一株猪流行性腹泻病毒及其分离培养方法与流程

本发明涉及微生物领域，具体涉及一株新的猪流行性腹泻病毒及其分离培养方法。

背景技术：

猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）系冠状病毒科冠状病毒属成员，可引起以呕吐、腹泻和脱水为特征的猪肠道传染性疾病。各种年龄的猪均易感，但哺乳仔猪受害最严重 ，死亡率可高达100%。近几年我国多省爆发PED，给养猪业造成了严重的经济损失。

猪流行性腹泻病的防控以疫苗预防接种为主，目前尚无特效药物治疗此病，并且国内使用的疫苗主要为PEDV CV777毒株，该毒株分离年代较早，与新变异株相比缺乏广泛的免疫原性，因此分离PEDV新毒株，培养免疫原性更强的毒株用于预防猪流行性腹泻是十分必要的。

PEDV很难在体外培养的细胞系中进行增殖，使得PEDV的分离较困难。自1971年首次在英国和比利时报道PED后，日本、韩国、加拿大、中国等多个国家相继报道了该病的发生，许多学者先后以PK-15细胞（猪肾细胞）、BHK细胞（仓鼠肾细胞）、牛睾丸细胞、猪睾丸细胞等体外分离培养PEDV，但多年尝试未成功。1988年瑞士Hoffman等首次在添加胰酶培养的Vero细胞上成功培养出PEDV，盲传5代出现细胞病变（Hoffman，M et al，1988）。日本和韩国也相继报道了PEDV在Vero细胞上盲传90代病变特征仍不显著，必须借助PCR检测的方法才能确定病毒的存在。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术中的上述问题，提供一株猪流行性腹泻病毒。

本发明的另一目的是提供上述猪流行性腹泻病毒株的培养方法。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

本发明公开了一株猪流行性腹泻病毒，名称为PEDV/CH/BJ/2014，于2014年12月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.10111。保藏地址：中国.北京.中国科学院微生物研究所。

上述猪流行性腹泻病毒，其编码病毒纤突蛋白S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；ORF3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；囊膜蛋白M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；核衣壳蛋白N基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。

上述猪流性腹泻病毒的培养方法为：

1）用细胞培养液（含10%FBS，1%青链霉素的DMEM）培养Vero细胞长至单层；

2）用无菌1×PBS洗涤细胞2次，加入适量无血清DMEM；

3）取PEDV病毒液接种于Vero细胞上，并在DMEM中添加胰酶至终浓度3~5μg/mL形成吸附液；

4）于37℃和5%浓度CO₂的条件下吸附1.5h，吸附完成后弃掉吸附液，加入含有浓度为5~10μg/mL胰蛋白酶的无血清DMEM作为维持液，于37℃，5%浓度CO₂的细胞培养箱中培养。

5）连续培养48~72h或细胞病变达80%后，收获细胞培养物置于-80℃冰箱，反复冻融3次，取适量细胞培养物进行接毒传代，重复步骤1)、2)、3)、4)。

与现有技术相比，本发明具备以下优势：

PEDV/CH/BJ/2014毒株与CV777毒株S基因同源性仅有94%，而S基因编码的蛋白是介导产生中和抗体的主要抗原，因此PEDV/CH/BJ/2014毒株的成功分离及其稳定传代对新疫苗的开发具有重要意义。本发明不仅仅是对我国PEDV毒种的补充，对PEDV的诊断、防控及深入研究都有重大价值。

附图说明

图1：病料的RT-PCR检测结果电泳照片，其中M：DL2000Marker；1-5：阳性病料；6：阴性病料；7：阳性对照；8：阴性对照。

图2：Vero细胞感染PEDV后的病变照片（20×倍数），其中2-1:正常细胞对照；2-2:病料传至第6代时，Vero细胞感染病毒36h后的病变照片，细胞融合成合胞体。

图3：RT-PCR检测不同代次的PEDV/CH/BJ/2014病毒培养物，1-6：第5、10、15、20、25、30代细胞培养上清，7：阴性对照。

图4：PEDV/CH/BJ/2014毒株感染Vero细胞的透射电镜照片，箭头指示为病毒颗粒。

图5：间接免疫荧光鉴定照片，其中5-1：阴性对照；5-2：PEDV/CH/BJ/2014感染Vero细胞的结果。

图6：PEDV/CH/BJ/2014分离株S基因系统进化分析结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和实施例对本发明做详细说明，但不是限制本发明。

实施例1 ：PEDV/CH/BJ/2014毒株的获得

1.病料的采集与处理

采集北京某猪场的疑似病毒性腹泻仔猪的粪便及肠组织6份，样品编号后，分别按质量体积比1:5加入生理盐水，肠组织进行匀浆，粪便样品振荡混匀，反复冻融3次，8000 rpm/min(转/分钟)离心10 min，取上清液，先用孔径0.48μm的滤器过滤，再用0.22μm的滤器过滤除菌，所得病料处理液分装并于-80℃冰箱储存备用。

2.病料的RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)检测

编号1-6的上述处理液各取250 μL，使用OMEGA公司生产的Total RNA Kit II试剂盒提取RNA。提取后的RNA进行反转录：6 μL的RNA与1μL Oligo(dT)混合均匀，70℃ 10 min，迅速冰浴2min。向该混合液中加入2 μL 5×Buffer，0.5 μL 10 mM的dNTP mix，0.25μL MLV反转录酶及0.25 μL RNase Inhibitor。混匀后按如下条件反应：42℃，60 min；70℃，15 min。

反转录后的cDNA用以下引物进行PCR，扩增N基因，上游引物NF：5’ CGGTTCTCACAGATAGTGAG 3’，SEQ ID NO：17；下游引物NR：5’ CGCTAGAAAAACACTCAGTAAT 3’，SEQ ID NO：18。 反应体系为：cDNA 1μL，2×Taq Mix 12.5μL，10 μM/mL的上下游引物各0.5μL，补加去离子水至25μL，混合均匀。同时设水阴性对照和CV777毒株阳性对照。PCR反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性30 s，56℃退火30s，72℃延伸2min，反应30个循环；72℃延伸10 min。

取5μL PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图1，可见编号1-5的病料样品均检测到阳性条带，编号6的样品未检测到阳性条带。选取可扩增到阳性条带的病料上清液作为分离病毒的样品备用。

3.猪流行性腹泻病毒的分离传代

选取RT-PCR检测阳性病料上清液进行病毒的分离培养。

于底面积25cm2的细胞培养瓶中培养Vero细胞（购自中检所），约培养48h长满单层，弃去培养液，用PBS洗涤细胞3次，每瓶加入500μL病料上清，于37℃、5% CO2的培养箱中吸附1.5h，期间每隔20 min轻摇一次。吸附完成后弃掉吸附液，加入5 mL含10 μg/mL胰蛋白酶的DMEM，置培养箱中继续培养，同时设置相同培养条件的阴性对照，逐日观察，72h为一个传代周期（前3代培养周期为7天）。传代前将上一代细胞培养物反复冻融3次，重复以上步骤进行传代。连续传至5代，将培养物按步骤2所述方法进行RT-PCR检测，结果为阳性的继续传代，若为阴性则丢弃。

经过反复传代筛选，最终在编号3的病料上清中分离到一株可稳定传代的毒株，命名为PEDV/CH/BJ/2014，该毒株在第2代即可观察到明显的细胞病变，在第5代就可使病变稳定存在，主要表现为细胞大量融合，呈合胞体状，见图2-2。待病变80%以上即可收获病毒于-80℃冰箱，冻融3次后8000 rpm/min离心10 min，取上清分装并置-80℃冰箱保存。

4.细胞培养物的RT-PCR检测

操作方法同步骤2中病料的RT-PCR检测方法，检测样品采用PEDV/CH/BJ/2014第5、10、15、20、25、30代的细胞培养物上清液，检测结果见图3，结果显示不同代次的病毒培养物均能检测到明亮的目的条带。

5.电镜鉴定

将病毒感染Vero细胞单层后，分别于24、36和48 h用细胞刮收取细胞，800 r/min离心后，收集细胞并用2.5%戊二醛电镜固定液固定，制作超薄切片并用醋酸铀和柠檬酸铅染色，电子显微镜观察病毒形态，见图4，结果显示感染PEDV的vero细胞中能检测到典型PEDV病毒粒子，表明病毒在vero细胞中稳定增殖。

6.间接免疫荧光检测

于24孔板培养Vero细胞，长至单层后接种PEDV/CH/BJ/2014 第6代病毒培养物，同时设立不接毒的Vero细胞作阴性对照，以及接种CV777毒株的阳性对照。培养24h后在显微镜下观察细胞病变情况，轻轻吸弃培养液，用4℃预冷的PBS洗涤细胞3次。每孔加入500μL -20℃预冷的丙酮，将培养板置4℃冰箱固定15min。PBS洗涤3次，每次5min。每孔加入500μL 5%的脱脂奶粉封闭30min。弃掉脱脂奶粉，用PBS轻轻洗涤2次，每次3min。向孔内滴加适当稀释后的一抗（鼠抗PEDV 6C8单克隆抗体（BioNote，Seoul，Korea））各200μL，于37℃作用1h。PBS洗涤3次，每次5min；滴加FITC（异硫氰酸荧光素）标记的山羊抗鼠IgG二抗（1：20000），37℃作用30min，PBS洗涤3次，每次5min。每孔加入500μLPBS，于倒置荧光显微镜下观察并拍照。实验过程中需设置只加一抗不加二抗和只加二抗不加一抗的阴性对照。结果显示，阴性对照孔均无荧光；阳性对照孔及接种PEDV/CH/BJ/2014的孔均在细胞浆中呈现绿色荧光；只加一抗和只加二抗的阴性对照孔没有绿色荧光背景。说明所分离到的病毒是猪流行性腹泻病毒，结果见图5，表明分离株PEDV/CH/BJ/2014具有良好的抗原性。

7.S、ORF3、M、N基因序列测定

取250 μL PEDV/CH/BJ/2014第6代Vero细胞培养物提取RNA，并进行反转录及PCR扩增(RNA提取和反转录体系及反应条件同上述步骤2)。反转录后的cDNA用下述引物进行PCR：分段扩增S基因，引物S1F 5’ TAGTGATGTTGTGTTAG 3’,见SEQ ID No:2；S1R 5’ CGCTGCACAGCAGCTC 3’, SEQ ID No:3；S2F 5’ CATACCAGAAGGTTTTAG 3’ ,见SEQ ID No:4； S2R 5’ GTAATCAACTCACCCTT 3’,见SEQ ID No:5； S3F 5’TTACCCTGAGTTTGGTAGTG 3’,见SEQ ID No:6； S3R 5’ TCCGTCTGTAGAGCAAGAT 3’,见SEQ ID No:7；S4F 5’CTTCACATGTATAGTGCGTCT 3’,见SEQ ID No:8； S4R 5’ CAGACTTTGAGACATCTTTGAC 3’,见SEQ ID No:9。扩增ORF3基因，引物ORF3F 5’CTAGACTTCAACCTTACGAA 3’,见SEQ ID No:11；ORF3R 5’TACTAGACCATTATCATTCACT 3’,见SEQ ID No:12。扩增M基因，引物 MF 5’ ACTGTTATTGACGTATAAACG 3’,见SEQ ID No:14；MR 5’ ATGAAGCACTTTCTCACTATC 3’,见SEQ ID No:15。扩增N基因，引物NF 5’ CGGTTCTCACAGATAGTGAGA 3’,见SEQ ID No:17；NR 5’ CGCTAGAAAAACACTCAGTAAT 3’,见SEQ ID No:18。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火40s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸7min。将PCR产物送诺塞基因公司进行测序。测序结果：S基因拼接后全长为4161bp，见SEQ ID No:1；ORF3基因全长675bp，见SEQ ID No:10；M基因661bp（非全长），见SEQ ID No:13 ；N基因全长1326bp，见SEQ ID No:16。

8.S基因进化分析

利用DNAStar软件对测序结果进行分析，结果表明，PEDV（PEDV/CH/BJ/2014）株与我国分离株 2011-BJ-1构成一新的分支，与美国报道株MEX/104/2013、USA/Colorado/2013及KUIDL-PED-2014-007同源性较高；与经典参考株如比利时CV777、韩国毒株DR13等相比，不在同一进化分支上，已经发生了明显的变异，表明我国当前新流行的PEDV野毒株发生了明显的变异，结果见图6。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京伟嘉人生物技术有限公司

<120> 一株猪流行性腹泻病毒及其分离培养方法

<130> 1

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4161

<212> DNA

<213> PEDV/CH/BJ/2014

<400> 1

atgaagtctt taacctactt ctggttgttc ttaccagtac tttcaacact tagcctacca 60

caagatgtca ccaggtgctc agctaacact aattttaggc ggttcttttc aaaatttaat 120

gttcaggcgc ctgcagttgt tgtactgggc ggttatctac ctattggtga aaaccagggt 180

gtcaattcaa cttggtactg tgctggccaa catccaactg ctagtggcgt tcatggtatc 240

tttgttagcc atattagagg tggtcatggc tttgagattg gcatttcgca agagcctttt 300

gaccctagtg gttaccagct ttatttacat aaggctacta acggtaacac taatgctact 360

gcgcgactgc gcatttgcca gtttcctagc attaaaacat tgggccccac tgctaataat 420

gatgttacaa caggtcgtaa ttgcctattt aacaaagcca tcccagctca tatgagtgaa 480

catagtgttg tcggcataac atgggataat gatcgtgtca ctgtcttttc tgacaagatc 540

tattattttt attttaaaaa tgattggtcc cgtgttgcga caaagtgtta caacagtgga 600

ggttgtgcta tgcaatatgt ttacgaaccc acctattaca tgcttaatgt tactagtgct 660

ggtgaggatg gtatttctta tcaaccctgt acagctaatt gcattggtta ttctgccaat 720

gtatttgcta ctgagcccaa tggccacata ccagaaggtt ttagttttaa taattggttt 780

cttttgtcca atgattccac tttggtgcat ggtaaggtgg tttccaacca accattgttg 840

gtcaattgtc ttttggccat tcctaagatt tatggactag gccaattttt ctcctttaat 900

caaacgatcg atggtgtttg taatggagct gctgtgcagc gtgcaccaga ggctctgagg 960

tttaatatta atgacacctc tgtcattctt gctgaaggct caattgtact tcatactgct 1020

ttaggaacaa atttttcttt tgtttgcagt aattcctcag atcctcactt agccaccttc 1080

gccatacctc tgggtgctat ccaagtaccc tattattgtt ttcttaaagt ggatacttac 1140

aactccactg tttataaatt cttgtctgtt ttacctccta ccgtcaggga aattgtcatc 1200

accaagtatg gtgatgttta tgtcaatggg tttggctact tgcatctcgg tttgttggat 1260

gctgtcacaa ttaatttcac tggtcatggc actgacgatg acgtttctgg tttttggacc 1320

atagcatcga ctaattttgt tgatgcactt atcgaagttc aaggaactgc cattcagcgt 1380

attctttatt gtgatgatcc tgttagccaa ctcaagtgtt ctcaggttgc ttttgacctt 1440

gacgatggtt tctaccctat ttcttctaga aaccttctga gtcatgaaca gccaatttct 1500

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tctttctgtg ttgacactag acaatttacc atttcactgt tttataacgt tacaaacagt 1680

tatggttatg tgtctaaatc acaggacagt aattgccctt tcaccttgca atctgttaat 1740

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tctttttcag agcaggctgc atatgttgat gatgatatag tgggtgttat ttctagtttg 2160

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ctacctggtg ttgttgacgc tgagaagctt cacatgtata gtgcgtctct catcggtggt 2880

atggtgctag gaggttttac ttctgcagcg gcattgcctt ttagctatgc tgttcaagct 2940

agactcaatt atcttgctct acagacggat gttctacagc ggaaccagca attgcttgct 3000

gagtctttta actctgctat tggtagtata acttcagcct ttgagagtgt taaagaggct 3060

attagtcaaa cttccaaggg tttgaacact gtggctcatg cgcttactaa ggttcaagag 3120

gttgttaact cgcagggtgc agctttgact caacttaccg tacagctgca acacaacttc 3180

caagccattt ctagttctat tgatgacatt tactctcgac tggacattct ttcagccgat 3240

gttcaggttg accgtctcat caccggcaga ttatcagcac ttaatgcttt tgttgctcaa 3300

accctcacta agtatactga ggttcgggct agcaggaagc tagcacagca aaaggttaat 3360

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actctacgtg agcctggctt agtcttgttt acgcatgaac ttcaaaatca tactgcgacg 3600

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gtaatcccag attacatcga tgttaacaaa acacttgatg agattttagc ttctctgccc 3780

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ggtgaaattg cagatttaga gcagcgttca gagtctctcc gtaatactac agaggagctc 3900

caaagtctta tatataatat caacaacaca ctagttgacc ttgaatggct caaccgagtt 3960

gagacatata tcaagtggcc gtggtgggtt tggttgatta ttttcattgt tctcatcttt 4020

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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ggacgtgttg gtcgttcagt caatgcttca tctggcactg gttgggcttt ctatgtccgg 600

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<212> DNA

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gaaggcgcaa agactgaacc cactaacctg ggtgtcagaa aggcgtctga aaagccaatc 360

attccaaatt tctctcaaca gcttcccagc gtagttgaga ttgttgaacc taacacacct 420

cctacttcac gtgcaaattc acgtagcagg agtcgtggta atggcaacaa caggtccaga 480

tctccaagta acaacagagg caataaccag tcccgcggta attcacagaa tcgtggaaat 540

aaccagggtc gtggagcttc tcagaacaga ggaggcaata ataataacaa taacaagtct 600

cgtaaccagt ccaagaacag aaaccagtca aatgaccgtg gtggtgtaac atcacgcgat 660

gatctggtgg ctgctgtcaa ggatgccctt aaatctttgg gtattggcga aaaccctgac 720

aagcttaagc aacagcagaa gcccaaacag gaaaggtctg acagcagcgg caaaaataca 780

cctaagaaga acaaatccag agccacttcg aaagaacgtg accttaaaga catcccagag 840

tggaggagaa ttcccaaggg cgaaaatagc gtagcagctt gcttcggacc caggggaggc 900

ttcaaaaatt ttggagatgc ggaatttgtc gaaaaaggtg ttgatgcctc aggctatgct 960

cagatcgcca gtttagcacc aaatgttgca gcattgctct ttggtggtaa tgtggctgtt 1020

cgtgagctag cggactctta cgagattaca tataattata aaatgactgt gccaaagtct 1080

gatccaaatg tagagcttct tgtttcacag gtggatgcat ttaaaactgg gaatgcaaaa 1140

ccccagagaa agaaggaaaa gaagaacaag cgtgaaacca cgcagcagct gaatgaagag 1200

gccatctacg atgatgtggg tgtgccatct gattcgactc atgccaattt ggaatgggac 1260

acagctgtag acggtggtga cacggccgtt gaaattatca acgagatctt cgacacagga 1320

aattaa 1326

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

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<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

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