一种Bcr-Abl双倍体抑制剂及其制备方法和用途技术领域本发明涉及一种Bcr-Abl双倍体抑制剂及其制备方法和用途。
背景技术：
慢性粒细胞白血病是染色体产生基因突变[t(9:22)(q34；q11)]相互易位，染色体9位的ABL基因和染色体22位的BCR基因相融合产生BCR-ABL，此融合的基因编码一种210kDa酪氨酸激酶Bcr-Abl，这种蛋白是导致慢性粒细胞白血病的主要原因。c-Abl在正常细胞中是存在于胞浆里的单倍体酪氨酸激酶，与Bcr融合后形态发生变化，由单倍体变成四聚体，由此该激酶始终处于被激活状态，导致肿瘤的发生。Bcr蛋白序列中存在可以引起多聚化的氨基酸序列导致Bcr-Abl四聚化。由于c-Abl在心肌等正常细胞中发挥重要的作用，如果开发选择性抑制致癌性Bcr-Abl而非Abl的抑制剂，则有望大大降低此类抑制剂的心脏毒性等广泛的副作用。2001年，FDA批准第一个酪氨酸激酶抑制剂(TKI)伊马替尼(Imatinib)1上市，用于慢性粒细胞白血病(CML)的治疗。作为第一代Bcr-Abl抑制剂，伊马替尼已成为治疗CML的一线药物。但大多数患者最终都对伊马替尼出现耐药。随后研究表明，IM耐药性的发生可能与G250E、Q252H、Y253F、Y253H、E255K、E355G、E255V、T315A、T315I、F317L、F317V、M351T、F359V、H396P、M244V等Abl激酶活性区的基因突变有关，基因突变导致伊马替尼与Abl激酶的亲和性下降。绝大多数基因突变使伊马替尼的亲和性下降5-30倍，这是产生耐药性的主要原因。其中T315I比较特殊，降低最为明显，IC50降至6400nM左右，最近开发的坡那替尼不仅对T315I有效，对野生型与绝大多数突变株均有效。从伊马替尼与Abl蛋白的激酶部分的x-Ray共晶结构上看，结构中的甲级哌嗪部分的氮甲基部分暴露在溶剂中，两个抑制剂该氮原子之间的直线距离为24安左右。Bcr-Abl由于是四聚体，可以同时与4个抑制剂相结合，如果通过链条将两个抑制剂连接起来，则有望大大提高对四聚化的Bcr-Abl的亲和性，从而起到选择性抑制Bcr-Abl的作用，而Abl由于是单倍体，只能与一个抑制剂相结合，双倍体抑制剂对酶的亲和性不会有大的影响。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种Bcr-Abl双倍体抑制剂及其制备方法和用途。本发明提供的式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐，其结构式如下所示：本发明中，Linker表示连接分子。进一步的，式Ⅰ中，Linker为(Z1)a–(Z2)b–(Z3)c；其中，Z1、Z2、Z3分别独立地选自C(O)(CH2)dNH、CO(CH2)eC(O)、(CH2CH2)fNHC(O)、(CH2CH2)g-C(O)NH、(CH2)hC(O)(OCH2CH2)iNHC(O)(CH2)jC(O)、NH(CH2)k(OCH2CH2)l-O(CH2)mNH、(CH2)nC(O)(OCH2CH2)ONH(C(O)(CH2)pNH)qC(O)-alkyl、C(O)NH(CH2)rNHC(O)-(CH2)sC(O)(NHCH2CH2)tNH(C(O)(CH2)uNH)v-C(O)-alkyl；a～v分别独立地选自1～20中任一数值。进一步的，其结构式为：本发明还提供了制备上述式I化合物或其药学上可接受的盐的方法。本发明制备上述式Ⅰ化合物的方法，它包括如下操作步骤：进一步的，它包括如下操作步骤：(1)制备化合物2：(2)制备化合物BGC，即为式Ⅰ化合物：进一步的，它包括如下操作步骤：i、制备化合物2：化合物1、三乙胺、4-(氯甲基)苯甲酰氯在二氯甲烷中，于室温下搅拌反应18h，得到反应液；对反应液进行分离、纯化，得到化合物2；ii、制备化合物6：①、制备化合物4化合物3、三乙胺、戊二酰氯在二氯甲烷中，于室温下搅拌反应6小时，得到反应液；对反应液进行分离、纯化，得到化合物4；②、制备化合物6化合物4、1-羟基苯并三唑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-甲基吗啉在二氯甲烷中，在冰浴条件下反应0.5小时后，加入化合物5，于室温下反应完全，得到反应液；对反应液进行分离、纯化，得到化合物6；iii、制备化合物BGC化合物2、化合物6、碳酸钾在N,N-二甲基甲酰胺中，于100℃搅拌反应18h，得到反应液；对反应液进行分离、纯化，得到化合物BGC。进一步的，步骤i中，所述化合物1、三乙胺、4-(氯甲基)苯甲酰氯的摩尔比为18：35.6：21.3；所述化合物1与二氯甲烷的摩尔体积比为18：400mmol/ml；步骤ii的①中，所述化合物3、三乙胺、戊二酰氯的摩尔比为45.4：68.1：22.7；所述化合物3与二氯甲烷的摩尔体积比为45.4：300mmol/ml；步骤ii的②中，所述化合物4、1-羟基苯并三唑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-甲基吗啉、化合物5的摩尔比为:1：1.2：1.2：3：2.1；所述化合物4与二氯甲烷的摩尔体积比为1：20mmol/ml；步骤iii中，所述化合物2、化合物6、碳酸钾的摩尔比为0.28：0.09：2.69；所述化合物2与N,N-二甲基甲酰胺的摩尔体积比为0.28：20mmol/ml。发明还提供了上述化合物及其药学上可接受的盐在制备治疗细胞增殖疾病的药物中的用途。上述化合物及其药学上可接受的盐在制备治疗细胞增殖疾病的药物中的用途。进一步的，所述药物是酪氨酸激酶抑制剂。进一步的，所述药物是ABL抑制剂类药物。进一步的，所述药物是BCR-ABL或其突变株抑制剂类药物。进一步的，所述BCR-ABL突变株为T315I突变株。进一步的，所述细胞增殖疾病是癌症。进一步的，所述癌症为慢性粒细胞白血病、肠间质瘤、妇科瘤、隆突性皮肤纤维肉瘤、Ph+ALL。本发明提供的式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐，作为Bcr-Abl双倍体抑制剂，能够有效抑制酪氨酸激酶活性，可有效用于该类激酶异常活化相关的疾病治疗，对恶性肿瘤具有良好的治疗作用，该类抑制剂的制备方法简便，成本低廉，具有良好的应用前景。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1、BGC对KBM5荷瘤鼠瘤体积的影响。具体实施方式本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。缩写的中文名称：HOBT：1-羟基苯并三唑；EDC：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；NMM：N-甲基吗啉；DMSO：二甲基亚砜。实施例1本发明化合物BGC的制备合成路线如下：(2)制备化合物BGC：具体合成步骤如下：a)制备化合物2将化合物1(5.0g,18.0mmol；生产厂家：上海旭刚生物科技有限公司)、三乙胺(3.6g,35.6mmol)溶解于二氯甲烷(400ml)中，将4-(氯甲基)苯甲酰氯(4.0g,21.3mmol)溶解于二氯甲烷(100ml)中，在0℃下，向反应液中滴加，加毕后自然升至室温搅拌反应18h，反应瓶中析出固体，将反应混合物过滤，收集到的固体用二氯甲烷、水洗涤，得到黄色固体化合物2(5.3g；收率68％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.23(s,1H),9.28(s,1H),8.97(s,1H),8.69(d,J＝4.4Hz,1H),8.52(m,2H),8.09(s,1H),7.97(d,J＝7.6Hz,2H),7.59-7.42(m,5H),7.22(d,J＝8.0Hz,1H),4.84(s,2H),2.23(s,3H).MS(ESI+)m/z:430[M+1]+。b)制备化合物4在室温下，将化合物3(10.0g,45.4mmol；生产厂家：Sigma-Aldrich.)溶解于二氯甲烷(250ml)中，加入三乙胺(6.9g，68.1mmol)，再将戊二酰氯(3.8g,22.7mmol)溶解于二氯甲烷(50ml)中，并缓慢地向反应液中滴加，加毕后在室温下搅拌反应6h，然后用水(200ml×2)洗涤反应液，有机相用硫酸钠干燥，真空浓缩蒸干溶剂。残余物用硅胶柱层析法纯化(二氯甲烷/甲醇＝20/1)得到化合物4。(4.3g；收率35.4％)。c)制备化合物6在冰浴下，将化合物4(2.7g,5.0mmol)溶解于二氯甲烷(100ml)中，加入HOBT(0.81g,6.0mmol)、EDC(0.59g,6.0mmol)、NMM(1.52g,15mmol)反应半小时，将化合物5(1.67g，10.5mmol，生产厂家：百灵威科技有限公司)分批加入到反应液中，加毕后，逐渐升至室温，反应过夜，反应液用饱和氯化钠水溶液(100ml×2)洗涤有机相，有机相用硫酸钠干燥，真空浓缩蒸干溶剂，残余物用硅胶柱层析法纯化得到化合物6(1.3g；收率31.8％)。1HNMR(400MHz,D2O)3.62(30H,m),3.53(14H,m),3.21(8H,q,J＝7,2Hz).2.77(4H,t,J＝6.8Hz).2.21(4H,t,J＝7.6Hz).1.82(2H,m)。d)制备化合物BGC将化合物6(72mg,0.09mmol)、化合物2(120mg,0.28mmol)、K2CO3(350mg,2.69mmol)、N,N-二甲基甲酰胺(20ml)加入到圆底烧瓶中，在100℃搅拌反应18h，待反应液冷却至室温后，将反应液倒入剧烈搅拌的冰水中，析出固体，过滤，收集固体，残余物通过制备高效液相纯化得到橙色固体BGC(18mg；收率12％)。1HNMR(400MHz,D2O):δ9.40(s,2H),9.12(d,J＝8Hz，2H,),8.87(d,J＝5.2Hz,2H),8.50(bs,2H),8.13(t,J＝6.8Hz,2H),7.95(d,J＝7.6Hz,4H),7.90(s,2H),7.65(d,J＝8Hz,4H),7.45(d,J＝5.2Hz,2H),7.36(d,J＝8Hz,2H),7.24(d,J＝7.6Hz,2H),4.43(s,4H),3.66-3.44(m,44H),3.28(t,J＝6.8Hz,4H),3.22(t,J＝6.8Hz,4H),2.78(t,J＝6.8Hz,4H),2.26(s,6H),2.22(t,J＝7.2Hz,4H),1.87-1.70(m,10H).MS(ESI+)m/z:1604[M+1]+。以下通过试验例具体说明本发明的有益效果。试验例1本发明化合物的药用活性1、酪氨酸激酶抑制作用参照：AmyCardetal.,JournalofBiomolecularScreening14(1)2009；JudeDunneetal.,Assay&DrugDevelopmentTechnologiesVol.2,No.2,2004。利用MobilityShiftAssay的方法，对体外激酶Abl进行本发明化合物BGC的筛选，化合物BGC浓度由100μM三倍稀释法用100％DMSO依次稀释至0.005μM，共10个浓度点，进行检测(2复孔)，采用化合物staurosporine作为标准对照，设溶媒对照(10％DMSO)和阴性对照(EDTA)。在384孔反应板上通过酶联免疫反应，检测各浓度的化合物BGC对激酶Abl的抑制情况，Caliper上读取转化率数据，并把转化率转化成抑制率。Percentinhibition＝(max-conversion)/(max-min)*100。其中max是指DMSO对照的转化率，min是指无酶活对照的转化率。根据每个浓度的抑制率计算化合物BGC对酪氨酸激酶Abl的半数抑制浓度IC50。抑制结果如下：化合物BGC的IC50：0.02μM；试验结果说明，本发明化合物BGC对c-Abl酪氨酸激酶具有较强的抑制活性。2、本发明化合物BGC对KBM5(Bcr-Abl阳性)肿瘤细胞体外增殖抑制试验用ATP法测定本发明BGC系列化合物的细胞毒性，将KBM5细胞调整合适的细胞密度，以每孔140ul细胞悬液接种96孔板，每种细胞的接种密度为：2000-6000个；上述细胞培养板培养箱中放置24小时使其完全附着在孔壁上，采用三倍稀释法将本发明化合物BGC分别配制成合适的不同浓度，加入到预先接种了细胞的96孔板相应的孔中，每孔10μL，使其最终浓度分别为：100μM、33.3μM、11.1μM、3.70μM、1.23μM、0.41μM、0.14μM、0.046μM、0.015μM。每个浓度分别设三个复孔，37℃培养箱中孵育72小时后，ATP法测定各孔细胞增殖情况，计算每个药物浓度对KBM5细胞增殖的半数致死浓度IC50。试验结果：化合物BGC对KBM5(人源野生型Bcr-Abl)肿瘤细胞的细胞毒性如下：化合物BGC的IC50：9μM；试验结果说明，本发明化合物BGC在体外细胞水平上具有较强的抑制活性。3、本发明化合物BGC的体内白血病皮下异种移植增殖抑制试验根据体外增殖抑制试验的结果，评估BGC在C57BL/6(Es-1c)裸鼠皮下移植人源白血病KBM5细胞的生长抑制效果。本发明化合物BGC的给药剂量分别为：80mg/Kg、160mg/Kg、350mg/Kg，同时设阳性对照组(160mg/Kg的伊马替尼Imatinib)和空白对照组(生理盐水)，荷瘤鼠分组后每日给药一次，连续给药两周后，检测肿瘤的体积。考察肿瘤生长是否可以被抑制、延缓或治愈。每周两次或隔天用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。数据分析：T检验用于两组间比较；三组或多组间比较用one-wayANOVA。如果F值有显著性差异，应在ANOVA分析之后再进行多重比较。two-wayANOVA用于分析联合给药组潜在的协同作用。用SPSS17.0进行所有数据分析；p<0.05认为有显著性差异。试验结果：本发明化合物BGC对KBM5细胞皮下移植肿瘤模型的体内药效学研究结果，见图1。在皮下瘤模型下，本发明化合物BGC具有抗肿瘤药效，在350mg/kg剂量下与伊马替尼160mg/kg的抑制效果相当。4、本发明化合物BGC的初步药代动力学研究雌性C57BL/6(Es-1c)裸鼠单剂量静脉受试本发明化合物BGC后，用液相色谱串联质谱法定量测定其在主要组织中的浓度及血药浓度，考察受试药物在雌性C57BL/6(Es-1c)裸鼠体内血液与主要组织中的分布差异；以伊马替尼作为对比。实验方法与过程如下：雌性C57BL/6(Es-1c)裸鼠，体重18-25g，6-8周龄，另外，3只雌性C57BL/6(Es-1c)裸鼠用于采集空白样品，配制分析所需的标准曲线。静脉注射给药剂量为1mg/kg，给药体积均为5mL/kg。静脉注射给药溶媒：DMSO:SolutolHS15:Saline＝5:5:90,v/v/v。建立LC-MS/MS方法，用内标法定量测定受试药物血药浓度及组织浓度，线性范围1～1000ng/mL，定量下限范围一般为1ng/mL。雌性C57BL/6(Es-1c)裸鼠经静脉注射给药后在0.25h，2h，8h和24h单次从小鼠尾静脉采集全血约20μL，用K2EDTA抗凝，按照体积比加入3倍的重蒸水得到稀释后的血样，保存于-70℃中直至分析。同时采集心，肝，脾，肺，肾，胃，小肠，胰腺等组织样品，用生理盐水洗净，滤纸吸干后称重并记录，然后保存于-70℃中直至分析。将称重过的脏器组织解冻后，心，肝，脾，肺，肾，胃，小肠，胰腺加入3倍PBS缓冲盐用Beadbeater匀浆；骨髓样品采集时采用0.3mL的PBS缓冲盐冲洗，然后12000转离心5分钟，移去0.25mL上清液，剩余的细胞样品加入150mL的PBS缓冲液匀浆。数据分析：采用WinNonlin(版本6.2)软件，按非房室模型计算药动学参数。实验结果表明，本发明化合物BGC的半衰期(t1/2)为3.5小时，远远大于伊马替尼的半衰期(t1/2为1.5h)；与伊马替尼相比，本发明化合物BGC在经过静脉注射后的药代动力学特性上具有非常明显的优势。综上所述，本发明提供的式Ⅰ化合物或其药学上可接受的盐，作为Bcr-Abl双倍体抑制剂，能够有效抑制酪氨酸激酶活性，可有效用于该类激酶异常活化相关的疾病治疗，对恶性肿瘤具有良好的治疗作用，该类抑制剂的制备方法简便，成本低廉，具有良好的应用前景。