用于显微镜系统的图像检测方法和相应的显微镜系统的利记博彩app
【技术领域】
[0001]本发明涉及利用显微镜系统检测图像的方法以及显微镜系统，该显微镜系统具有用于在不同的数值孔径情况下提供显微图像的机构。
【背景技术】
[0002]已知的显微镜例如带有光学变焦镜头的立体显微镜通常设有一些机构，用来物理地限定光束，进而用于调节孔眼直径或数值孔径。为此例如可以在透镜和透镜支架上设置固定不变的或可变的孔径光圈(例如虹膜光圈或LCD光圈)和/或合适的光线限制器。
[0003]本发明既涉及可借助合适的孔径光圈可变地调节一个或多个光学通道的数值孔径的显微镜，又涉及具有两个或多个分别带有固定不变的孔径光圈的分开的光学通道的显微镜。在这两种情况下都涉及到具有用来在数值孔径不同的情况下提供显微图像的机构的显微镜系统。
[0004]数值孔径决定了光学图像的三个主要的特征参数，即分辨率、亮度和清晰深度。
[0005]在物镜焦面上的显微镜的最大的分辨能力受限于光衍射，光衍射又决定于成像系统的数值孔径。用每毫米线对(LP/mm)来表示的最大分辨能力R与数值孔径nA成比例。简单地，R = 3000XnA。因此，高分辨率要求大的数值孔径。
[0006]但同时，在观察非全平的样本时，清晰深度即处于焦面之外的样本区的清晰度也很重要。由于几何形状，随着数值孔径的增大，清晰度减小，并与数值孔径相互影响。对于视觉观察来说，清晰深度D0F用Berek经验公式来描述。根据该公式，D0F = λ/(2XnA2)+0.34/(MtotXnA)，其中，λ表示光的波长，Mtot表示总的可视放大率。波长λ和清晰深度D0F例如用mm来表示。据此，利用减小的数值孔径可实现在焦面以上或以下的图像区域内的高清晰度。
[0007]检测的光锥决定了亮度I。简单地，I = cXnA2，其中，c是常数。因此也利用大的数值孔径来实现高的图像亮度。然而，特别是在数字图像检测情况下，除了通过数值孔径夕卜，还可以通过照明时间、电的放大因数(增益)、滤光器或数字后处理来灵活地设定和调整图像亮度。这些调整对于本领域技术人员来说是已知的，因而不予详述。
[0008]但至少在分辨率和清晰深度方面，常规的显微镜存在目标冲突。
[0009]由DE 10 2006 036 300 B4 和 DE 10 2006 036 768 B4 已知伸缩型或格里诺(Greenough)型的立体显微镜，哪个图像对的单图像具有不同的好的清晰度(下面称为“非对称的”立体显微镜)，则其将图像对显示给观察者。单图像之一具有较大的数值孔径，因此在焦面上具有较高的分辨率，而具有较小数值孔径的另一单图像提供了更好的清晰深度。这些图像通过观察者的双眼被同时接收。通过大脑，这些图像对组合起来，从而观察者由这两个图像总是感觉到分辨率有所改善的细节。由此利用了在人的大脑中图像合并时的生理现象。
[0010]数字的图像摄取装置没有执行这种图像合并，而仅仅是利用固定孔径来摄取图像。确切地说，所述图像摄取装置通常基于光线几何形状和由此确定的分辨率及清晰深度精确地检测图像。因此，这种数字图像摄取装置摄像的清晰区域，即相应的样本清晰地成像时所在的区域，明显更有限。相比于利用立体显微镜得到的视觉立体图像感，这令人并不满意。由于人眼能适应至多±5屈光度的特性，在数字的图像摄取时相比于视觉观察还存在复制的缺点。
[0011]传统广角显微镜(无立体光路)的现有技术通过所谓的Z-堆栈来解决该问题，其中，显微镜的焦点位置在摄取图像序列期间逐步地移动。但这要么要求带有样本的载物台移动，要么要求显微镜相对于样本移动。在任何情况下都必须移动相当大的质量(在z传动机构或试验台上的显微镜)，这在设备方面以及时间方面使得流程繁琐。时间代价也妨碍了转变为在线图像，特别是在使用者沿X、y和Z方向移动时以及在观察存活细胞时这是不利的。
[0012]另外，在(通常)非远心的摄像条件下，在焦点位置改变时，样本的成像比例发生变化。通过z堆栈摄取的图像因此由于成像比例的变化而未精确地叠加，且必须通过相互间的关联或延展或压缩来予以调整。该过程牵涉到组合的图像的不确定性和出错性。
[0013]特别是针对数字显微术的目前要予以考察的明显趋势，本发明的目的是，克服所述缺点，且实现改善的图像检测。
【发明内容】
[0014]在这种背景下，本发明提出具有独立权利要求的特征的一种利用显微镜系统提供数字结果图像的方法以及一种显微镜系统，该显微镜系统具有用于在数值孔径不同的情况下提供显微图像的机构以及数字的图像检测单元。优选的设计分别是从属权利要求以及后续说明的主题。
[0015]发明的优点
[0016]本发明涉及摄取和组合具有不同分辨率和清晰深度的显微图像，这些图像可以在数值孔径不同的情况下被提供。本发明既能实现识别出微小的结构，又能以尽可能高的品质和低的成本描绘样本。
[0017]总之，本发明提出了一种利用显微镜系统提供数字结果图像的方法，其中，该显微镜系统具有用于在数值孔径不同的情况下提供显微图像的机构以及数字的图像检测单元。该方法包括:利用数字的图像检测单元在数值孔径不同的情况下以数字单图像的形式检测至少两个显微图像，并对这些数字单图像的彼此相应的图像区域在其图像清晰度方面相互比较。具有最高图像清晰度的图像区域都组成数字的结果图像。由于根据本发明产生了大量图像区域，相比于从中选出这些图像区域的每个数字单图像，该结果图像具有比较高的图像清晰度。因而，该结果图像相比于数字单图像也具有较高的总体清晰度，并有利地把数字单图像的最清晰的区域组合起来。
[0018]如已述，“用于在数值孔径不同的情况下提供显微图像的机构”例如可以是一个或多个光学通道，例如是立体显微镜的立体通道，在这些通道中分别借助合适的孔径光圈可变地调节数值孔径。有些显微镜具有两个或多个分开的光学通道，这些通道各带有固定不变的孔径光圈，或者没有孔径光圈，但有不同的数值孔径，据此，这些显微镜具有用于在数值孔径不同的情况下提供显微图像的机构。
[0019]与已知的方法相反，借助本发明能产生改善的结果图像，其信息含量明显超过任何纯粹的(单图像)序列，却能以减小的成本获得。与现有技术的前述方法相反，当在此总是设有至少一个可调节的孔径光圈时，本发明尤其也适合应用在“单通道”显微镜中，或者用于通过立体显微镜的仅仅一个通道来检测图像。因此，采用本发明能以相对小的设备成本产生高质量的结果图像。
[0020]特别是相比于由显微术已知的且在开篇所述的z-堆栈，在本发明的范围内不必移动相当大的质量。在最不利的情况下，本发明充其量规定，在不同数字单图像的摄取之间移调孔径光圈。如果可以进行双通道的摄取一数值孔径在各个通道中各不相同，那么也不需要这样，从而在这种情况下根本就不必移动显微镜的部件。
[0021]“至少两个显微图像”利用可调节的孔径光圈来获得，且借助数字的图像检测单元以相应的数字单图像的形式予以检测，这些显微图像也可以称为“光圈系列”。“至少两个”数字单图像的有益数量视各个所调节的显微镜参数、例如所采用的放大率而定，其也限定了清晰深度。例如可以摄取2个、4个、6个、8个、10个、15个或20个单图像。决定要摄取的数字单图像的数量的另一个参数在此是可调节的光圈开口的数量，即相应的孔径光圈的调节装置的位置数量和由此可引起的光圈开口。
[0022]因而根据本发明规定，数字地摄取在数值孔径不同的情况下提供的至少两个单图像，并组合成一个数字的结果图像。数字的图像摄取例如利用摄像机的CCD芯片或者利用行扫描传感器(line sensor)来进行。本发明例如也可以包括:在一个光圈位置多次地摄取数字的单图像，或者在一个通道中利用固定的数值孔径多次地摄取数字的单图像。由此例如可以实现改善分辨率，因为所用的图像传感器的噪音效应减小了。然而，在数值孔径不同的情况下提供至少两个单图像，从而可以兼有数值孔径大时分辨率高的优点及数值孔径小时清晰深度大的优点，如下面参照附图3详述。
[0023]本发明相比于由摄影术已知的HDR方法(High Dynamic Range (高动态范围))尤其也提供了优点，按照HDR方法，多个摄像组合成了一个具有提高的亮度和对比度的“超级图像”。但HDR方法只涉及局部的图像曝光，并不涉及图像清晰度。同样，HDR方法也可以在本发明的范围内应用，由此能够得到附加的图像信息。
[0024]在摄影术中，通过选择光圈，将清晰深度仅用作成像机构。而显微学中的光学比例却在根本上不同于摄影，因为摄影中的清晰度并不受限于衍射。因此，在摄影术中，关闭光圈并不意味着焦面上的分辨率减小，而这在显微学中却能观察到。确切地说，在摄影中，当焦面上的分辨率在一定程度上保持恒定时，能实现清晰深度的增大。因此在摄影术中并无分辨率减小的问题。所以，在摄影术中，为了实现最大分辨率和清晰深度，只需要相应宽地关闭光圈。摄影术和显微学光路以及图像摄取和处理方式在根本上是不同的，它们的物理原理、限度和要求各不相同。
[0025]如所述，显微镜的结果图像的产生包括:用来组合成结果图像的不同的图像区域是基于对其图像清晰度的比较来选取的。为此例如可以分别采用局部的对比度值或其它能表示图像清晰度的值。所述值例如也可以是数值的特征参数(分数)，它表示在一个数字单图像的图像区域内的图像对比度或图像清晰度。由于在数字的单图像之间进行比较，所以该特征参数也可以称为百