀胱癌干细胞。由于膀胱癌干细胞具有干性维持能力和肿瘤起始的能力，负责膀胱癌的复发和耐药，体外将膀胱癌细胞转变成膀胱癌膀胱癌，获得膀胱癌干细胞，对膀胱癌的研究，包括膀胱癌的产生发展、治疗给药耐药和愈后复发过程等都能提供更多的信息，结合这些中间信息，利于辅助临床诊断治疗膀胱癌患者时作出有针对性的、更有效的治疗方案。根据本发明的一些实施例，提供一种检测癌细胞是否为癌干细胞的方法，该方法包括：对癌细胞的基因组进行变异检测，获得变异结果；当变异结果包括MLL2基因chr12:49420183C>G和ARID1A基因chr1:27093001G>A两个突变时，判定所述癌细胞为癌干细胞。在本发明的一个较佳实施例中，所述癌细胞为膀胱癌细胞，所述癌干细胞为膀胱癌干细胞，因为MLL2基因chr12:49420183C>G和ARID1A基因chr1:27093001G>A这两个突变是发明人从膀胱癌干细胞样本中新发现且经验证的膀胱癌干细胞特有的、之前未见有报道的突变。由于膀胱癌干细胞具有干性维持能力和肿瘤起始的能力，负责膀胱癌的复 发和耐药，利用本发明的这一检测膀胱癌细胞是否是膀胱癌干细胞的方法，对膀胱癌的研究，包括膀胱癌的发生发展、治疗给药耐药和愈后复发过程等都能提供更多的信息，结合这些中间信息，利于辅助临床诊断治疗膀胱癌患者时作出有针对性的、更有效的治疗方案。根据本发明的一个较佳实施例，当检测获得的变异结果中包括GPRC5A基因chr12:13061979T>G突变，则判定该癌细胞为癌干细胞。GPRC5A基因chr12:13061979T>G突变也是发明人从膀胱癌干细胞样本中新发现验证的膀胱癌干细胞特有的、之前未见有报道的突变。在干细胞小球培养体系中，发明人惊喜地发现GPRC5A基因chr12:13061979T>G、上述(1)和(2)三个突变同时存在的膀胱癌细胞具有干细胞性质，当其基因组上同时存在这三个突变可以显著有效的提高膀胱癌细胞自我更新和小球的形成能力，使该膀胱癌细胞重编程为膀胱癌干细胞。膀胱癌细胞基因组上同时存在这三个突变，可以准确断定该细胞具有膀胱癌干细胞的性质，为膀胱癌干细胞。根据本发明的一些实施例，当变异结果包括以下17个突变中的至少之一，判定该癌细胞为癌干细胞：ATM基因chr11:108186754C>A，CREBBP基因chr16:3790519C>A，ERCC2基因chr19:45867687T>C，ETS1基因chr11:128333418A>G，FAT4基因chr4:126329890T>C，GPRC5A基因chr12:13061979T>G，LRP2基因chr2:170096229G>A，MAP3K6基因chr1:27687466G>T，MKL1基因chr22:40807506G>A，PAWR基因chr12:79990409G>T，PITX2基因chr4:111542524C>G，RNF213基因chr17:78293189A>T，SIN3A基因chr15:75664469C>T，STAG2基因chrX:123220567C>G，TP53基因chr17:7577100T>C，USP24基因chr1:55638075G>A和ZBTB17基因chr1:16270382G>T。这17突变包括GPRC5A基因chr12:13061979T>G突变，都是发明人从膀胱癌干细胞样本中新发现验证的膀胱癌干细胞特有的、之前未见有报道的突变。在干细胞小球培养体系中，发明人惊喜地发现这17个突变中的至少一个、加上同时存在上述(1)和(2)突变的膀胱癌细胞具有干细胞性质，其基因组上同时存在以上多个突变可以有效的提高膀胱癌细胞自我更新和小球的形成能力，使成为膀胱癌干细胞。以下结合具体实施例对本发明的将癌细胞转变成癌干细胞的方法、相关突变及其组合的检测确定和应用等进行详细的描述。除另有交待，以下实施例中涉及的未特别交待的试剂、序列(接头、标签和引物)、软件及仪器，都是常规市售产品或者开源的，例如购买Illumina的DNA文库构建试剂盒，例如LentiCRISPRv2购自addgene公司。实施例一1.组织样本处理获得单细胞样本膀胱组织或者膀胱癌组织样本获自深圳市第二人民医院。原代的膀胱癌组织和正常的膀胱组织取自膀胱全切的膀胱癌患者，获得新鲜的组织经过无菌剪碎和胶原酶消化，过滤获得单细胞悬液。利用CD31、CD45、CD44和Pan-CK抗体，对三例膀胱癌患者的膀胱癌组织和正常的膀胱组织进行染色标记。然后通过流式分选的方法，分选出正常膀胱干细胞(normalbladderstemcells,NBSCs,pan-CK+CD44+)，分化的膀胱细胞(differentiatednormalbladdercells,DNBCs,pan-CK+CD44-)，膀胱癌干细胞(bladdercancerstemcells,BCSCs,CD31-CD45-CD44+)和分化的膀胱癌细胞(differentiatedbladdercancercells,DBCCs,CD31-CD45-CD44-)四类不同的细胞，图1显示正常膀胱细胞和膀胱癌细胞的流式分选结果。图1A显示正常膀胱细胞和膀胱癌细胞的流式分选策略：正常膀胱干细胞(normalbladderstemcells,NBSCs,pan-CK+CD44+)，分化的膀胱细胞(differentiatednormalbladdercells,DNBCs,pan-CK+CD44-)，膀胱癌干细胞(bladdercancerstemcells,BCSCs,CD31-CD45-CD44+)和分化的膀胱癌细胞(differentiatedbladdercancercells,DBCCs,CD31-CD45-CD44-)。CD31为内皮细胞标志物，CD45为造血谱系细胞标志物，CD44为干细胞标志物，pan-CK为上皮细胞标志物；图1B显示膀胱癌全切的患者BCS2,BCS3和BCS5的流式分选结果。2.单细胞的基因组提取和鉴定为了在单细胞水平获得不同类型细胞的基因背景和它们之间的进化关系，我们对分选的细胞进行了单细胞化，并通过多重置换扩增(MDA:multipledisplacementamplification)的方法对单细胞的基因组进行了DNA的提取和扩增。经过PCR鉴定，共获得了59个合格的单细胞DNA样品，如表4和图2所示。表2显示原代膀胱癌BCS2,BCS3和BCS5中获得的59个单细胞DNA样品。图2显示原代膀胱癌BCS2,BCS3和BCS5中获得的59个单细胞DNA样品的电泳检测结果，这些样本的DNA样品均通过了管家基因的质量检测，合格的DNA样品需要扩增出至少6个管家基因。表43.单细胞DNA样品的外显子测序对上述59个合格的单细胞DNA样品，进行了建库和外显子测序。在外显子区域的的平均测序深度有43×，平均覆盖度有95.21％，如图3所示。图3显示单细胞测序数据的评估结果，图3A显示原代膀胱癌BCS2,BCS3和BCS5中分离的单细胞的平均测序深度(Depth，×)，图3B显示59个单细胞的测序覆盖度(Coverage，％)。4.膀胱癌单细胞测序的突变分析首先，对测序的数据进行生物信息学分析(Houetal.,2012；Xuetal.,2012)。在获得了可靠的单个核苷酸的变异数据库后，保留了那些在正常细胞中相同基因型、并且在两个以上肿瘤细胞中相同的突变。如此，在三个样本中分别获得了757、499和166这样的个体突变。过滤掉上述突变位点中与单个核苷酸多态性数据库(TheSingleNucleotidePolymorphismdatabase,dbSNP)相同的位点以及同义突变的位点，在三个样本中分别筛选到147、253和6个非同义突变的基因，在所有的突变中，随机挑选了200基因做技术验证，通过大量的Sanger测序验证，测序的准确率是97.22％(1188/1222)。然后，分析膀胱干细胞和分化膀胱肿瘤细胞相同的突变和互斥的突变基因，结果如图4所示。图4的维恩图同时也能说明膀胱癌干细胞中基因突变的数量更多。进一步分析发现，来自BCS2和BCS3的膀胱癌干细胞共有的遗传突变基因包括BRF1,ETS1,LTBP3和USH2A；BCS2和BCS5的膀胱癌干细胞共有MUC2和RGS9BP基因突变；来自BCS2和BCS5的分化膀胱肿瘤细胞共有的突变基因是LAMA5。然而，我们并没有发现三例不同膀胱癌患者的膀胱癌干细胞和分化膀胱肿瘤细胞共有的遗传突变，这可能是肿瘤的异质性和病理分期分级的不同所导致。为了找到那些能够决定干细胞形成和重编程的关键基因突变，我们关注了那些在膀胱癌干细胞中的特有突变，尤其是那些具有转录调控，染色质重塑调节和细胞自我更新/细胞发育调节的关键基因。从满足以上功能的基因中，验证筛选到19个膀胱癌干细胞特有突变，如表1所示。19个膀胱癌特有突变所在的基因为：CREBBP,ETS1,GPRC5A,MKL1,MLL2,PAWR,PITX2,STAG2,RNF213,USP24,ARID1A,ATM,ERCC2,FAT4,LRP2,SIN3A,TP53,MAP3K6和ZBTB17。对以上19个膀胱癌干细胞特有的突变基因进行了突变频率分析，突变频率小于50％的为MAP3K6，RNF213，USP24和ZBTB17四个基因，余下15个突变基因的特有突变的突变频率不小于50％，如图5所示。图5显示膀胱癌干细胞特有的19个基因突变的频率分析，19个基因按照字母表的顺序在横坐标依次排开，纵坐标显示每 个基因的体突变频率，圆的大小代表发生基因突变的细胞数目的相对多寡。实施例二为了验证上述发现确定的表1中的19个突变基因可以用于鉴定区分出膀胱癌干细胞，发明人收集了另外45例膀胱癌组织样本和100例正常膀胱组织样本，按照实施例一的方法分离鉴定得249个膀胱癌干细胞、782个正常膀胱干细胞、750个分化的正常膀胱细胞和278个分化的膀胱癌细胞单细胞样本。检测各类细胞基因组存在上述表1所列的19个突变基因的情况，统计结果显示：782个正常膀胱干细胞中有1个细胞的基因组检测存在表1中的突变FAT4基因chr4:126329890T>C，750个分化的正常膀胱细胞的基因组均为被检测到19个突变基因中的任何一个，278个分化的膀胱癌细胞中有两个细胞的基因组各存在表1中的一个不同突变基因，而249个膀胱癌干细胞中有206个的基因组被检测到存在表1中的1个或多个突变基因。实施例三1.膀胱癌干细胞特有突变的功能筛选为了研究上述19个突变基因的功能，设计了针对每个基因的单链引导RNA(single-guideRNA,sgRNA)的引物，如表2所示，并构建到LentiCRISPRv2载体(Ranetal.,2013)。然后利用人胚肾293T细胞包装含有不同sgRNA的LentiCRISPRv2病毒，48h后收集病毒上清，利用病毒上清感染膀胱癌细胞系EJ和T24细胞。感染的同时需加入合成的81个碱基的单链寡聚脱氧核苷酸作为突变模板，模板序列如表3所示。48h后加入嘌呤霉素筛选成功转染的细胞(EJ:2μg/ml,T24:1μg/ml)，待细胞长满后消化计数，进行单克隆化培养。每种细胞每个基因铺1个96孔板，37℃培养至克隆长出。显微镜下观察克隆生长情况，标记出单克隆的细胞孔，待长满后扩大培养。最终取5×105细胞提取DNA做PCR鉴定是否在目标基因的位置引入突变。获得了每个基因单独突变的细胞后，用体外干细胞小球培养的体系来检测基因突变对膀胱癌细胞的自我更新能力的影响。通过对野生型EJ和T24细胞(EJWT和T24WT)，分选的CD44+的干细胞，还有基因突变的细胞一起进行干细胞小球的形成实验，结果如图6所示。图6显示，对突变后的膀胱癌细胞系EJ和T24的自我更新能力的检测的结果，图6A显示细胞突变后在无血清培养的条件下形成干细胞小球的个数，从左往右，第一列展示的是单一突变后对细胞小球形成能力的影响，第二列展示的是剩余18个突变与MLL2共同突变对细 胞小球形成能力的影响，第三列展示的是剩余17个突变与ARID1A和MLL2共同突变对细胞小球形成能力的影响，第四列展示的是剩余16个突变与ARID1A，GPRC5A和MLL2共同突变对细胞小球形成能力的影响，CD44+为阳性对照。从图6A结果来看，单个基因的突变中，ARID1A和MLL2的基因突变可以提高膀胱癌细胞的自我更新和干细胞小球的形成能力，能够获得类膀胱癌干细胞。但需要说明的是，这种能力与阳性对照CD44+干细胞相比，还有明显区别。发明人猜想单一的基因突变可能不足以实现膀胱癌细胞的重编程，因此，选择了MLL2为第一重要的基因突变，然后把它和余下18个基因组合共转到膀胱癌细胞中，通过克隆筛选和PCR鉴定，获得同时具有两个基因突变的单克隆细胞株，再利用体外小球培养的体系来检测。在MLL2基因表1突变的基础上，结合ARID1A、CREBBP或GPRC5A基因对应的表1中的突变可以进一步提高小球的形成能力，能够获得类癌干细胞，但需要说明的是，与阳性对照CD44+干细胞相比，仍旧有明显区别。发明人挑选了最有效提高自我更新能力的组合ARID1A和MLL2基因突变作为后续实验的基础。接着将ARID1A，MLL2和其余表1中的17个基因的突变组合引入到膀胱癌细胞系中，然后在小球的培养体系中，发现膀胱癌细胞中存在表1中的ARID1A，MLL2突变基因以及任一表1中的其它的突变基因，都能够提高膀胱癌细胞的自我更新和干细胞小球形成能力，能够获得类膀胱癌干细胞，然而除了存在ARID1A、MLL2和GPRC5A突变基因这一组合的膀胱癌细胞，其它的存在ARID1A、MLL2和任一表1中的突变基因的三个组合突变基因的膀胱癌细胞的自我更新和小球形成能力都是介于阳性对照和分化的膀胱癌细胞。发明人惊喜地发现，当在GPRC5A和ARID1A，MLL2三个基因上同时相应存在表1中的突变，可以有效的提高膀胱癌细胞自我更新和小球的形成能力，而且这种能力与阳性对照CD44+干细胞没有差异。发明人将ARID1A，GPRC5A和MLL2这三个基因同时突变的细胞命名为EJMut和T24Mut。发明人发现，在这三个突变基因的基础上，再引入表1中的其它的、第四个突变基因对细胞的自我更新能力没有明显的影响。细胞突变的验证结果见图6B，图6B显示ARID1A，GPRC5A和MLL2在膀胱癌细胞系中的突变验证(Sanger测序)。体外小球形成的结果证明EJMut和T24Mut具备了更强的小球形成能力，如图6C所示。图6C显示ARID1A，GPRC5A和MLL2共同突变的膀胱癌细胞具备了更强的干细胞小球形成的能力，野生型和突变的膀胱癌细胞等量培养在无血清的条件下，2周后计算小球的数量，每种细胞查6个视野；右侧的统计图展示的是平均值±标准差，从左到右的柱依次为EJWT、EJmut、T24WT和T24mut， 该实验重复了3次，＊P<0.05。2.ARID1A，GPRC5A和MLL2基因突变对基因表达的影响为了进一步验证这三个基因的突变对膀胱癌细胞的影响，RT-PCR的结果显示，突变的细胞株和野生型的细胞株相比，ARID1A，GPRC5A和MLL2三个基因的表达量没有显著的变化，结果如图7所示。图7显示RT-PCR检测野生型和突变型膀胱癌细胞中ARID1A，MLL2和GPRC5A的mRNA表达量，横坐标各个基因对应的4条柱，从左往右，依次为EJWT、EJmut、T24WT和T24mut细胞，柱状图展示的是平均值±标准差，实验重复了3次。3.ARID1A，GPRC5A和MLL2基因突变对CD44表达的影响接下来，发明人利用流式细胞方法，检测了突变的细胞株和野生型的细胞株干细胞标志物CD44的表达量。经过分析，EJMut和T24Mut相比较野生型的膀胱癌细胞，表达CD44阳性的细胞比例明显增多，说明干细胞的比例增加，干性能力增强，如图8所示。图8显示野生型和突变型膀胱癌细胞中干细胞标志物CD44的表达，左侧的四个峰图，各峰图中的左峰显示野生型细胞中的mIgG的表达量、右峰显示突变型细胞的CD44的表达量；图8右侧的阳性细胞比例统计图展示的是平均值±标准差，从左往右依次为EJWT、EJmut、T24WT和T24mut，实验重复了3次，＊P<0.05。4.ARID1A，GPRC5A和MLL2基因突变对肿瘤形成的影响检测肿瘤干细胞的另外一个金标准是小鼠体内的成瘤实验，肿瘤干细胞即使在非常少的细胞数情况也能导致肿瘤形成。发明人分别将10，100，1000，10000个EJMut和T24Mut和野生型的细胞与50μlMatrigel(基质胶)混合均匀后接种到免疫缺陷小鼠中，观察小鼠肿瘤的形成情况，持续4个月的时间。最后根据统计小鼠肿瘤形成的情况统计肿瘤形成率和膀胱癌干细胞的比例(Boumahdietal.,2014)，结果如图9所示。图9显示野生型和突变型膀胱癌细胞的有限稀释成瘤实验和肿瘤干细胞比例预测，将不同细胞数的野生型和突变型膀胱癌细胞与Matrigel混合后，接种在免疫缺陷鼠皮下，观察4个月后计算肿瘤形成率和肿瘤干细胞比例，每个梯度下包含6只小鼠，＊P<0.05，＊＊P<0.01；右侧柱状图中的柱子，从左往右依次是EJWT、EJMut、T24WT和T24Mut细胞的肿瘤干细胞(CSCs)比例预测。从该结果可以看出，EJMut和T24Mut在细胞数很少的情况下，相比较野生型的细胞，就能够形成肿瘤，具有更强的肿瘤起始能力，同时突变的细胞株具有更高的肿瘤干细胞比例。以上结果都说明ARID1A，GPRC5A和MLL2三个基因的组合突变可以使膀胱癌细胞获得(类)肿瘤干细胞的性质，具备了自我更新和肿瘤起始的能力。肿瘤干细胞的另外一个特征是具有连续形成异质性肿瘤的能力，我们对上述形成的肿 瘤进行了收集和消化处理，获得肿瘤细胞的单细胞悬液，再次用流式的方法检测干细胞标志物CD44的表达量。流式的结果表明，EJMut和T24Mut所形成的异种移植瘤依然保持着非常高的干细胞比例，结果如图10所示。图10显示野生型和突变型膀胱癌细胞所形成的异种移植瘤干细胞标志物CD44的表达，突变型膀胱癌细胞所形成的移植瘤表达更高的干细胞标志物CD44；左侧的四个峰图，各峰图中的左峰显示野生型细胞所形成的异种移植肿瘤干细胞中的mIgG的表达量、右峰显示突变型细胞所形成的异种移植肿瘤干细胞的CD44的表达量；右侧的异种移植肿瘤比例统计图展示的是平均值±标准差，从左往右依次为EJWT、EJmut、T24WT和T24mut，该实验重复了3次，＊P<0.05。这个实验说明ARID1A，GPRC5A和MLL2三个基因的组合突变所介导的膀胱癌细胞的重编程和干性增强是能够遗传并稳定存在的。实施例四ARID1A，GPRC5A和MLL2基因突变与膀胱癌患者预后的关系肿瘤干细胞还有一个特征就是耐药，容易导致复发(Tranetal.,2010)。为了进一步验证上述发现的三个基因突变对膀胱癌患者复发的影响，发明人收集了另外51例膀胱癌标本，对其进行了膀胱癌干细胞的分选，并提取每个病例的膀胱癌干细胞的DNA，再利用检测上述三个基因的引物来确定干细胞中该基因是否存在突变。经过统计，在51例膀胱癌样本中，有12个膀胱癌的干细胞具有ARID1A(23.53％)突变，10膀胱癌的干细胞具有GPRC5A(19.61％)突变，11个膀胱癌的干细胞具有MLL2(21.57％)突变，如表5所示。表5基因(gene)突变率(Mutationrate)ARID1A12/51＝23.53％GPRC5A10/51＝19.61％MLL211/51＝21.57％通过对每个样本的突变情况进行了仔细的分析，发现有三个样本同时具有ARID1A和GPRC5A上的表1中的突变(3/51＝5.88％)；有另外三个样本同时具有GPRC5A和MLL2上的表1中的突变(3/51＝5.88％)；有4四个样本同时具有ARID1A和MLL2上的表1中的突变(4/51＝7.84％)；有2两个样本同时具有ARID1A，GPRC5A和MLL2上的表1中的突变(2/51＝3.92％)。综合所有样本的突变和术后复发时间的信息，总结了一个基因突变与术后复发的关系，如图11所示。图11显示ARID1A，GPRC5A和MLL2基因突变与膀胱癌患者预后的关系；图11A显示五十一例膀胱癌患者的膀胱癌干细胞中ARID1A，GPRC5A和 MLL2突变情况，在各突变基因所在列中的方格中有填充说明存在对应的突变基因；图11B显示五十一例膀胱癌患者术后复发的时间，根据是否具有上述三个突变的情况分为八组，然后进行了术后复发时间的统计和分析。该结果说明当膀胱癌的患者同时具有ARID1A，GPRC5A和MLL2突变的时候，会导致更快的肿瘤复发(P＝0.046)。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。当前第1页1 2 3