含离子液体共溶剂介质中制备(R)‑3,5‑双三氟甲基苯乙醇的方法与流程

含离子液体共溶剂介质中制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的方法(一)技术领域本发明涉及一种基因工程菌及其应用，特别涉及一种重组大肠杆菌工程菌及其在含离子液体共溶剂体系中生物还原制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的方法。(二)

背景技术：
2003年美国FDA批准上市的第一个神经激肽-1(NK-1)受体阻滞剂药物，即阿瑞吡坦(Aprepitant，商品名：)。该药物通过与NK-1受体结合从而阻断P物质的作用来达到止吐的效果，广泛应用于治疗癌症病人化疗时产生的恶性呕吐的副作用。2008年在美国、瑞典、捷克、葡萄牙和英国等国上市了另一个止吐药物，即福沙吡坦(Fosaprepitant，商品名：)，该药物是阿瑞吡坦的前体药物，在体内能迅速转化成阿瑞吡坦从而发挥止吐效果。(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇是合成阿瑞吡坦和福沙吡坦等化疗止吐药物的关键手性模块。离子液体是一类具有不易挥发，不易燃和高稳定性等独特性能，可作为纯溶剂，辅助溶剂，或与其他溶剂一起构成两相体系广泛应用于生物催化、有机合成、化学分离等反应过程。离子液体可通过匹配特定需求的阳离子或阴离子改变其性质，从而有利于提高生物催化剂的催化效率。近年来，有关含离子液体介质中的生物催化过程研究使得生物催化剂的催化活性、立体选择性和稳定性相应的得到提高。离子液体介质中重组工程菌生物还原3,5-双三氟甲基苯乙酮(BTAP)制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇((R)-BTPE)的反应过程如图1所示。本申请人的在先申请中国专利2013101896727(公开号CN103421823A)提供了一种以重组工程菌或其表达的短链脱氢酶为生物催化剂，对一些潜手性酮不对称还原获得相应手性醇的方法。该方法在水相体系中进行，且只有在较低的底物浓度下(50mM)，产率才能达到90％以上，当底物浓度大于200mM时，由于底物3,5-双三氟甲基苯乙酮在水相中的低溶解性引起的传质问题，以及底物对细胞的潜在毒性限制了反应的底物浓度的进一步提高，造成产率偏低。本申请采用含离子液体介质体系进行重组工程菌催化不对称还原反应，由于离子液体对底物具有增溶作用，可有效解决非天然底物水难溶性问题；且离子液体的加入可改变作为催化剂的全细胞的细胞膜通透性，减少底物和产物的抑制作用；从而提高了还原反应的效率。(三)

技术实现要素：
本发明目的是提供一种在含离子液体共溶剂的反应体系中有效提高重组基因工程菌在高底物浓度(200～1500mM)条件下不对称还原3,5-双三氟甲基苯乙酮制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的产率的新方法。本发明采用的技术方案是：本发明提供一种在含离子液体共溶剂体系中制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的方法，所述方法为：以3,5-双三氟甲基苯乙酮为底物，以重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以式(Ⅰ)所示离子液体和pH6.0～8.0(优选pH7.0)磷酸盐缓冲液为反应介质构成反应体系，于20～45℃、200rpm条件下进行生物催化不对称还原反应，反应完全后，反应液经分离纯化得到(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇；所述重组基因工程菌是由来源于雷弗松氏菌(Leifsoniaxyli)HS0904短链脱氢酶突变体基因构建的重组表达载体转化宿主菌获得的，所述短链脱氢酶突变体基因的核苷酸序列为SEQIDNO.3所示；所述底物的初始浓度为200mM～1500mM(优选1200mM)，所述湿菌体的用量以反应体系总体积计为20～200g/L(优选50g/L)，所述离子液体的质量用量以反应体系总体积计为10～50g/L(优选35g/L)，所述异丙醇的体积终浓度为10～50％(优选20％)；[NR1,R2,R3,R4]L(Ⅰ)式(Ⅰ)中阳离子为取代季铵盐，阴离子为天然氨基酸、四氟硼酸盐、六氟磷酸盐、双(三氟甲烷磺酰)亚胺盐，其中取代季铵盐的取代基R1、R2、R3和R4各自独立为C1～C4的烷基。本发明所述离子液体的制备方法参照在先申请(申请号201310754767，公开号CN103695480A)，优选所述离子液体为下列之一：四甲基铵半胱氨酸([N1,1,1,1][Cys])、四乙基铵半胱氨酸([N2,2,2,2][Cys])、四甲基铵谷氨酸([N1,1,1,1][Glu])、四乙基铵谷氨酸([N2,2,2,2][Glu])、四甲基铵六氟磷酸([N1,1,1,1][PF6])、四乙基铵六氟磷酸([N2,2,2,2][PF6])、四丙基铵六氟磷酸([N3,3,3,3][PF6])、四丁基铵六氟磷酸([N4,4,4,4][PF6])、四甲基铵四氟硼酸([N1,1,1,1][BF4])、四乙基铵四氟硼酸([N2,2,2,2][BF4])、四丙基铵四氟硼酸([N3,3,3,3][BF4])、四丁基铵四氟硼酸([N4,4,4,4][BF4])、四甲基铵双(三氟甲烷磺酰)亚胺盐([N1,1,1,1][Tf2N])、四乙基铵双(三氟甲烷磺酰)亚胺盐([N2,2,2,2][Tf2N])、四丙基铵双(三氟甲烷磺酰)亚胺盐([N3,3,3,3][Tf2N])、四丁基铵双(三氟甲烷磺酰)亚胺盐([N4,4,4,4][Tf2N])。进一步，所述底物的优选浓度为1200mM。进一步，所述离子液体为四甲基铵半胱氨酸，四乙基铵半胱氨酸，四甲基铵谷氨酸或四乙基铵谷氨酸。进一步，所述分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液用等体积的乙酸乙酯萃取，离心收集乙酸乙酯层，将乙酸乙酯层减压浓缩至无液体流出，获得浓缩液，将浓缩液进行硅胶柱层析，以体积比8:1的石油醚和乙酸乙酯混合液为洗脱剂进行洗脱，TLC跟踪，收集Rf值为0.3～0.6的洗脱液，减压浓缩至干，即得产物。本发明中所述的产物产率和产物ee值测定采用气相色谱法。气相色谱的检测条件为：日本岛津GC-2014气相色谱仪，N2000色谱工作站，美国Chirasil-DexCB毛细管柱。载气为氮气；流速为2mL/min；进样量：1μL；分流比为15:1；检测器为氢火焰离子检测器；进样口温度和检测器温度为250℃；柱温为程序升温：80℃保留2min，然后以8℃/min升温至150℃，保留5min。产率计算方法为：内标法：以十二烷为内标物，测得产物浓度标准曲线。测定时在样品中加入一定量的十二烷为内标物，根据内标物浓度计算得出产物浓度。产物的产率由下述公式计算获得：式中C0、C产物分别为反应起始时底物的摩尔浓度和反应结束时产物的摩尔浓度。产物的光学纯度由对映体过量值(enantiomericexcess,ee)来表征。计算公式为：式中CR和CS分别为R型和S型3,5-双三氟甲基苯乙醇的摩尔浓度。本发明所述重组基因工程菌是将来源于雷弗松氏菌(Leifsoniaxyli)HS0904的短链脱氢酶基因(记为LXCAR，核苷酸序列为SEQIDNO.1所示，编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示)进行突变，通过将SEQIDNO.2所示氨基酸序列154位的丝氨酸突变为酪氨酸，获得短链脱氢酶突变体(核苷酸序列为SEQIDNO.3所示，编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.4所示)，继而以短链脱氢酶突变体基因构建的重组表达载体转化宿主菌而获得的，优选重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)-LXCAR。雷弗松氏菌(Leifsoniaxyli)HS0904短链脱氢酶基因工程菌的构建及表达已在先前...